SBHL對HeLa細胞生長抑制作用的影響.doc

SBHL對HeLa細胞生長抑制作用的影響【關(guān)鍵詞】端粒酶【Abstract】AIM:ToobservetheinhibitingeffectsofSBHLonthegrowthofHeLacellsandtoinvestigatetheinhibitingmechanisms.METHODS:TheproliferationofHeLacellswasobservedbyMTTassayandthechangesofthecellcycleofHeLacellstreatedwithSBHLwereanalyzedbyflowcytometry.TheexpressionsofhTRTgeneweredetectedbyimmunohistochemistrytechniquesandthedifferentiationofHeLacellswasobservedbyWrightGiemsastaining.RESULTS:TheproliferationofHeLacellswasinhibitedat0.1-20.0mg/LSBHL.TheinhibitingeffectincreasedgraduallyfollowingtheincreaseofconcentrationofSBHL.ThepercentageofHeLacellsinSphasedecreasedandthepercentageofcellsinG1phaseincreasedafterthecellsweretreatedbySBHL,indicatingthatSBHLarrestedHeLacellsinG1phaseandthusthesynthesisofDNAwasinhibited.AftertreatmentbySBHL,theexpressionsofhTRTgeneofHeLacellsdecreasedobviously.DifferentiatedHeLacellswwerefoundaftertreatmentbySBHL.CONCLUSION:ThegrowthofHeLacellsisinhibitedobviouslybySBHLandtheinhibitingeffectisdependentontheconcentrationofSBHL.TheexpressionsofhTRTgenearedownregulated,thetelomeraseactivityisinhibitedandthegrowthofHeLacellisinhibited.【Keywords】SBHL；HeLacell；telomerase；flowcytometry；cellcycle；celldifferentiation【摘要】目的：觀察SBHL對HeLa細胞生長的抑制作用，并探討其作用機制.方法：用MTT比色法觀察不同濃度SBHL對HeLa細胞增殖的影響；用流式細胞術(shù)對細胞周期進行分析；用免疫組化方法觀察SBHL對HeLa細胞人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)基因表達的影響.用瑞氏姬姆薩染色法觀察SBHL對HeLa細胞形態(tài)的影響.結(jié)果：0.120.0mg/LSBHL對HeLa細胞增殖有明顯的抑制作用，這種抑制作用隨SBHL濃度的增加而增加；流式細胞術(shù)對細胞周期進行分析的結(jié)果顯示，隨著SBHL濃度的增加，S期細胞含量逐漸降低，G1期細胞含量逐漸增加，SBHL將細胞阻滯于G1期，抑制DNA合成.SBHL處理的HeLa細胞與對照組相比，hTRT基因的表達明顯降低；瑞氏姬姆薩染色結(jié)果表明SBHL可使HeLa細胞向良性分化.結(jié)論：SBHL明顯抑制HeLa細胞生長呈濃度依賴性.SBHL下調(diào)HeLa細胞hTRT基因的表達，抑制端粒酶活性.【關(guān)鍵詞】SBHL；HeLa細胞；端粒酶；流式細胞術(shù)；細胞周期；細胞分化0引言龍葵為茄科茄屬植物，全草入藥.龍葵具有清熱解毒、化痰止咳等作用.藥理實驗表明有抗菌、消炎、抗腫瘤等作用1.SBHL是從龍葵濃縮果汁中提取出的一種游離的生物堿鹽酸鹽，在此鹽分子上增加活性基團，保持其原有生物學(xué)活性基礎(chǔ)上，使其產(chǎn)生新的高效活性.Putalun等2對龍葵的成分、分離方法、抗凝血及抗腫瘤作用進行了研究.龍葵總生物堿或其中成分有抑制腫瘤作用，而由龍葵總生物堿轉(zhuǎn)化而成的有效成分SBHL，其抗腫瘤活性及抗腫瘤作用機制無報道.我們觀察了不同濃度SBHL對HeLa細胞生長的抑制作用，并探討了SBHL對HeLa細胞生長抑制作用的機制.1材料和方法1.1材料HeLa細胞由長春腫瘤研究所提供；SBHL由北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉良教授提供，用二蒸水配置成貯液.用RPMI1640培養(yǎng)液配制成終濃度為0.01,0.1,1.0,10.0和20.0mg/L.RPMI1640,胰蛋白酶和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；MTT,PI和DMSO均為Sigma公司產(chǎn)品.DAB顯色試劑盒和通用型SP試劑盒和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)檢測試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司.1.2方法用胰酶消化處于對數(shù)生長期細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，以不同濃度梯度SBHL作用于HeLa細胞，每個濃度3個孔，同時設(shè)不加SBHL對照孔，培養(yǎng)液空白孔，對照孔各3孔.培養(yǎng)5d，每日取1板，加入MTT(1g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，移去上清并用吸水紙吸干培養(yǎng)液，再加入DMSO，振蕩至結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測定A490nm.將處于對數(shù)生長期的HeLa細胞加入25mL培養(yǎng)瓶中，當(dāng)80%90%細胞匯合時，加SBHL作用72h，用胰酶消化收集細胞，PBS洗2次，4固定24h后，加入RNase，37水浴消化1h，再加入PI，避光4染色30min200目網(wǎng)篩濾過，上流式細胞儀檢測HeLa細胞周期變化.將1.0mg/LSBHL加入對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)72h,消化成單個細胞，將其涂在玻片上，加丙酮固定.按試劑盒說明進行操作.用SP免疫組化法分別檢測HeLa細胞hTRT基因的表達，圖片置于攝像顯微鏡下，選取觀察部位.隨機選取35個視野，在圖像分析儀下測定灰度值，灰度值用Y=0.299R+0.587G+0.114B計算.收集對數(shù)生長期細胞，用胰酶消化，制成細胞懸液，加SBHL終濃度為1mg/L，培養(yǎng)72h后取出蓋片，乙醇固定.加瑞氏姬姆薩染色，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài).統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS10.0軟件處理，兩樣本均數(shù)的t檢驗.2結(jié)果2.1MTT比色法0.01mg/LSBHL對HeLa細胞生長抑制作用與對照組相似(P>；0.05)，0.120.0mg/LSBHL處理的HeLa細胞組與對照組相比均有顯著性差異（P<；0.05）,說明0.120.0mg/LSBHL對HeLa細胞的增殖具有明顯抑制作用，而且隨著SBHL濃度的增加，抑制作用增強(Tab1,Fig1).表1SBHL對HeLa細胞的生長抑制作用（略）2.2流式細胞術(shù)經(jīng)SBHL作用后HeLa細胞G1期增加，S期減少，說明SBHL可以將細胞阻滯于G1期，抑制DNA合成(Tab2).表2SBHL對HeLa細胞周期的影響（略）2.3hTRT基因表達未經(jīng)SBHL處理的HeLa細胞核染成棕黃色陽性(Fig2A).10.020.0mg/LSBHL處理的HeLa細胞72h后，細胞核被染成棕黃色的HeLa細胞明顯減少，大部分細胞核染成藍色，呈陰性(Fig2B)，表明hTRT基因表達受到明顯抑制.2.4HeLa細胞形態(tài)經(jīng)瑞氏姬姆薩染色，光鏡觀察可見未經(jīng)SBHL處理的HeLa細胞排列密集，細胞呈圓形，大小不一，瘤巨細胞多見；細胞核質(zhì)比例大，核大、核仁多；而SBHL處理組細胞隨藥物濃度增大細胞排列稀疏，呈長梭形或多邊形，胞質(zhì)伸出長的不規(guī)則突起，相互聯(lián)接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細胞大小趨向一致，瘤巨細胞少見；細胞核、質(zhì)比例增大，核小，且核仁減少，染色變淺(Fig3A,B).3討論SBHL是從龍葵中提取出的龍葵總生物堿，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后的主要活性成分，其抑制腫瘤作用研究尚未見報道.我們觀察到0.120.0mg/LSBHL對HeLa細胞具有明顯的抑制作用.對HeLa細胞周期有明顯的影響，G1期細胞增加，S期細胞減少，說明SBHL可以將細胞阻滯于G1期，抑制DNA合成.SBHL可誘導(dǎo)HeLa細胞形態(tài)趨向良性分化，部分恢復(fù)正常細胞形態(tài)，細胞排列稀疏，呈長梭形或多邊形，胞質(zhì)伸出長的不規(guī)則突起，相互聯(lián)接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細胞大小趨向一致，瘤巨細胞少見；核小，且核仁減少，染色變淺.細胞功能的體現(xiàn)也是腫瘤細胞分化的標(biāo)志.從功能方面來看，細胞增殖、細胞分裂和集落形成均顯示HeLa細胞生長明顯受抑制.同時，流式細胞術(shù)分析DNA周期也發(fā)現(xiàn)細胞被阻止于G1期，S期細胞百分率下降.端粒酶是一種依賴RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠延長染色體末端的端粒長度.正是端粒酶的活化通過對端粒長度的維持使細胞得以永生化，而永生化也正是細胞惡變的必經(jīng)步驟3.端粒酶在正常人體細胞中并不表達，在多種腫瘤中均可檢出端粒酶活性4,5.端粒酶催化亞單位即hTRT是細胞永生化及惡性腫瘤發(fā)生過程中的端粒酶活化的主要限速步驟，hTRT基因表達可以反映端粒酶活性，與端粒酶活性具有平行關(guān)系.我們發(fā)現(xiàn)未用SBHL處理的HeLa細胞hTRT基因高度表達，用SBHL處理后的HeLa細胞hTRT基因表達明顯降低.因此，SBHL可能通過下調(diào)hTRT基因表達，抑制端粒酶活性，使細胞分裂中端粒逐漸縮短，最終使細胞死亡.總之，SBHL主要通過下調(diào)hTRT基因的表達，抑制HeLa細胞的生長.【參考文獻】1謝啟梅，謝軍榮.龍葵在腫瘤治療中的應(yīng)用J.江西中醫(yī)藥，1996；27(2):52-53.XieQM,XieJR.TheuseofsolamarginetreatedontumorsJ.JiangxiChinDrug,1996；27(2):52-53.2PutalunW,TanakaH.SurveyofsolasodinetyReglycoalkaloidsbywesternblottingandELISAusingantisolamarginemonoclonalantibodyJ.BiolPharmBull,2000；23（1）：72-75.3HuschtschaLI，BartierWA，AnderssonCE,etal.CharacteristicsofcancercelldeathafterexposuretocytotoxicdrugsinvitroJ.BrJCancer,1996；73:54-60.4MandalM,MaggrrarSB,SharmaN,etal.Bcl2preventCD95(Fas/APOI)induceddegradatro