shRNA抑制COX2基因表達對肝癌細胞HepG2生長的影響.doc

shRNA抑制COX2基因表達對肝癌細胞HepG2生長的影響作者：楊義明劉預涂植光陳亞芹劉靳波【摘要】目的：應用RNA干擾技術抑制COX2基因，觀察其對肝癌細胞HepG2生長的影響.方法：構建靶向抑制COX2基因表達的短發(fā)夾雙鏈RNA(shRNA)真核表達載pshRNACOX2，轉染肝癌細胞HepG2，用RTPCR和WesternBlot分別從mRNA和蛋白水平檢測其對COX2的抑制效應，MTT法檢測對HepG2細胞生長的影響.結果：與未轉染組相比，pshRNACOX2重組表達質粒抑制了HepG2細胞COX2mRNA及蛋白表達，抑制率分別為69.9和50.3；并可抑制HepG2細胞生長，72h后有統(tǒng)計學差異(P<；0.05).結論：pshRNACOX2重組表達載體能顯著抑制肝癌細胞COX2基因表達，從而抑制腫瘤細胞增殖.【關鍵詞】RNA干擾；重組表達載體；環(huán)氧化酶2；肝腫瘤【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofinhibitionofcyclooxygenase2（COX2）withRNAinterference(RNAi)onthegrowthofhepatocellularcarcinomaHepG2cells.METHODS:TheeukaryoticexpressionplasmidofshorthairpinRNA(shRNA)targetingCOX2gene(pshRNACOX2)wasconstructedandtransfectedintohepatocellularcarcinomaHepG2cells；theexpressionsofCOX2mRNAandproteinweredetectedwithreversetranscriptionalpolymerasechainreaction(RTPCR)andWesternBlotassay,respectively.ThegrowthofHepG2cellswasdetectedbyMTT.RESULTS:Comparedwithuntransfectedgroup,recombinantexpressionvectorpshRNACOX2resultedinthereductionofCOX2mRNAandproteinby69.9%and50.3%respectively,andthegrowthofHepG2cellswassignificantlyinhibitedafter72h(P<；0.05).CONCLUSION:RecombinantexpressionvectorpshRNACOX2cansignificantlyinhibittheexpressionofCOX2gene,andsuppressthegrowthoftumorcells.【Keywords】RNAinterference；recombinantexpressionvcectors；cyclooxygenase2；liverneoplasms0引言環(huán)氧化酶（cyclooxygenase,COX）是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶，包括COX1和COX2兩種同工異構體.近年來研究表明，許多腫瘤，如結腸癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌等COX2呈高表達狀態(tài)，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移中起重要的作用1-6.研究表明選擇性COX2抑制劑可以抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞調亡，而成為腫瘤基因治療的靶點.我們采用RNA干擾(RNAi)技術抑制COX2基因表達，觀察對肝癌細胞生長的影響，為利用RNA干擾技術作為腫瘤基因治療途徑提供實驗依據.1材料和方法1.1材料真核表達質粒pGenesil1購于武漢晶賽公司，含有人鼠人共用U6啟動子和編碼綠色熒光蛋白的報告基因.COX2靶基因序列：AACATGGAATTACCCAGTTTG.shRNA轉錄DNA模板：正向鏈為5GATCCCATGGAATTACCCAGTTTGTTCAAGAGACAAACTGGGTAATTCCATGTTTTTGTCGAA3,反向鏈為5AGCTTGTCGACAAAAACATGGAATTACCCAGTTTGTCTCTTGAACAAACTGGGTAATTCCATGG3，以上片段由上海生工公司合成.經Blast與現有人類基因無同源性的序列：5GACTTCATAAGGCGCATGC3作為陰性對照，稱為HK（武漢晶賽合成）.肝癌細胞株HepG2,大腸桿菌JM109由本實驗室保存.RPMI1640（Hyclone），新生小牛血清（杭州四季青公司產品），陽離子脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen)，Hind,BamH,RTPCR試劑（大連寶生物公司產品），COX2一抗（SantaCruz產品），COX2二抗,DAB顯色試劑（北京中杉公司產品）.肝癌細胞株HepG2用含100mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37，50mL/LCO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待細胞鋪滿瓶底80左右時傳代.1.2方法將合成的單鏈DNA片段用退火緩沖液稀釋，等摩爾混合.945min，緩慢降至室溫形成互補雙鏈.Hind，BamH雙酶切質粒pGenesil1，凝膠回收大片段線性DNA，T4連接酶4過夜連接，轉化感受態(tài)大腸桿菌JM109,鋪含卡那霉素的LB抗性板培養(yǎng)16h，挑取菌落,增菌,提取質粒,酶切鑒定并測序確認.實驗分為3組：未轉染細胞HepG2組，pshRNACOX2組，陰性對照HK組.用2.5g/L的胰酶常規(guī)消化對數期生長的細胞，稀釋成1108/L,每孔2mL，接種于六孔培養(yǎng)板，待細胞鋪滿80左右時轉染.首先用無血清無雙抗RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2遍.質粒4g，加無血清無雙抗RPMI1640培養(yǎng)基250L，脂質體10L，加無血清無雙抗RPMI1640培養(yǎng)基250L，靜置5min,將二者輕輕混勻，靜置20min，加六孔入培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)，46h換生長培養(yǎng)液，24h轉種培養(yǎng)瓶.G418篩選：初始終濃度800mg/L,4d左右大部分未轉染細胞將被處死，維持終濃度400mg/L，23wk收集細胞，供RTPCR和WesternBlot分析.1.2.1腫瘤細胞中COX2mRNA和蛋白的檢測常規(guī)胰酶消化收集細胞，冷PBS洗滌2遍，按試劑盒說明書提取細胞總RNA,逆轉錄成cDNA.PCR：COX2引物序列：P1：5TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT3,P2:5AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT3,擴增片段長度304bp.內參actin引物序列：P1：5GGGACCTGACTGACTACCTC3P2：5CGTCATACTCCTGCTTCCTG3，擴增片段長度543bp.PCR循環(huán)：9440s,5530s,7250s,38個循環(huán).WesternBlot主要步驟：用RIPA（含PMSF蛋白酶抑制劑）細胞裂解液提取總蛋白，蛋白變性上樣，行100g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯胺凝膠電泳，轉NC膜，用50g/L脫脂奶粉的TBST封閉2h,加COX2多抗（1200），4過夜，TBST洗滌3次（10min/次），二抗（15000）室溫2h，洗滌3次，每次10min，DAB顯色.數碼照相.1.2.2MTT實驗檢測細胞生長情況用2.5g/L胰酶將對數期生長細胞消化下來，稀釋成1108個/L，轉種96孔板，每孔200L，置于37,50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于24,48,72,96,168h時，每孔加終濃度為5g/LMTT200L，繼續(xù)培養(yǎng)3h，終止反應.棄去上清液，加DMSO200L/孔，充分振蕩10min，酶標儀（波長570nm）測定吸光度A值.每組3個復孔，取其平均吸光度A值，比較個組細胞生長情況.統(tǒng)計學分析：RTPCR和WesternBlot結果用Quantityone軟件分析灰度值，計算抑制率.MTT結果采用均數標準差表示，組間均數比較用單因素方差分析，P<；0.05為有統(tǒng)計學意義.2結果2.1psRNACOX2重組質粒測序和轉染挑取卡那霉素抗性板上生長的菌落，增菌并提取質粒，Hind,BamH雙酶切切出400bp左右的DNA片斷，經測序插入片斷序列正確（圖1）.pshRNACOX2重組質粒轉染48h時，轉染率為50%左右（圖2）.2.2shRNACOX2重組質粒對COX2表達的影響與未轉染細胞相比，pshRNACOX2重組質粒對actin無抑制作用，而對靶基因COX2mRNA有明顯的抑制作用，抑制率為69.9，未轉染細胞與陰性對照之間沒有差異（圖3A）.與未轉染細胞與未轉染細胞相比，actin及陰性對照HK幾乎無變化，而轉染pshRNACOX2質粒的細胞COX2蛋白表達水平明顯下降，抑制率為50.3（圖3B）.2.3pshRNACOX2重組質粒轉染對細胞增值的影響與未轉染細胞相比，pshRNACOX2重組質粒轉染后，24,48h時吸光度A值變化不明顯，而72h后吸光度A值明顯下降.說明72h后細胞增殖開始得到抑制.轉染陰性對照質粒HK的細胞與未進行轉染的HepG2細胞相比，轉染后24,48,72,96,168h細胞生長和增殖均未受到影響（圖4）.3討論RNA干擾（RNAinterference,RNAi）是通過雙鏈RNA介導同源性mRNA的特異性降解，導致轉錄后基因沉默，作為一種高效、特異的基因調節(jié)技術，目前已經成為研究基因功能的有力工具.RNAi現象的發(fā)現也為腫瘤的基因治療提供了新的方法.利用RNAi技術抑制hTERT,Survivin的表達，可以起到抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞調亡，達到治療腫瘤的目的7-8，顯示出RNAi技術在腫瘤基因治療中的巨大潛力.小干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）可在哺乳細胞中誘導特異性基因沉默.siRNA可通過化學合成、體外轉錄或核酸內切酶降解等途徑合成，但化學合成成本昂貴，內切酶可導致非特異性效應，且有siRNA瞬時轉染介導的沉默效應持續(xù)時間短的缺點.如果將轉錄siRNA的DNA模板克隆至RNA聚合酶III的下游，可在細胞內持續(xù)轉錄產生小RNA分子，通過自身折疊形成發(fā)夾樣（hairpin）結構，即內源性siRNA,可與靶基因結合降解mRNA，實現靶基因的持續(xù)抑制，可克服上述缺點.我們將靶向抑制COX2基因的siRNA的DNA轉錄模板插入到質粒pGenesil2的U6啟動子下游，轉錄的mRNA通過自身折疊形成發(fā)夾樣結構（shRNA）,經Dicer酶切割形成siRNA,供探討其對靶基因COX2抑制效應.我們構建的靶向抑制COX2基因的重組表達質粒轉染肝癌細胞HepG2后COX2基因及蛋白顯著下調，抑制率分別為69.9和50.3，而對內參基因actin沒有影響，提示利用RNAi技術抑制COX2基因表達是切實可行的.MTT實驗顯示，pshRNACOX2重組質粒轉染HepG2細胞72h后，細胞增殖明顯減慢，與未轉染細胞組相比有顯著性差異（P<；0.05），并可持續(xù)至少1wk.本研究表明，利用RNAi技術可抑制COX2表達，進而抑制腫瘤細胞增殖，為高表達COX2基因的惡性腫瘤基因治療新途徑提供了實驗依據.基金項目：重慶市自然科學基金項目（2006BB5271）【參考文獻】1SinghB,BerryJA,ShoherA,etal.COX2overexpressionincreasesmotilityandinvasionofbreastcancercellsJ.IntJOncol,2005,2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