（水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)論文）水產(chǎn)品中幾種藥物殘留檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 水產(chǎn)品中幾種藥物殘留檢測(cè)技術(shù)研究 摘要 氟甲喹( f l u m e q u i n e ) 為喹諾酮類的第一代產(chǎn)品；硝基咪唑類藥物 是一類具有5 一硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物，包括甲硝唑( m e r t o n i d a z o l ， m t z ) 、二甲硝唑( d i m e t f i d a z o l e ，d m z ) 和洛噠硝唑( r o n i d a z o l ，r n z ) 等；四環(huán)素類是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上都屬 于多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的衍生物。該三類藥物在水產(chǎn)動(dòng)物疾病預(yù) 防和治療中都有應(yīng)用，但其使用將不可避免的導(dǎo)致在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)富 集，對(duì)人體具有潛在的致癌性和致畸性。目前我國(guó)現(xiàn)有的水產(chǎn)行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)中缺少氟甲喹及硝基咪唑類藥物殘留的測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)，四環(huán)素類藥物 殘留的檢測(cè)方法尚存在不足，因此有必要建立并完善水產(chǎn)品中該三類藥物 的測(cè)定方法。 ( 1 ) 建立了高效液相色譜。熒光檢測(cè)法測(cè)定水產(chǎn)品中氟甲喹殘留量 的方法。用乙腈提取水產(chǎn)品中氟甲喹殘留物，對(duì)帶皮的鰻魚(yú)進(jìn)行3 種 濃度的回收率測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回收率在8 0 , - - - - 1 1 0 之間，變異 系數(shù)1 0 。氟甲喹的檢測(cè)限為2 5l - t g k g ，定量限為5p g k g 。 ( 2 ) 建立了水產(chǎn)品中三種硝基咪唑類殘留量的高效液相色譜一串聯(lián) 質(zhì)譜( h p l c m s m s ) 測(cè)定方法。以氘代二甲硝唑( d m z d 3 ) 作為內(nèi)標(biāo)， 以乙酸乙酯提取水產(chǎn)品中的硝基咪唑類殘留物，采用h p l c - m s m s 多 反應(yīng)監(jiān)鋇r m r m ) 正離子模式測(cè)定，可一次對(duì)水產(chǎn)品中的m t z 、d m z 和r n z 進(jìn)行定性和定量測(cè)定。方法簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程，省去固相 萃取步驟，具有操作簡(jiǎn)便、有機(jī)試劑消耗量少等優(yōu)點(diǎn)。方法d m z 定量 限可以達(dá)到2 0l a g k g ，m t z 和r n z 定量限可以達(dá)到1 0p g k g 。 ( 3 ) 研究了羅非魚(yú)中四種四環(huán)素類殘留量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì) 譜( h p l c m s m s ) 測(cè)定方法。首先用檸檬酸緩沖液( m t c ) 提取羅非 魚(yú)中的四環(huán)素類殘留物，再經(jīng)h l b 固相萃取柱凈化，采用l c m s m s i l 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)( s 鼬) 正離子模式測(cè)定，可一次對(duì)羅非魚(yú)中的四環(huán)素 ( t e t r a c y c l i n e ，t c ) 、土霉素( o x y t e t r a c y c l i n e ，o t c ) 、金霉素 ( a u r e o m y c i n ，c t c ) 和強(qiáng)力霉素( d o x y c y c l i n e ，d c ) 進(jìn)行定性和定量測(cè) 定。四種物質(zhì)定量下限均可達(dá)到2 0 p g k g 。本方法具有靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn) 便、+ 快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于水產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素多殘留的同時(shí)確證 檢測(cè)。 本論文建立了水產(chǎn)品中氟甲喹殘留量的高效液相色譜熒光檢測(cè)方 法及水產(chǎn)品中四環(huán)素類和硝基咪唑類殘留量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 測(cè)定方法，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了測(cè)定，為水產(chǎn)品中該三類藥物的殘留檢測(cè)提 供了技術(shù)支持和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 關(guān)鍵詞：氟甲喹，硝基咪唑類，四環(huán)素類，殘留檢測(cè) i i i 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 s t u d i e so nt h ed e t e c t i v et e c h n i q n e sf o rr e s i d u e so fc h a m i c a l d r u g si na q u a t i cp r o d u c t s a b s t r a c t f l u m e q u i n e i st h e f i r s t g e n e r a t i o n o f q u i n o l o n e s t h e n i t r o n i m i d a z o l e d r u gi sag r o u po fd r u g si n c l u d sm e t r o n i d a z o l e ，r o n i d a z o l e a n dd i m e t r i d a z o l ew h i c hh a v ec h e m i c a ls t r u c t u r e so f5 n i t r o i m i d a z o l e s t e t r a c y c l i n e s ( t c s ) p r o d u c e db ys t r e p t o m y c e s a r e b r o a d s p e c t r u m a n t i b i o t i c s t e t r a c y c l i n e sb e l o n g t ot h er a m i f i c a t i o nw h i c hh a v ef o u r b e n z e n er i n ga n dc a r b o x y la m i d ed e r i v a t i v e sn u c l e u si nt h ec h e m i c a l s t r u c t u r e 。t h ef u n c t i o no ft h e s et h r e ek i n d so fd r u g si st op r e v e n to rt r e a to f a q u a t i ca n i m a ld i s e a s e sc a u s e db yb a c t e r i ao rp r o t o z o a t h ea b u s eo f f l u m e q u i n e ，t e t r a c y c l i n e sa n dt h ei l l e g a lu s en i t r o n i m i d a z o l e d r u gm a y r e s u l ti nt h ed r u gr e s i d u e si na q u a t i ca n i m a l s w h e nt h e s ea n i m a l sa r eu s e d a sf o o dr e s o u r c e st h ed r u gr e s i d u e sw i l lh a v ep o t e n t i a lc a r c i n o g e n i ca n d t e r a t o g e n i ch a z a r dt oh u m a n n i t r o i m i d a z o l e sh a db e e nb a n n e di nf o o d p r o d u c i n ga n i m a l si ne u r o p e a nu n i o n ，u s aa n dc h i n a a tp r e s e n tt h e r ea r e n os t a n d a r d sf o rd e t e r m i n a t i o no f d r u g r e s i d u e so f f l u m e q u i n e ， n i t r o i m i d a z o l e si na q u a n t i ci nc h i n a t h em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f t e t r a c y c l i n er e s i d u e si na q u a n t i ca n i m a l sa l s on e e dt ob em o d i f i e d i ti s n e c e s s a r yt oe s t a b l i s hn e ws t a n d s r d so rd e v e l o pt h eo r i g i n a ls t a n d s r d sf o r t h ed e t e r m i n a t i o no fr e s i d u e sf o rt h e s ed r u g s ( 1 ) am e t h o do fd e t e r m i n a t i o no ff l u m e q u i n er e s i d u e si ne e lt i s s u e s s b yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w i t hf l u o r e s c e n c e d e t e c t o r ( h p l c f l d 、) i sd e v e l o p p e d f l u m e q u i n ew a se x t r a c t e df r o mt h e m a t r i xw i t ha c e t o n i t r i l ea n da n a l y s e db yh p l c f l d t h er e c o v e r i e so ft h e f l u m e q u i n ew e r ei nt h er a n g eo f8 0 - 1 10 ，l i m i t so fd e t e c t i o n ( l o d s ) 2 5 卜t g k g ，l i m i t so fq u a n t i t a t i o n ( l o q s ) 5 0p g k g ，t h ec o e f f i c i e n t so fv a r i a t i o n w i t h i nb a t c h e sl e s st h a n1 0 t h i sm e t h o di ss u i t a b l et ob ea d o p t e di nt h e i v 上海海洋人學(xué)碩士學(xué)位論文 d e t e r m i n a t i o no ff l u m e q u i n er e s i d u ei ne e lt i s s u e s ( 2 ) t h em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fr e s i d u e so ft h r e ek i n d so f n i t r o i m i d a z o l e si na q u a t i ca n i m a l sw a sd e v e l o p e db yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ( h p l c m s m s ) d e u t e r a t e dd i m e t r i d a z o l e ( d m z - d 3 ) w h i c hu s e da si n t e r n a lr e f e r e n c e m a t e r i a lw a sa d d e dt ot h e s a m p l e b e f o r ee x t r a c t i o n s a m p l e s w e r e d i s s o l v e di ns o d i u mh y d r o x i d es o l u t i o nt od i s a s s o c i a t et a r g e ta n a l y t e sf r o m m a t r i x n i t r o i m i d a z o l e sw e r ee x t r a c t e df r o mt h et r e a t e dm a t r i xb ye t h y l a c e t a t ew i t ht h el i q u i d - - l i q u i di o nm e t h o d t h em a s ss p e c t r o m e t e rw a s p e r f o r m e di nt h ep o s i t i v ei o nm o d eu s i n gm u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r i n gf o r b o t hq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fm t z 、d m za n dr n z d u r i n g o n c ei n je c t i o n t h ep r e l i m i n a r yt r e a t m e n tw a sp r e d i g e s t e da n dn os o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) p r o c e d u r ew a sa d o p t e d c o m p a r i n gw i t h o t h e r m e t h o d s ，t h i sm e t h o dh a st h ea d v a n t a g e so fs i m p l eo p e r a t i o n ，l e s so r g a n i c c h e m i c a l s c o n s u m p t i o n ，a n d s h o r t e r o p e r a t i o n t i m e t h el i m i t so f d e t e c t i o n ( l o d ) w e r eo ，010g g k g ，a n dt h el i m i t so fq u a n t i t a t i o n ( l o q ) 0 1 0 0p g k g ( 3 ) am e t h o di sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fr e s i d u e so ff o u r t c si nt i l a p i at i s s u eb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e m m a s ss p e c t r o m e t r y ( h p l c - m s m s ) d e t e c t i o n t c sw e r ee x t r a c t e dw i t h m c l l v a i n eb u f f e rs o l u t i o n ( p h4 o ) t h ee x t r a c tw a sc l e a n e db yt h eo a s i s h l bs o l i dp h a s ec o l u m n t h em a s ss p e c t r o m e t e rw a sp e r f o r m e di nt h e p o s i t i v ei o nm o d eu s i n gm u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r i n gf o rb o t hq u a l i t a t i v e a n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fc t c 、o t c 、d o ca n dt cd u r i n go n c ei n je c t i o n t h el i m i t so fq u a n t i t a t i o nw e r e2 0 “e c g g t h em e t h o dc a nb eu s e dt o s i m u l t a n e o u s l y c o n f i r mt h e s ef o u r t e t r a c y c l i n e a n t i b i o t i c si n a q u a t i c p r o d u c t s t h ea d v a n t a g eo ft h em e t h o di ss e n s i t i v e ，a c c u r a t e ，c o n v e n i e n t a n df a s t i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h eh p l c f l da n dt h eh p l c - m s m sm e t h o d w e r ee s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fr e s i d u e so ff l u m e q u i n e ，t c sa n d n i t r o i m i d a z o l e si na q u a t i cp r o d u c t sr e s p e c t i v e l y t h em e t h o d sw e r ea l s o v 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 a p p l i e dt om o n i t o rs a m p l e sw h i c hw e r ec o l l e c t e df r o mm a r k e t s t h ew o r k h a sc o n t r i b u t e dm u c ht ot h ed r u gr e s i d u es u r v e i l a n c ei nc h i n a k e yw o r d s ：q u i n o l o n e s ，n i t r o i m i d a z o l e s ，t e t r a c y c l i n e ，d r u gr e s i d u e v i 上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位 論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除 文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集 體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫(xiě)，我 對(duì)所寫(xiě)的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名：密i 車色芊 日期：聊年月日 上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) 學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定， 同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子 版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位 論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、 縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。 保密 口 ，在年解密后適用本版權(quán)書(shū)。 本學(xué)位論文屬于 不保密口 學(xué)位論文作者簽名：丙l 甜 日期：妒7 年月7 日 指導(dǎo)教師簽名互汴譯 日期：砷年月7 日 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 引言 食品藥物殘留是指在食品的任何食用部分中藥物的原形化合物或 其代謝產(chǎn)物，并包括與藥物本體有關(guān)雜質(zhì)的殘留。主要的殘留物有消 毒劑、驅(qū)蟲(chóng)劑、抗菌藥、激素類、基因誘導(dǎo)劑等。雖然食品的藥物殘 留量較低，但是通過(guò)食物鏈的長(zhǎng)期富集，對(duì)人體健康有很大的危害。 早在2 0 世紀(jì)7 0 年代，食品藥物殘留問(wèn)題就引起了國(guó)際上的廣泛關(guān)注。 8 0 年代食品中獸藥殘留法典委員會(huì)( c c b v d f ) n 1 成立并負(fù)責(zé)討論藥物殘 留的有關(guān)問(wèn)題，制定動(dòng)物源性食品中藥物殘留的允許限量標(biāo)準(zhǔn)。目前， 歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已形成了非常完善的食品藥物殘留監(jiān)測(cè)體系，包括法 律法規(guī)體系、監(jiān)督管理體系、檢測(cè)機(jī)構(gòu)體系、技術(shù)隊(duì)伍體系和技術(shù)標(biāo) 準(zhǔn)體系。 國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)品藥物殘留控制的發(fā)展趨勢(shì) 1 ) 政府對(duì)食品安全越來(lái)越重視 為了加強(qiáng)水產(chǎn)品安全管理，有效保證水產(chǎn)品安全，保護(hù)消費(fèi)者安 全，許多國(guó)家成立了高規(guī)格的管理機(jī)構(gòu)，加強(qiáng)了國(guó)家對(duì)水產(chǎn)品安全管 理的力度。歐盟設(shè)有食物鏈與動(dòng)物健康常設(shè)委員會(huì)、食品科學(xué)委員會(huì) 等機(jī)構(gòu)，以歐盟委員會(huì)的名義發(fā)布有關(guān)食品安全的指令。1 9 9 8 年，美 國(guó)成立了“總統(tǒng)食品安全顧問(wèn)委員會(huì)”，2 0 0 2 年5 月，日本政府決定 成立由科學(xué)家和專家組成的獨(dú)立委員會(huì)一“食品安全委員會(huì)”。我國(guó) 已建成4 個(gè)國(guó)家級(jí)獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，6 個(gè)部級(jí)獸藥殘留檢測(cè)中心， 3 0 個(gè)省級(jí)獸藥監(jiān)察所均已根據(jù)農(nóng)業(yè)部的統(tǒng)一要求建立了獸藥殘留監(jiān)測(cè) 實(shí)驗(yàn)室眩1 。 2 ) 藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越細(xì)化 發(fā)達(dá)國(guó)家把制定藥物殘留限量標(biāo)準(zhǔn)作為控制水產(chǎn)品藥物殘留的重 要內(nèi)容和防止進(jìn)口水產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)的主要措施，制定了越來(lái)越多 的藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)也非常重視藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)的制定，從2 0 0 0 年起， 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 先后組織制修訂了幾十項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，包括無(wú)公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則、 無(wú)公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量、漁用含氯消毒制劑等。 磺胺類、土霉素類、喹諾酮類藥物、氯霉素、甲醛、已烯雌酚、孔雀 石綠、硝基呋喃等殘留量的測(cè)定方法等標(biāo)準(zhǔn)也都已制定完成b 1 。 3 ) 藥物殘留要求越來(lái)越嚴(yán)格 最近幾年來(lái)，世界各國(guó)特別是歐盟、日本、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)水 產(chǎn)品中藥物殘留的要求日趨嚴(yán)格，隨著儀器設(shè)備、檢測(cè)能力和檢測(cè)技 術(shù)水平的提高，藥物最高殘留限量也越來(lái)越低。由于世貿(mào)組織不僅接 受和認(rèn)可國(guó)際水產(chǎn)品法典委員會(huì)關(guān)于水產(chǎn)品藥物殘留的標(biāo)準(zhǔn)，而且規(guī) 定各國(guó)有權(quán)制定比國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)更高的標(biāo)準(zhǔn)和更嚴(yán)格的檢驗(yàn)檢疫措施，各 國(guó)紛紛把現(xiàn)有儀器設(shè)備和檢測(cè)方法所能檢出的最低含量作為限量的標(biāo) 準(zhǔn)。隨著儀器設(shè)備性能的提高和檢測(cè)方法的不斷改進(jìn)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)還會(huì) 向更低的方向發(fā)展。 4 ) 禁用限用藥物越來(lái)越多 2 0 0 2 年，美國(guó)水產(chǎn)物與藥品管理局( f d a ) 公布了禁止在進(jìn)口動(dòng)物 源性水產(chǎn)品中使用的1 1 種藥物名單，其中包括氯霉素、鹽酸克倫特羅、 己烯雌酚、二甲硝咪唑、其他硝基咪唑類、異煙酰咪唑、呋喃西林、 呋喃唑酮、磺胺類藥、氟乙酰苯酮、糖肽h 3 。 ， 繼美國(guó)之后，日本決定對(duì)中國(guó)動(dòng)物源性水產(chǎn)品藥物殘留進(jìn)行批批 檢測(cè)。禁止在家禽中使用克球酚( 二氯二甲基吡啶酚) 、尼卡巴嗪、螺 旋霉素、滅霍靈、喹乙醇、惡喹酸、甲砜霉素、氨丙啉、磺胺喹惡啉、 磺胺二甲基嘧啶、甲苯、萬(wàn)能膽素、前列斯汀、苯酚類消毒藥以及含 有磺胺喹惡啉成分的藥物陌】。 歐盟從1 9 9 9 年1 0 月1 日起，停止生產(chǎn)和使用3 種促進(jìn)增重的藥 物添加劑氯氟芐腺嘌呤、二硝甲苯酰胺、異丙硝噠唑?，F(xiàn)在，歐盟全 面禁止使用洛硝噠唑和氯羥吡啶，并已經(jīng)決定從2 0 0 6 年1 月起，將目 前尚允許在飼料中使用的最后4 種抗生素也予以禁止使用，這意味著 歐盟將全面禁止在飼料中投放任何種類的抗生素叩1 。 2 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 近年來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖品 種大量增加，產(chǎn)量迅速提高，我國(guó)己成為世界水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國(guó)，與 之相對(duì)的是我國(guó)水產(chǎn)品出口在國(guó)際市場(chǎng)的占有率僅為6 , - - - 8 ，大大低 于國(guó)際水平，而且盡管我國(guó)水產(chǎn)品出口數(shù)量呈上升趨勢(shì)，但其品質(zhì)、 價(jià)格不升反降。養(yǎng)殖者為了防病、治病，超劑量長(zhǎng)時(shí)間使用藥物或使 用禁用藥而導(dǎo)致的水產(chǎn)品藥物殘留，已成為制約我國(guó)水產(chǎn)品出口增長(zhǎng) 的主要因素。我國(guó)水產(chǎn)品出口被禁或受限事件屢見(jiàn)不鮮，嚴(yán)重制約了 我國(guó)動(dòng)源性食品的出口，給我國(guó)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，極大的損害 了我國(guó)水產(chǎn)品在世界貿(mào)易中的形象。由于我國(guó)在管理體制、立法、技 術(shù)能力和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)研究方面落后于國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家，因此在相關(guān)貿(mào)易爭(zhēng) 議中我國(guó)往往成為受制約一方。為了保障人民的身體健康，維護(hù)水產(chǎn) 品正常出口、擴(kuò)大水產(chǎn)品的貿(mào)易往來(lái)以及在貿(mào)易爭(zhēng)議中獲得主動(dòng)地位， 建立靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的殘留分析方法是非常必要的。 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 文獻(xiàn)綜述 1 1 幾種常用漁藥的理化性質(zhì)、抗菌機(jī)理及毒性 1 1 1 理化性質(zhì) 1 1 1 1 氟甲喹 氟甲喹( f l u m e q u i n e ) 為喹諾酮類( q n s ) 的第一代產(chǎn)品，別名：氟六喹酸、氟 喹酸和r 一8 0 2 等，分子式c h ：f n 0 3 ，相對(duì)分子質(zhì)量2 6 1 2 5 ，氟甲喹結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 卜l ，為白色粉末m 。無(wú)臭無(wú)味，幾乎不溶于水和乙醇，能溶于甲酸和氫氧化鈉溶 液，不吸潮，對(duì)熱、濕、光比較穩(wěn)定。其在抗菌活性方面比萘啶酸有較大提高嗍。 o f 同i m e 哪i ，椰l 秘 圖1 - 1 氟甲喹結(jié)構(gòu)圖 f i g 1 1s t r u c t u r e so f f l u m e q u m e 表卜1d m z 、m t z 和r n z 分子結(jié)構(gòu)及分子量 t a b l e 1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r e sa n dm o l e c u l a rm a s s e so f d m z ，m t za n dr n z 4 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 1 2 硝基瞇唑類 硝基咪唑類藥物是一類具有5 一硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物，主要包括甲硝唑 ( m e t r o n i d a z o l e ，m t z ) 、二甲硝唑( d i m e t r i d a z o l e ，d m z ) 和洛噠硝唑( r o n i d a z o l e ， r n z ) 等。甲硝唑又名滅滴靈，為白色或微黃色的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。在乙醇和水 中微溶。二甲硝咪唑又名地美硝唑，為類白色或微黃色粉末。在乙醇中易溶，在 水中微溶陰。m t z 、d m z 和r n z 分子式、分子量和結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1 1 。 1 1 1 3 四環(huán)素類藥物 四環(huán)素類( t e t r a e y c l i n e s ，t c s ) 是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，在化學(xué)結(jié)構(gòu) 上都屬于多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的衍生物【1 0 1 。其分子式和結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1 - 2 。 表1 - 2t c s 分子結(jié)構(gòu)和分子量 t a b l e1 - 2m o l e c u l a rs t r u c t u r e sa n dm o l e c u l a rm a s s e so ft c s 1 2 。1 抗菌機(jī)理及其毒性 1 2 1 1 氟甲喹 氟甲喹能抑制細(xì)菌脫氧核糖核酸( 】階回旋酶，干擾d n a 復(fù)制而產(chǎn)生殺菌作 用。d n a 回旋酶由2 個(gè)a 亞單位及2 個(gè)b 亞單位組成，能將染色體正超螺旋的一 條單鏈切開(kāi)、移位、封閉，形成負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)【l l 】。氟喹諾酮類可與d n a 、d n a 回 旋酶形成復(fù)合物，進(jìn)而抑制a 亞單位，只有少數(shù)藥物還作用于b 亞單位，結(jié)果不 能形成負(fù)螺旋結(jié)構(gòu)，阻斷d n a 復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。 氟甲喹經(jīng)1 2 1 服對(duì)河鰻9 6 h 的l c s o 在7 9 4 9 k g 以上。氟甲喹浸浴淡水青蝦的l c 5 0 5 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 在1 0 0 0 m g l 以上。根據(jù)農(nóng)業(yè)部新獸藥一般毒性方法及其毒性分級(jí)，氟甲喹屬于低 毒的，對(duì)水生動(dòng)物及畜禽是安全的。 1 2 1 2 硝基咪唑類 硝基咪唑類藥物具有抗原蟲(chóng)和抗菌活性，同時(shí)也具有很強(qiáng)的抗厭氧菌作用，藥 物進(jìn)入易感的微生物細(xì)胞后，在無(wú)氧或少氧環(huán)境和較低的氧化還原電位下，其硝 基易被電子傳遞蛋白還原成具有細(xì)胞毒作用的氨基，抑制細(xì)胞d n a 的合成，并使 已合成的d n a 降價(jià)，破壞d n a 的雙螺旋結(jié)構(gòu)或阻斷其轉(zhuǎn)錄復(fù)制，從而使細(xì)胞死 亡，發(fā)揮其迅速殺滅厭氧菌、有效控制感染的作用【1 2 】。 硝基咪唑類藥物及其游離代謝產(chǎn)物，其硝基位于咪唑環(huán)的第5 位置，從化學(xué) 結(jié)構(gòu)上分析具有潛在的致癌和致突變性。v o o g d 1 3 】的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硝基咪唑類藥物對(duì)真 核細(xì)胞( 包括哺乳類動(dòng)物細(xì)胞) 有弱或無(wú)誘變作用。m o h i n d r a 1 4 】對(duì)中國(guó)田鼠卵巢細(xì)胞 在低氧及有氧條件下生存力的研究結(jié)果顯示，增殖期的細(xì)胞在低氧條件下對(duì)藥物 的毒性極其敏感。硝基呋喃類對(duì)細(xì)胞染色體的損傷比硝基瞇唑類更強(qiáng)，是因?yàn)樗?佰丁具有較高的電子親和力嘲，且電子親和力與誘變性是緊密相關(guān)的。唐漢祥【1 6 1 在毒 性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，替硝唑可誘發(fā)肺炎克氏檸檬酸菌、大腸桿菌k 1 2 突變，對(duì)中國(guó)地 鼠v 7 9 肺細(xì)胞無(wú)致突變性，對(duì)鼠仔無(wú)致畸作用。史宗道【1 7 】對(duì)多地區(qū)的因口腔炎癥 應(yīng)用替硝唑治療病人進(jìn)行了i i 期臨床試驗(yàn)研究，排除孕婦、哺乳期婦女、嚴(yán)重神 經(jīng)系統(tǒng)疾患、血液病及嚴(yán)重肝、腎功能損害或?qū)ο趸溥蝾惓粽?，約1 3 病人出 現(xiàn)不良反應(yīng)。 1 2 1 3 四環(huán)素類藥物 四環(huán)素類藥物主要以原型經(jīng)腎小球過(guò)濾排出，殘留藥物能沉積于骨及牙組織 內(nèi)，與新形成的骨、牙中所沉積的鈣相結(jié)合，導(dǎo)致牙齒持久成黃色，俗稱“四環(huán) 素牙 i l 引，使出生的幼兒乳牙釉質(zhì)發(fā)育不全并出現(xiàn)黃色沉積，引起畸形或生長(zhǎng)抑 帶0 。四環(huán)素類藥物還在肝組織中富集，造成肝損害，還可造成過(guò)敏反應(yīng)、二重感染、 致畸胎。四環(huán)素藥物殘留易誘導(dǎo)耐藥菌株造成的食品殘留給人類身體健康帶來(lái)隱 患。 1 2 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用及國(guó)內(nèi)外限用狀況 1 2 1 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用 1 2 1 1 氟甲喹 由于氟甲喹獨(dú)具的高安全性、耐受性、在組織中的高生物活性和高滲透性， 一直受到世界衛(wèi)生組織和世界糧農(nóng)組織及食品法典委員會(huì)及歐洲藥品評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)的 重視，二者僅作為獸用藥避免了人畜共用藥的危害，有效地減少了人類交叉耐藥 6 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 菌株的產(chǎn)生。該藥現(xiàn)在已被歐洲藥典收載，最適宜用于無(wú)公害養(yǎng)殖基地、供出口 畜產(chǎn)品、禽產(chǎn)品、淡水產(chǎn)品及海水產(chǎn)品養(yǎng)殖基地【1 9 】。 氟甲喹是第一個(gè)在6 位引進(jìn)f 的藥物，主要用于鮭魚(yú)、鱒魚(yú)、各種蝦以及鰻 魚(yú)等細(xì)菌感染性疾病的預(yù)防。根據(jù)歐洲藥品評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)獸藥產(chǎn)品委員會(huì)的報(bào)告，氟 甲喹在豬體內(nèi)經(jīng)7 2 h 代謝，在肌肉、脂肪、肝和腎中濃度為9 1 、1 1 8 、1 8 1 和2 3 7 1 a g k g ， 藥物殘留限量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家對(duì)氟甲喹規(guī)定的最高殘留限量，故豬只需停藥3 天： 在雞體內(nèi)經(jīng)4 8 h 代謝，在肌肉、脂肪、肝和。腎中濃度為6 9 、7 9 、1 8 5 和1 6 1 r t g k g ， 藥物殘留限量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家對(duì)氟甲喹規(guī)定的最高殘留限量，故雞只需停藥2 天； 在魚(yú)體內(nèi)經(jīng)7 天的代謝，肌肉+ 脂肪的濃度為8 0 p g k g ，藥物殘留限量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó) 家對(duì)氟甲喹規(guī)定的最高殘留限量，故魚(yú)只需停藥2 天 2 0 - 2 6 1 。 1 2 1 2 硝基咪唑類 硝基咪唑類藥物具有抗原蟲(chóng)和抗菌活性，同時(shí)也具有很強(qiáng)的抗厭氧菌作用， 用于治療魚(yú)類指環(huán)蟲(chóng)病、偽指環(huán)蟲(chóng)病、三代蟲(chóng)病等單殖吸蟲(chóng)類寄生蟲(chóng)病。青魚(yú)、 草魚(yú)、日本鰻、鰱、鳙、鱖每平方米水體用m t z6 7 - 1 0 0 9 ，歐洲鰻和美洲鰻每平 方米水體用m t z l 6 7 - - 一3 3 4 9 r 7 】。m n z 除抗滴蟲(chóng)及阿米巴原蟲(chóng)外，還對(duì)脆弱擬桿菌、 黑色素?cái)M桿菌梭狀桿菌屬、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌等有良好抗菌作用；d m z 不僅 能抗大腸弧菌、多型性桿菌、鏈球菌、葡萄球菌和密螺旋體，而且可預(yù)防螺旋體 引起的豬下痢，亦可用于防治水產(chǎn)動(dòng)物的組織滴蟲(chóng)病及六鞭蟲(chóng)病，此外還有增重 作用。李海燕1 2 8 等研究發(fā)現(xiàn)甲咪唑濃度為4 x 1 0 幣和8 x l 礦時(shí)對(duì)日本鰻、歐洲鰻、 翹嘴鱖、紅劍和建鯉是安全的；濃度為2 x 1 0 石時(shí)，前3 種試驗(yàn)魚(yú)全部存活，而紅劍 和建鯉的死亡率為6 和4 。用濃度為2 x 1 0 r 6 、4 x 1 0 - 6 和8 x 1 0 。6 的甲咪唑藥浴患偽 指環(huán)蟲(chóng)病( 感染率為9 2 ) 的歐洲鰻，用藥1 次，1 2 0 h 后其陽(yáng)性檢出率分別為5 4 、 1 0 和o 。 1 2 1 3 四環(huán)素類藥物 四環(huán)素類藥物可防治水產(chǎn)動(dòng)物多種疾病。包括鱸形目魚(yú)類、鯡形目魚(yú)類的弧 菌病，香魚(yú)以外淡水鯡形目魚(yú)類鏈球菌病，虹鱒的癤瘡病等等曬1 。 1 2 2 在國(guó)內(nèi)外的限用情況 1 2 2 1 氟甲喹 由于氟甲喹在小鼠的1 8 個(gè)月常規(guī)致癌試驗(yàn)中引起肝細(xì)胞瘤，厄c f a ( m ef o o d a n da g r i c u l t u r e ( f a o ) w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ( w h o ) j o i n te x p e r tc o m m m i t t e eo n f o o da d d i t i v i e s ) 認(rèn)為其致癌作用并非是由遺傳毒性引起的，所以在1 9 9 7 年第4 8 次j e c f a 會(huì)議制定了氟甲喹在鱒魚(yú)中的m r l 為5 0 0 i _ t g k g t 3 0 l 。2 0 0 2 年1 月e m e a ( t h ee u r o p e a na g e n c yf o rt h ee v a l u a f i o no f m e d i c i n a lp r o d u c t s ) 根據(jù)其對(duì)腸道菌群 7 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 的作用，制定的生物學(xué)a d i 為4 9 5 1 a g k g ，以及氟甲喹在豬、牛、羊、魚(yú)的m r l 。 但是1 9 9 9 年y o s h i d a 3 1 1 報(bào)道飼料中4 0 0 0 m g k g 的氟甲喹飼喂3 0 周可以引起肝臟出 現(xiàn)壞死；2 0 0 1 年t a k i z a w a t 3 2 】報(bào)道氟甲喹具有引發(fā)和促進(jìn)肝臟腫瘤的作用；2 0 0 2 年 k a s h i d a 3 3 1 報(bào)道氟甲喹具有引發(fā)和促進(jìn)肝臟腫瘤作用與其引起d n a 斷鏈有關(guān)。因 此在2 0 0 3 年第6 0 次會(huì)議上j e c f a 撤銷1 9 9 9 年w t o 制定的a d i 以及在豬、牛、 羊、魚(yú)的m r l ! 州。日本、中國(guó)和歐盟各國(guó)對(duì)氟甲喹限量標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1 3 。 表1 - 3 中國(guó)和歐盟對(duì)氟甲喹藥物的最大殘留量 t a b l e1 - 3m g l se s t a b l i s h e db ye ua n dc h i n af o r0 x o l i n i ca c i da n df l u m e q u i n e 1 2 2 2 硝基咪唑類 由于硝基咪唑所具有的危害性，許多國(guó)家都針對(duì)該種藥物制定了嚴(yán)格的食品 安全限量標(biāo)準(zhǔn)，且在一定程度上限制其使用。1 9 8 8 年，美國(guó)食品及藥物管理局 ( f d a ) 基于d m z 原型藥物對(duì)人體健康存在的潛在危險(xiǎn)，撤回其作為獸藥使用； 歐盟1 7 9 8 9 5 e e c 規(guī)定禁止將d m z 作為獸藥使用，但用作飼料添加劑仍然保留， 2 0 0 2 年1 1 月，又頒布禁止在飼料中投放d m z 作為添加劑。m n z 、r n z 、i p z 也 都被禁用。最近幾年，隨著世界各國(guó)特別是歐盟各國(guó)、日本、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì) 食品中藥物殘留的要求日趨嚴(yán)格，硝基咪唑類物質(zhì)成為明令禁用和重點(diǎn)監(jiān)控的獸 藥品種。2 0 0 2 年f d a 年公布了禁止在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中使用的1 1 種藥物名單， 其中包括二甲硝咪唑、其他硝基咪唑類。2 0 0 6 年5 月，日本肯定列表制度實(shí)施后， 日方對(duì)進(jìn)口蜂蜜提出了硝基昧唑類獸藥的檢測(cè)要求，并且硝基咪唑類藥物殘留的 最大殘留限量要求為o 1 l x g k g 。日本政府根據(jù)其食品衛(wèi)生法制定的”食品中農(nóng) 業(yè)化學(xué)品殘留肯定列表制度”計(jì)劃于2 0 0 6 年5 月2 9 日起正式施行，這一制度的實(shí) 施將對(duì)我國(guó)食品和農(nóng)產(chǎn)品對(duì)日出口帶來(lái)嚴(yán)峻的考驗(yàn)，在所有食品中均”不得檢出 的農(nóng)業(yè)化學(xué)品共有1 5 種，其中包括二甲硝咪唑，甲硝唑，羅硝唑。這些物質(zhì)一旦 被檢出，即視為超標(biāo)。2 0 0 3 年加拿大公布了新的修改條例，基于缺乏結(jié)合殘留物的 毒性信息，而取消所有5 一硝基咪唑類化合物作為獸藥在食源性動(dòng)物中使用。2 0 0 2 年3 月我國(guó)也開(kāi)始對(duì)硝基瞇唑類藥物嚴(yán)格控制，農(nóng)牧發(fā) 2 0 0 2 1 號(hào)文件中規(guī)定了在 食源性動(dòng)物中禁止使用d m z 、m n z l 3 5 】。 8 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 2 3 四環(huán)素類藥物 研究發(fā)現(xiàn)該類藥物具有致突變性和潛在的致癌性，被許多國(guó)家列為限用藥物。 歐盟和我國(guó)規(guī)定四種四環(huán)素類總和或單項(xiàng)不得超過(guò)1 0 0 1 1 9 k g 。 1 3 檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀 1 3 1 酶聯(lián)免疫法( e l ls a ) 由于e l i s a 具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、專一性強(qiáng)、適用于批量樣品分析的特 點(diǎn)，已廣泛用于動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的檢測(cè)。單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)保證了 試劑連續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)和標(biāo)準(zhǔn)化供應(yīng)，為e l i s a 的應(yīng)用增添了新活力。e l i s a 試劑盒 已成為目前國(guó)內(nèi)外獸藥殘留檢測(cè)的主流技術(shù)。 目前尚沒(méi)有商品化的硝基咪唑檢驗(yàn)試劑盒，但在對(duì)其抗體的研究方面， l h s t a n k e r t 3 q 及f o d e y t l 【3 刀都作了相關(guān)研究。h u e t a c p s j 報(bào)道了用e l i s a 法篩 選蛋和肌肉組織中的4 種硝基咪唑的最新研究方法。樣品經(jīng)乙腈提取，用正己烷 脫脂后，競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫反應(yīng)測(cè)定樣品中的硝基咪唑及其代謝物，對(duì)蛋中d m z 、 m n z 、r n z 、d m z o h 和i p z 的檢測(cè)能力可分別達(dá)到l u g k g 、1 0 u g k g 、2 0u g k g 、 2 0u g k g 和4 0 u g k g 。 d ew a s c h 等【3 9 】用e l i s a 研究了豬肉和雞肉中的四環(huán)素類藥物殘留，能夠檢測(cè) 到的四環(huán)素類藥物的最低水平是歐洲的m l r 值或更低。l e ehj 等h o 研究結(jié)果表明 半定量e l i s a 方法可靠，能被用來(lái)預(yù)測(cè)活豬組織中的四環(huán)素類藥物的殘留。沈洪剛 掣4 l 】應(yīng)用酶聯(lián)免疫法快速測(cè)定豬肉中四環(huán)素族殘留量，試樣中殘留的四環(huán)素族經(jīng) 酸丙酮提取，離心濃縮后，溶于加熱過(guò)的牛奶中，用i d e e x 試劑盒測(cè)定，利用的 是酶的特異性結(jié)合原理( 樣品中四環(huán)素族參與競(jìng)爭(zhēng)抑制酶標(biāo)抗體與抗原的結(jié)合，樣 品中四環(huán)素族殘留越多，抑制力就越強(qiáng)，酶聯(lián)反應(yīng)所顯的顏色就越淺) ，因而具有 十分強(qiáng)的特異性，不會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，本方法的靈敏度為0 1 0 m g k g 。 酶聯(lián)免疫( e l i s a ) 法能在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大批量樣品的篩選，又不需要復(fù)雜昂貴 的大型儀器，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。但同類藥物的 交叉反應(yīng)及e l i s a 法易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，所以，對(duì)陽(yáng)性結(jié)果需要用其他確證技術(shù)進(jìn) 一步檢驗(yàn)。 1 3 2 高效液相色譜法( h p l o ) 高效液相色譜的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，現(xiàn)己成為獸藥殘留檢測(cè)不可缺少的重要方 法。其原因主要是i - i p l c 能適合分離檢測(cè)不易氣化或受熱易分解、分子量大、離 子型農(nóng)藥、強(qiáng)極性獸藥及其代謝物。這些獸藥用g c 測(cè)定時(shí)，必須先進(jìn)行衍生化處 理。h p l c 采用高效色譜柱、高壓泵和高靈敏度檢測(cè)器大大提高了液相色譜的檢測(cè) 效率、靈敏度和速度。目前，在獸藥殘留分析時(shí)使用最多的檢測(cè)器是紫外檢測(cè)器 o 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 v ) 和熒光檢測(cè)器( f d ) 。紫外檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，流量和溫度的變化影 響小，是梯度淋洗的一種比較理想的檢測(cè)器，但是只能檢測(cè)對(duì)紫外光有吸收性能 的農(nóng)藥。f d 是一種靈敏度高、選擇性強(qiáng)的檢測(cè)器，比u v 的靈敏度要高1 - 2 個(gè)數(shù) 量級(jí)。 h a r r v 等【4 2 j 用高效液相色譜熒光檢測(cè)法，并采用液液分配提取測(cè)定雞肉組織 中氟甲喹和嗯喹酸殘留，但其流動(dòng)相中使用了四氫呋喃，而四氫呋喃本身在氟甲 喹和嗯喹酸的最適波長(zhǎng)處熒光值也很高，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。b j r k l u n d t 4 3 1 等人則 采用固相萃取凈化，用高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定豬肉組織中氟甲喹和嗯喹酸 殘留，試驗(yàn)中采用了固相萃取柱，使操作過(guò)程繁瑣，回收率降低。 農(nóng)業(yè)部公布了動(dòng)物性食品中m n z 、d m z 、r n z 殘留檢測(cè)的h p l c 法 4 4 1 ，適用 于雞的肌肉、肝臟組織中單個(gè)或多殘留的檢測(cè)，檢測(cè)限為l i a g k g ，在6 5 0 p 眺g 添 加濃度時(shí)回收率為6 0 - 1 2 0 。樣品先用乙酸乙酯提取，液液萃取、固相萃取柱 凈化等過(guò)程，處理方法較為復(fù)雜。王建華【4 5 】等建立了雞的肌肉組織中m n z 、d m z 和r n z 殘留檢測(cè)的h p l c 法和氣相色譜法。h p l c 法中采用二氯甲烷提取后，提取 液直接過(guò)硅膠固相萃取柱凈化，樣品添加濃度為1 0 - - 5 0 1 x g k g 時(shí)，平均回收率為 7 8 - - - 9 1 ，但靈敏度低，檢測(cè)限為1 0 1 x g k g ，并且二氯甲烷的毒性比較大。艾霞 1 4 6 1 等建立了m n z 在雞蛋、牛奶及魚(yú)的肌肉和皮膚中殘留檢測(cè)的h p l c 法，雞蛋和 牛奶樣品用乙酸乙酯提取，魚(yú)的肌肉和皮膚用乙腈提取，提取液旋轉(zhuǎn)蒸干，殘余物 溶于正己烷乙酸乙酯( 2 ：1 ) 過(guò)固相萃取柱，洗脫液氮?dú)獯蹈?，流?dòng)相定容。m n z 在 各組織中的檢測(cè)限均可達(dá)1 0 1 x g k g ，空白雞蛋、牛奶和草魚(yú)添加m n z 濃度為1p g k g ， 2 i t g k g 和4 1 a g k g 時(shí)，回收