（分析化學(xué)專業(yè)論文）動(dòng)物源性食品中磺胺和氟喹諾酮類獸藥殘留分析方法研究.pdf

摘要 摘要 本文共分四章。 第一章：文獻(xiàn)綜述，概括了動(dòng)物源性食品中獸藥殘留分析方法的現(xiàn)狀和進(jìn)展情況。 對(duì)磺胺類藥物和氟喹諾酮類藥物進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，詳細(xì)總結(jié)了樣品前處理技術(shù)和獸藥殘 留檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展情況，以及這些技術(shù)在動(dòng)物源性食品中磺胺類和氟喹諾酮類獸藥殘留 分析中的應(yīng)用。 第二章：本文建立了一種同時(shí)測(cè)定豬肉中3 種磺胺和7 種氟喹諾酮類藥物殘留量的 固相萃取一高效液相色譜法。樣品經(jīng)2 醋酸乙腈提取，正己烷脫脂，過e n v i 1 8 固相 萃取柱凈化。使用s h i m a d z u v p o d s ( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，5 r t m ) 色譜柱，以甲醇0 0 2m o l l 磷酸鹽緩沖液三乙胺系( 體積比為2 5 5 7 4 5 ，p h 2 8 0 ) 為流動(dòng)相，采用二極管陣列檢 測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。l o 種藥物在o 1 m g l - 5 0 m g l 濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于 0 9 9 9 9 。檢測(cè)限( l o d ) 為3 4 0 1 t g k g , - , 9 0 0 1 x g k g ，定量限( l o q ) 為11 3 3 1 a g k g 3 0 0 0 i t g k g 。 樣品的平均加標(biāo)回收率在6 9 1 0 4 之間，r s d 5 ( n - 3 ) 。 第三章：本文建立了高效液相色譜一二極管陣列檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定雞肉中磺胺類和氟 喹諾酮類獸藥殘留量的測(cè)量不確定度評(píng)定方法。通過建立數(shù)學(xué)模型，分析不確定度的來 源，對(duì)各不確定度分量進(jìn)行量化，給出了3 種磺胺和7 種氟喹諾酮類藥物測(cè)定結(jié)果的擴(kuò) 展不確定度。 第四章：本文建立了一種同時(shí)測(cè)定雞肉中3 種磺胺和7 種氟喹諾酮類藥物殘留量的 高效液相色譜一電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜方法( h p l c e s i m s m s ) 。樣品經(jīng)2 醋酸乙腈提取， 正己烷脫脂，過e n v i 1 8 固相萃取柱凈化。以乙腈和o 0 5 甲酸溶液作為流動(dòng)相，采用 梯度洗脫程序進(jìn)行液相色譜分離，質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行定性和定量分析。1 0 種藥物在 o 0 2 m g l , 一2 o m g l 濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0 9 9 8 8 。檢測(cè)限( l o d ) 為 1 1 0 腳 6 8 5 “g k g ，定量限( l o q ) 為3 6 8 “眺g 2 2 8 5 p g k g ，樣品的平均加標(biāo)回收率 在6 8 9 9 扣1 0 2 6 之間，r s d 8 6 ( 刀- 3 ) 。 關(guān)鍵詞動(dòng)物源性食品；獸藥殘留量；磺胺；氟喹諾酮；高效液相色譜；固相萃??；不 確定度：電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜 a b s t r a c t a b s t r a c t t h i st h e s i sc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r s i nc h a p t e ro n e ，t h ec u r r e n ts t a t ea n dd e v e l o p m e n to fa n a l y t i c a lm e t h o d so f v e t e r i n a r y r e s i d u e si na n i m a lf o o da r es u m m a r i z e d b a s e so fs u l f o n a m i d e sa n d f l u o r o q u i n o l o n e sa r ei n t r o d u c e db r i e f l y n em e t h o d so fs a m p l ep r e t r e a t m e n ta n dv e t e r i n a r y r e s i d u e sd e t e r m i n a t i o na r es u m m a r i z e ds y s t e m i c a l l ya n dt h e s em e t h o d sa p p l i e dt or e s i d u e a n a l y s i so fs u l f o n a m i d e sa n df l u o r o q u i n o l o n e sa sw e l l i nc h a p t e rt w o ，am e t h o dh a sb e e ne s t a b l i s h e df o rt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o n $ o fr e s i d u e so ft h r e es u l f o n a m i d e sa n ds e v e nf l u o r o q u i n o l o n e si np o r kb ys o l i d - p h a s e e x t r a c t i o na n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h es a m p l e sw e r ee x t r a c t e dw i t h2 a c e t i ca c i d a c e t o n i t r i l ea n dd e f a r e dw i t hn - h e x a n e ，t h e np u r i f i e db ya l le n v i - 18s o l i d p h a s e e x t r a c t i o nc o l u m n t h e v e t e r i n a r yd r u g s w e r e s e p a r a t e d o ns h i m a d z uv p - o d s ( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，5 1 x m ) c o l u m nu s i n gam o b i l ep h a s eo fm e t h a n o l - 0 0 2m o l lp h o s p h a t e b u f f e r - t r i e t h y l a m i n e ( v ，v = 2 5 5 7 4 5 ；p h 2 8 0 ) a n dd e t e c t e d 塒t 1 1d i o d e - a r r a yd e t e c t o r g o o d l i n e a r i t yw a si nt h er a n g ef r o m0 1 m g lt o5 0 m g la n dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r ea b o v e 0 9 9 9 9 1 1 1 el i m i t so fd e t e c t i o n ( l o d ) w e r e3 4 0 1 t g k g 9 o o r t g & ga n dt h el i m i t so f q u a n t i f i c a t i o n ( l o q ) w e r e11 3 3 p g k g - 3 0 o o p g k g n l cm e a nr e c o v e r i e so f1 0v e t e r i n a r y d r u g sr a n g e d f r o m6 9 t o10 4 誦mr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sb e l o w 5 伽= 3 ) i nc h a p t e rt h r e e ，a ne v a l u a t i n gm e t h o do fm e a s u r i n gu n c e r t a i n t yh a sb e e n e s t a b l i s h e df o rt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o n so fr e s i d u e so fs u l f o n a m i d e sa n d f l u o r o q u i n o l o n e si nc h i c k e nb yh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dd i o d e a r r a y d e t e c t i o n b ye s t a b l i s h i n gm a t h e m a t i c a lm o d e la n da n a l y z i n gt h es o u r c e so fu n c e r t a i n t y , t h e c o m p o n e n t so fu n c e r t a i n t yo fm e a s u r e m e n tw e r eq u a n t i z e da n de x p a n d e du n c e r t a i n t i e so f m e a s u r i n gr e s u l t so ft h r e es u l f o n a m i d e sa n ds e v e nf l u o r o q u i n o l o n e sw e r es h o w n i i lc h a p t e rf o u r , am e t h o dh a sb e e ne s t a b l i s h e df o r t h e s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n so fr e s i d u e so ft h r e es u l f o n a m i d e sa n ds e v e nf l u o r o q u i n o l o n e si nc h i c k e nb y n a b s t r a c t h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - e l e c t r o s p r a y t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ( m l c e s i - m s m s ) t h es a m p l e sw e r ee x t r a c t e d 研t 1 12 a c e t i c a c i d a c e t o n i t r i l ea n d d e f a r e d 謝mn - h e x a n e ，t h e np u r i f i e db ya ne n v i 一1 8s o l i d p h a s ee x t r a c t i o nc o l u m n t h e h p l cs e p a r a t i o nw a sp e r f o r m e dw i t hag r a d i e n te l u t i o np r o g r a mo fa c e t o n i t r i l ea n dw a t e r ( c o n t a i n i n g0 0 5 f o r m i ca c i d ) a sm o b i l ep h a s e t h ei d e n t i f i c a t i o na n dq u a n t i f i c a t i o nw e r e d o n ew i t hm a s ss p e c t r o m e t r y g o o dl i n e a r i t yw a si nt h er a n g ef r o mo 0 2 m g lt o2 0 m g la n d c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r ea b o v e0 9 9 8 8 t h el i m i t so fd e t e c t i o n ( l o d ) w e r e 1 1 0 l - l g k g - 6 8 5 “g k ga n dt h el i m i t so fq u a n t i f i c a t i o n ( l o q ) w e r e3 6 8 9 9 k g 2 2 8 5 1 x g k g t h em e a nr e c o v e r i e so f10v e t e r i n a r yd r u g sr a n g e df r o m6 8 9 t o10 2 6 w i t hr e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n sb e l o w8 6 伽= 3 ) k e y w o r d s ：a n i m a lf o o d ；v e t e r i n a r yr e s i d u e s ；s u l f o n a m i d e s ；f l u o r o q u i n o l o n e s ；h i 曲 p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ；s o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n ；u n c e r t a i n t y ；e l e c t r o s p r a y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y m 河北大學(xué) 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得 的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人 已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含為獲得河北大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所 使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的 說明并表示了致謝。 作者簽名：壹寶日期：上煎l 年月互日 學(xué)位論文使用授權(quán)聲明 本人完全了解河北大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó) 家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨颊?文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 本學(xué)位論文屬于 l 、保密口，在年月日解密后適用本授權(quán)聲明。 2 、不保密, o 。 ( 請(qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)方格內(nèi)打“”) 作者簽名：薹寶 導(dǎo)師簽名： 壺j 盔蔓 日期：塑1 年上月羔已一日 日期：趁畢年上月絲日 保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)聲明 ( 委宣 ) ，是河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院的( 二o o h )屆 (碩士) 研究生。 本人為獲得河北大學(xué)( 理孚頤士) 學(xué)位證書所提交的題目為： ( 糊原段銣中磺i 搟稚諾酮糟苘舳晰方法碗 ) 的( 理哮碩士 ) 學(xué)位論文，是我個(gè)人在導(dǎo)師(剎怠巖教授) 指 導(dǎo)并與導(dǎo)師合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在河北 大學(xué)所提供的研究經(jīng)費(fèi)及導(dǎo)師的研究經(jīng)費(fèi)資助下完成的。本人完全了解并 嚴(yán)格遵守中華人民共和國(guó)為保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)所制定的各項(xiàng)法律、行政法規(guī)以 及河北大學(xué)的相關(guān)規(guī)定。 本人聲明如下：本人以任何形式公開和傳播科研成果和科研工作時(shí)， 包括發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、學(xué)術(shù)交流、科技咨詢和科技成果轉(zhuǎn)讓等行為時(shí)，如 果涉及到本論文所包含的研究?jī)?nèi)容和研究成果，本人將征得指導(dǎo)教師 ( 文! i 黼教授) 和河北大學(xué)的書面同意和授權(quán)。如果違反本聲明，本人 承擔(dān)法律責(zé)任。 聲明人：簽名( 章) 姜寧 日期：2 0 脾了月胡且 第1 章緒論 第1 章緒論 摘要綜述了動(dòng)物源性食品中獸藥殘留分析方法的現(xiàn)狀和進(jìn)展情況。對(duì)磺胺類藥物和氟 喹諾酮類藥物進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，詳細(xì)總結(jié)了樣品前處理技術(shù)和獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展 情況，以及這些技術(shù)在動(dòng)物源性食品中磺胺類和氟喹諾酮類獸藥殘留分析中的應(yīng)用。 關(guān)鍵詞獸藥殘留；磺胺；氟喹諾酮；動(dòng)物源性食品；綜述 1 1 引言 近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)代化、集約化和規(guī)?；a(chǎn)的發(fā)展，獸藥得到了廣泛的 使用。目前，獸藥種類繁多，主要包括抗生素、合成抗菌素、抗寄生蟲藥、生長(zhǎng)促進(jìn)劑 和殺蟲劑等。這些獸藥在降低動(dòng)物發(fā)病率與死亡率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和改善產(chǎn)品質(zhì)量上起 到了非常重要的作用。但是，有些不法飼養(yǎng)者在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下非法濫用這些藥物， 造成殘留在動(dòng)物源性食品中的藥物超標(biāo)。獸藥殘留( r e s i d u e so f v e t e r i n a r yd r u g s ) 就是 指食品動(dòng)物用藥后，動(dòng)物產(chǎn)品的任何食用部分中與所有藥物有關(guān)的物質(zhì)的殘留，包括原 型藥物或和其代謝產(chǎn)物【l 】。雖然動(dòng)物源性食品中的獸藥殘留水平通常很低，但大多數(shù)獸 藥與醫(yī)藥完全相同，這種由于長(zhǎng)期和廣泛的非治療性用藥方式而導(dǎo)致的殘留問題會(huì)對(duì)食 用者的身體健康和生活環(huán)境產(chǎn)生一定的危害。獸藥殘留主要會(huì)產(chǎn)生各種慢性、蓄積毒性， 如“三致( 致癌、致畸、致突變) 力、免疫毒性、發(fā)育毒性和生態(tài)毒性等，對(duì)食用者的 身體健康和生活環(huán)境的危害往往具有隱蔽性，易造成實(shí)質(zhì)性和難以逆轉(zhuǎn)的危害【2 】，如氯 霉素可引起再生障礙性貧血，硝基咪唑類藥物具有致癌作用等。此外，盡管獸藥引起急 性中毒的可能性很小，但少數(shù)藥物如鹽酸克倫特羅( 瘦肉精) 殘留仍可引起人急性中毒， 甚至致人死亡。 獸藥殘留問題嚴(yán)重危害著人們的生命安全，世界各國(guó)都對(duì)獸藥殘留問題引起了高度 重視。歐美發(fā)達(dá)國(guó)家早在2 0 世紀(jì)8 0 年代就開始了這方面的研究，并制定了食品中獸藥 河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文 殘留的最高限量( m r l ) 和每日的攝入量( a d i ) 。而我國(guó)在2 0 世紀(jì)9 0 年代才開始這 方面的研究，起步相對(duì)較晚。2 0 0 2 年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)1 9 9 9 年發(fā)布的動(dòng)物性食品中獸 藥最高殘留限量進(jìn)行了修訂后，現(xiàn)已對(duì)2 2 8 種獸藥做出了相應(yīng)規(guī)定，而我國(guó)農(nóng)業(yè)部目 前頒布的獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)僅有3 9 種【l ，3 4 】。我國(guó)獸藥殘留監(jiān)控體系的不完善嚴(yán)重影響了 動(dòng)物源性食品的出口貿(mào)易，給我國(guó)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如，2 0 0 2 年，我國(guó)因出口 歐盟的水產(chǎn)品中被檢測(cè)出氯霉素殘留而遭到全面禁運(yùn)，損失就高達(dá)6 億多美元【5 】。因此， 發(fā)展可靠、靈敏和實(shí)用的殘留分析技術(shù)對(duì)于檢測(cè)和控制獸藥殘留、保證食用者安全和避 免國(guó)際間有關(guān)貿(mào)易爭(zhēng)端就顯得尤為重要。 1 2 磺胺類藥物和氟喹諾酮類藥物介紹 1 2 1 磺胺類藥物 磺胺類藥物( s u l f o n a m i d e s ，s a s ) 是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱 ( s a s 的基本結(jié)構(gòu)如圖1 1 ) 。s a s 一般為白色或微黃色結(jié)晶粉末，無臭，基本無味，因 為其結(jié)構(gòu)中含有伯氨基和磺酰胺基而呈酸堿兩性，可溶解于酸堿溶液中。由于其結(jié)構(gòu)中 帶有苯環(huán)，各種s a s 均具有紫外吸收。s a s 能夠通過干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)對(duì)對(duì)氨基苯甲酸 的利用而起到抑菌作用。從1 9 3 2 年發(fā)現(xiàn)至今，s a s 的種類可達(dá)數(shù)千種。其中，療效好、 毒副作用小的s a s 就有幾十種。由于抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉，s a s 在對(duì)于預(yù)防 和治療食源性動(dòng)物的細(xì)菌感染性疾病上得到了廣泛使用。近年來，該類藥物的濫用現(xiàn)象 非常嚴(yán)重。不管通過任何途徑，攝入的s a s 都會(huì)在人體中蓄積，其殘留能夠破壞人的造 血系統(tǒng)，產(chǎn)生白細(xì)胞減少癥、粒細(xì)胞減少癥，并可致溶血性貧血；引起人的過敏反應(yīng)， 嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)死亡；損害人的泌尿系統(tǒng)，出現(xiàn)血尿、疼痛、尿閉等癥狀。此外，不合 理的使用s a s 還能夠?qū)е略S多細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，從而影響臨床治療。由此可見，動(dòng)物源 性食品中的殘留磺胺對(duì)人類的身體健康會(huì)產(chǎn)生很大的危害。目前，國(guó)際食品法典委員會(huì) ( c a c ) 和歐美等大多數(shù)國(guó)家規(guī)定食品和飼料中的磺胺類藥物總量及磺胺二甲基嘧啶等 單個(gè)磺胺類藥物的含量不得超過1 0 0 p e , k g ，日本規(guī)定食品中不得檢出磺胺類藥物，而我 國(guó)規(guī)定所有食品動(dòng)物的肌肉、脂肪、肝、腎和牛羊奶中的磺胺類獸藥總量的m r l 為 1 0 0 9 9 k g ，牛奶中的磺胺二甲嘧啶的m r l 為2 5 k g 。截止到目前為止，我國(guó)農(nóng)業(yè)部已 第1 章緒論 發(fā)布了4 條關(guān)于動(dòng)物源性食品中磺胺類獸藥殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，包括了磺胺嘧啶( s d ) 、 磺胺間甲氧嘧啶( s m m ) 、磺胺地索辛( s d m ) 、磺胺二甲嘧啶( s m 2 ) 、磺胺甲氧嗪( s m p ) 、 磺胺甲嗯唑( s m z ) 、磺胺喹嗯啉( s q ) 和磺胺對(duì)甲氧嘧啶( s m d ) 共8 種磺胺類藥物， 均采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。 h 2 n 圖1 1s a s 的基本結(jié)構(gòu) f i g 1 - 1s t r u c t u r e so fs a s 1 2 2 氟喹諾酮類藥物 喹諾酮類藥物( q u i n o l o n e s ，q n s ) 是近2 0 年來迅速發(fā)展起來的一類十分重要的廣 譜抗生素，是繼磺胺類藥物之后人類在合成抗生素方面最重要的突破。q n s 均為白色或 淡黃色晶型粉末。游離酸形式一般易溶于稀酸、稀堿溶液和冰醋酸，在p h 6 8 的水中 溶解度最小，在甲醇、氯仿、乙醚等多數(shù)溶劑中難溶或不溶；鹽形式易溶于水，但不溶 于冰醋酸。由于多數(shù)q n s 在c 3 位含有羧基，c 7 位連接哌嗪等含氮堿性基團(tuán)，因此屬 酸堿兩性化合物。q n s 結(jié)構(gòu)中均含有苯并雜環(huán)或并雜環(huán)骨架和羰基、羧基、雜原子等生 色團(tuán)或助色團(tuán)組成的共軛體系，在紫外區(qū)具有特征性和強(qiáng)的吸收。其作用機(jī)理主要是它 在細(xì)菌體內(nèi)能夠選擇性的抑制在d n a 合成中起作用的兩種酶：拓?fù)洚悩?gòu)酶i i 和，從 而干擾了細(xì)菌d n a 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)重組，使細(xì)菌無法傳代而被抑制【6 】。此類藥物 抗菌作用強(qiáng)大，抗菌譜較廣，主要對(duì)抗革蘭氏陰性菌，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌也有相當(dāng)作用； 其表觀分布容積大，體內(nèi)的分布較廣，可進(jìn)入大多數(shù)藥物不能進(jìn)入的骨、關(guān)節(jié)和前列腺 組織等；副作用小( 無青霉素、氯霉素類所致的致命反應(yīng)) ，有較長(zhǎng)的p a e ( 抗菌后效 應(yīng)) 。 自從1 9 6 2 年第一個(gè)喹諾酮類藥物萘啶酸問世以來，喹諾酮類藥物已經(jīng)發(fā)展到第四 代。雖然第四代喹諾酮類藥物抗菌效果更好，但是價(jià)格較為昂貴，因此第三代喹諾酮類 藥物仍然是目前臨床應(yīng)用最多的主流產(chǎn)品。第三代喹諾酮類藥物的主要代表有環(huán)丙沙星 ( c 口) 、諾氟沙星( n o r ) 、依諾沙星( e n o ) 、培氟沙星( p e f ) 、氧氟沙星( o f l ) 、 r hn o i 卜i o 河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文 恩諾沙星( e n r ) 、洛美沙星( l o m ) 、麻保沙星( 眥) 等。在結(jié)構(gòu)上，第三代喹諾 酮類藥物的喹啉環(huán)( 個(gè)別為萘啶環(huán)) 的c 6 位上有氟原子，c 7 位上連接哌嗪基或吡咯 基，亦被稱為氟喹諾酮類( f l u o r o q u i n o l o n e s ，f q s ) 。其基本結(jié)構(gòu)如圖1 - 2 。與前兩代喹 諾酮類藥物相比，第三代抗菌譜更為擴(kuò)大，抗菌作用強(qiáng)、較低濃度即顯抗菌活性；可對(duì) 抗耐藥性葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)革蘭氏陰性菌療效更佳，而且價(jià)格適中，因此， 被廣泛地應(yīng)用到食源性動(dòng)物的飼養(yǎng)過程中【7 】。但是，f q s 在食源性動(dòng)物中的濫用和使用 不當(dāng)現(xiàn)象也很嚴(yán)重，造成f q s 殘留在動(dòng)物源性食品中，而其殘留可導(dǎo)致人體內(nèi)病原體的 耐藥性，而且某些f q s 具有潛在的致癌性，因此，其殘留問題已引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān) 注。歐盟( e u ) 和f a o w h o 食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)( j e c f a ) 規(guī)定了達(dá)氟沙星、 二氟沙星、恩諾沙星( 環(huán)丙沙星與恩諾沙星量之和) 、氟喹酸、麻保沙星、奧啉酸和沙 拉沙星在各種動(dòng)物組織中的m r l 分別為低于1 9 0 0 t g k g 和低于3 0 0 0j _ t g k g 。我國(guó)規(guī)定了 牛、雞、豬、羊等動(dòng)物組織中達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星( 環(huán)丙沙星與恩諾沙星量 之和) 、沙拉沙星等喹諾酮類獸藥的m r l 為1 0 - 1 9 0 0 p t g k g 。但是由于q n s 類藥物是在 近2 0 年才得到迅速發(fā)展與廣泛應(yīng)用的，所以，q n s 殘留分析與其它抗生素類藥物殘留 分析比較，起步也較晚。目前，q n s 類的多殘留分析的報(bào)道相對(duì)較少【8 一，一般只檢測(cè) 一兩種藥物【1 0 , 1 1 】，我國(guó)除農(nóng)業(yè)部于2 0 0 3 年“動(dòng)物性食品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢 測(cè)方法”外【1 2 】，q n s 多殘留檢測(cè)尚未頒布相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。 o o o h r l 圖1 - 2f q s 的基本結(jié)構(gòu) f i g 1 2s t r u c t u r e so ff q s 1 3 獸藥殘留分析技術(shù)及其在磺胺類和氟喹諾酮類藥物中的應(yīng)用 近年來，由于動(dòng)物源性食品中獸藥殘留問題得到了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注，獸藥殘留 第1 章緒論 分析技術(shù)也得到了迅速發(fā)展。獸藥殘留分析( d r u gr e s i d u ea n a l y s i s ) 屬于復(fù)雜基質(zhì)中痕 量組分的分析技術(shù)，既需要精細(xì)的微量操作手段，又需要高靈敏的痕量檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)代 獸藥殘留分析方法通常包括分離和檢測(cè)兩個(gè)基本方面，樣品分離是核心，按分析過程可 分為樣品前處理和測(cè)定兩部分【1 3 1 。以下分別對(duì)這兩部分的最新研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。 1 3 1 樣品前處理技術(shù) 動(dòng)物源性食品主要包括肌肉、脂肪、牛奶、禽蛋、肝、腎或皮膚等，樣品基質(zhì)復(fù)雜、 干擾物質(zhì)多，而且待測(cè)物質(zhì)濃度低，將藥物殘留從生物流體或生物基質(zhì)中釋放出來，除 去其中的干擾雜質(zhì)并達(dá)到儀器可檢測(cè)的濃度范圍十分困難。因此，樣品前處理技術(shù)一直 是分析檢測(cè)人員關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來，獸藥的種類和應(yīng)用規(guī)模劇增，化學(xué)組成日益復(fù)雜， 并日趨高效或低劑量化，使樣品前處理過程難度大大增加。上個(gè)世紀(jì)末，出現(xiàn)了一系列 新型的樣品前處理技術(shù)。與經(jīng)典的樣品前處理方法如液一液萃取、索式提取等相比，這 些新技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、高效，現(xiàn)己逐漸被應(yīng)用到獸藥殘留分析領(lǐng)域中。以下對(duì)這些樣品 前處理的新技術(shù)進(jìn)行分別介紹。 1 3 1 1 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) s p e 既可用于復(fù)雜樣品中微量或痕量目標(biāo)化合物的提取，又可用于凈化、濃縮或富 集，是目前獸藥殘留分析樣品前處理中的主流技術(shù)。與液液萃取相比，它不需要大量 互不相溶的溶劑，處理過程中不會(huì)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，而且采用高效、高選擇性的吸附劑( 固 定相) ，能顯著減少溶劑的用量，簡(jiǎn)化樣品的處理過程，同時(shí)減少所需費(fèi)用。 ( 1 ) 基本原理 s p e 就是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化 合物分離，然后通過洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。s p e 實(shí)質(zhì)上是一種液相色譜分離，其主要分離模式也與液相色譜相同，可分為正相( 吸附劑 極性大于洗脫液極性) ，反相( 吸附劑極性小于洗脫液極性) ，離子交換和吸附。固相萃 取所用的固定相也與液相色譜常用的固定相相同，只是在粒度上有所區(qū)別【1 4 1 。s p e 柱上 所加壓力一般都不大，分離目的只是把目標(biāo)化合物與干擾化合物和基體分開即可，柱效 要求一般不高，僅為l o 5 0 塔板m 2 ，故作為s p e 的填料都較粗，一般在4 0 9 m 左右即 可，粒徑分布要求也不嚴(yán)格，這樣可以大大降低固相萃取柱的成本，易操作，并且一次 河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文 性使用。 目前，s p e 柱已經(jīng)商品化，最常用的有s p e 柱( c a r t r i d g e ) 和s p e 盤( d i s k ) 。s p e 柱主要由柱管、篩板和固定相三部分組成。s p e 盤的外觀與膜過濾器十分相似，盤的直 徑通常為4 - - 9 0 m m ，使用時(shí)需與過濾裝置和抽濾裝置聯(lián)用。 ( 2 ) 操作程序 s p e 操作一般有四步：固定相活化、樣品上柱、淋洗和洗脫。 活化其目的是為了創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境和除去柱內(nèi)的雜質(zhì)。一般首先使用一種 強(qiáng)洗脫能力的溶劑( 始溶劑) 潤(rùn)濕和凈化s p e 柱，然后再用弱洗脫能力的溶劑( 終溶劑) 平衡s p e 柱。一般每1 0 0 m g 固定相用l 2 m l 溶劑平衡。 樣品上柱1 只s p e 的柱容量一般為固定相中重量的1 - 3 。在整個(gè)s p e 過程 中流速一般采用3 - 1 0 m l m i n ( 離子交換s p e 宜稍低) 。在能保證樣品溶解時(shí)應(yīng)盡可能用 弱溶劑溶解樣品，使組分在柱上有強(qiáng)保留( 最好在柱床起始部位形成一窄的譜帶) ，用 較小溶劑體積即可將組分洗脫，也可減少雜質(zhì)流出。 淋洗和洗脫淋洗是除去不需要的組分或雜質(zhì)，所用溶劑一般略強(qiáng)于或等于樣品 溶劑。洗脫溶劑必須謹(jǐn)慎選擇，以保證用較小體積的溶劑將組分洗脫下來，并且避免溶 劑太強(qiáng)洗出不必要的組分。使用混合溶劑是獲得適宜強(qiáng)度溶劑的有效方法。淋洗或洗脫 溶劑體積一般為0 5 o 8 m l 1 0 0 m g ，如淋洗和洗脫溶劑不互溶，則用空氣或氮?dú)鈱?duì)柱床 進(jìn)行干燥后再洗脫。 ( 3 ) s p e 的吸附劑 目前，應(yīng)用于s p e 的吸附劑種類繁多。比較常用的吸附型吸附劑有：活性炭、硅藻 土、硅酸鎂、氧化鋁等。就化學(xué)鍵合型硅膠而言，正相的有：氨基、腈基、二醇基等， 用于分析中等極性或非極性化合物；反相的有ic l 、c 2 、c 6 、c 8 、c 1 8 、腈基、環(huán)己基、 苯基等，用于分析極性化合物；離子交換型的有：季胺基、氨基、二氨基、苯磺酸基、 羧基等，用于分析離子型化合物0 5 】。 此外，近些年來，一些新型的聚合物吸附劑得到了很快的發(fā)展。 親水親脂平衡型固相吸附劑其表現(xiàn)出來的親水和親脂特性使它能夠在水中保 持濕潤(rùn)，并對(duì)極性和非極性化合物有很寬的適用范圍。該類產(chǎn)品中應(yīng)用較為廣泛的是 w a t e r s 公司的o a s i sh l b 、o a s i sm a x 、o a s i sm c x 。例如，o a s i sh l b 是由親脂性的二 第1 章緒論 乙烯基苯和親水性的n 乙烯基吡咯烷酮兩種單體共聚而成的大孔共聚物，它的吸附容 量大，一般可達(dá)c 1 8 鍵合硅膠的5 倍，可用于水溶液中的非極性組分的萃取。o a s i sm a x 是三甲基胺丙基取代的二乙烯基苯和n 乙烯基吡咯烷酮的共聚物，由于引入了季氨基， 所以它具有陰離子交換性，可吸附酸性化合物。o a s i sm c x 是磺酸基取代的二乙烯基苯 和n 乙烯基吡咯烷酮的共聚物，具有陽(yáng)離子交換性，可吸附堿性化合物。 非極性聚合物吸附劑其基本材料大多為苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。例如， e m p o r e 公司的s d b r p s 固相萃取柱，由于連有酸性硫酸基，而具有陽(yáng)離子交換性。 分子印跡聚合物( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r s ，m i p ) 吸附劑這種吸附劑以 待測(cè)化合物為模板分子，采用分子印跡技術(shù)合成出來，與待測(cè)化合物具有高度的選擇性。 ( 4 ) s p e 技術(shù)在磺胺類獸藥殘留分析中的應(yīng)用 文獻(xiàn)中報(bào)道的用于分析動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物的s p e 柱主要有以下幾種： c 1 8 s p e 柱劉鐵錚等【1 6 1 采j 羽o d s c 1 8 s p e 柱凈化雞蛋中7 種磺胺類藥物，樣品經(jīng)二 氯甲烷提取、正己烷萃取、上s p e 柱凈化，凈化效果良好，回收率為7 3 2 1 0 2 6 。 堿性氧化鋁s p e 柱侯曉林等【1 7 】在測(cè)定魚肌肉中磺胺二甲嘧啶及其代謝產(chǎn)物時(shí)， 采ns e p p a k 堿性氧化鋁s p e 柱凈化樣品：樣品經(jīng)乙腈提取、正己烷脫脂后，上堿性氧化 鋁s p e 柱凈化，樣品中的雜質(zhì)不干擾測(cè)定，操作簡(jiǎn)單，回收率高于8 0 。 o a s i sh l bs p e 柱m i n g - r e ns f u h 等1 18 】采用乙腈提取肉類樣品中的8 種磺胺類藥 物后，先用s e p - p a ka l u m i n an 柱進(jìn)行樣品凈化，再上預(yù)先用甲醇、水和5 0 的乙酸溶液 活化好的o a s i sh l bs p e 柱，用水淋洗雜質(zhì)，用甲醇洗脫磺胺類藥物。由于采用了兩種 s p e 柱對(duì)樣品進(jìn)行了凈化，有效的去除了雜質(zhì)，回收率為8 0 - - - 9 7 。 o a s i sm c xs p e 柱熊芳等1 1 9 對(duì)動(dòng)物肝中的4 種磺胺類藥物采用乙腈。氯仿混合液 ( 1 ：1 0 ，v v ) 提取、正己烷萃取。o a s i sm c xs p e 柱用甲醇、水和0 0 3 m o 兒h c l 預(yù)處理 后，上樣，采用5 氨化甲醇進(jìn)行洗脫。操作簡(jiǎn)便，凈化效果理想。 硅膠s p e 柱董丹等【2 0 】采用硅膠s p e 柱凈化殘留在雞肉中的1 7 種磺胺類藥物：雞 肉樣品經(jīng)乙腈提取、正己烷萃取。提取液蒸干后，用正己烷和三氯甲烷混合液溶解，上 樣到硅膠s p e 柱上。由于1 7 種磺胺類藥物的極性范圍較寬，通過比較，選擇甲醇丙酮 ( 1 ：1 ，v v ) 混合液和丙酮作為洗脫液即可將所有藥物完全洗脫，回收率為5 2 3 1 2 4 9 。 河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文 量魯詈量詈量詈量暑詈置皇葛! 曼詈皇詈墨, ( 5 ) s p e 技術(shù)在氟喹諾酮類獸藥殘留分析中的應(yīng)用 文獻(xiàn)中報(bào)道的用于分析動(dòng)物源性食品中氟喹諾酮類藥物的s p e 柱主要有以下幾種： c 1 8 s p e 柱n v a nh o o f 等t 2 1 1 建立了一種同時(shí)測(cè)定牛肉、牛奶和水產(chǎn)品中8 種喹諾 酮類藥物的分析方法。牛肉和水產(chǎn)品用水進(jìn)行提取，牛奶采用2 0 - - 氯乙酸的甲醇溶液 去除蛋白，再用水反萃取喹諾酮類藥物。各種樣品分別注入由甲醇和水活化好的c 1 8 s p e 柱上，采用甲醇水( 2 0 ：8 0 ) 和正己烷淋洗，1 三氟乙酸的乙腈溶液進(jìn)行洗脫。凈化方 法簡(jiǎn)單、快捷，而且適用于三類不同的樣品。 o a s i sh l bs p e 柱a r u b i e s 等【2 2 1 采用裝有o a s i sh l b 吸附劑的9 6 孔盤式s p e 系統(tǒng) 同時(shí)凈化了牛肉中的9 種氟喹諾酮類藥物。牛肉用水提取后，注入預(yù)先用甲醇和水活化 好的盤式s p e 裝置上，采用水和正己烷分別淋洗，甲醇進(jìn)行洗脫。由于盤式s p e 裝置可 以同時(shí)處理多個(gè)樣品，不僅凈化效果好，而且大大地縮短了樣品處理的時(shí)間。 s d b r p ss p e 柱s b a i l a c 等【2 3 建立了種同時(shí)測(cè)定雞肉中7 中喹諾酮類藥物的方 法，研究了o a s i sh l b 、o a s i sm a x 和s d b r p s = 種不同的s p e 柱的凈化效果。采用o a s i s h l b 時(shí)，雜質(zhì)干擾達(dá)氟沙星的測(cè)定；采用o a s i sm a x 時(shí)，環(huán)丙沙星的回收率偏低；采用 s d b - r p s ，去除了雜質(zhì)的干擾，回收率高。因此，最終選擇s d b r p ss p e 柱凈化雞肉樣 品。 m i s p e 柱e s t e rc a r o 等【2 4 1 以恩諾沙星為模板分子，采用非共價(jià)法合成了分子印 跡聚合物，并將其裝入固相萃取柱中，通過優(yōu)化固相萃取條件，使得這種聚合物對(duì)恩諾 沙星和環(huán)丙沙星具有高度的選擇性。實(shí)驗(yàn)中，他們采用分子印跡固相萃取柱和o a s i sh l b 柱聯(lián)用的兩步固相萃取方案對(duì)尿樣和動(dòng)物組織樣品進(jìn)行凈化，并用高效液相色譜法同時(shí) 測(cè)定了恩諾沙星和環(huán)丙沙星。結(jié)果表明，樣品中的干擾物幾乎不影響測(cè)定，而且測(cè)定水 平均低于歐盟規(guī)定的食源性動(dòng)物中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的最大允許殘留量。 1 3 1 2 基質(zhì)固相分散技術(shù)( m a t r i xs o l i dp h a s ed i s p e r s i o ne x t r a c t i o n ，m s p d ) m s p d 是b a r k e r 等【2 5 】在1 9 8 9 年提出并給予理論解釋的一種快速樣品處理技術(shù)。其基 本操作是將樣品( 固態(tài)或液態(tài)) 直接與適量反相鍵合硅膠一起混合研磨，使樣品均勻分 散于固定相顆粒的表面，制成半固態(tài)裝柱，然后采用類似于s p e 的操作進(jìn)行洗脫。所用 的填充料一般為c l s 或c 8 ，樣品和填充料的比例通常為1 ：4 。m s p d 是一種在s p e 的基礎(chǔ) 上改進(jìn)后的樣品處理方法，與s p e 相比，它的優(yōu)點(diǎn)在于：它依靠填料顆粒的機(jī)械剪切力、 第1 章緒論 c 1 8 鍵合相的去垢作用和巨大的表面積使樣品結(jié)構(gòu)破碎并且在填料表面均勻分散，濃縮 了傳統(tǒng)的樣品前處理中所需的樣品勻漿、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等過程，避免了樣 品勻漿、轉(zhuǎn)溶、乳化、濃縮造成的待測(cè)物損失，而且固定相處理樣品的比容量大，提取 凈化的效率較高。 m s p d 處理樣品速度快、溶劑和樣品用量少，引起獸藥殘留分析界的廣泛關(guān)注，在 b a r k e r 等提出m s p d 后的數(shù)年間，該方法已被用于近4 0 種的獸藥殘留分析，如四環(huán)素類、 磺胺類、苯并咪唑類藥物等。耿志明等1 2 6 j 在測(cè)定魚肉中殘留的7 種磺胺類藥物時(shí)，采用 了m s p d 技術(shù)。將樣品與c 1 8 填料研磨、裝柱后，用正己烷洗去樣品中的脂溶性雜質(zhì)，二 氯甲烷作為洗脫液，獲得了理想的凈化效果。k u n i h i r ok i s h i d a 等【2 7 】在測(cè)定雞肉中殘留的 6 種磺胺類藥物時(shí)，采用中性氧化鋁作為m s p d 的吸附劑凈化樣品，7 0 乙醇水溶液作為 洗脫液。不僅洗脫液毒性小、凈化效果好，而且回收率高、重現(xiàn)性好。 1 3 1 3 超臨界流體萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) ， s f e 是利用在臨界壓力和臨界溫度以上的流體具有特異性增加的溶解能力，而發(fā)展 出來的分離新技術(shù)。該技術(shù)以超臨界流體為溶劑，利用該狀態(tài)下的流體具有高滲透能力 和高溶解能力進(jìn)行非極性混合物的萃取分離。與傳統(tǒng)的提取方法相比，s f e 具有萃取過 程易于調(diào)節(jié)、速度快、萃取效率高、選擇性強(qiáng)、易于凈化、無溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。超臨界 流體是溫度與壓力均超過其臨界點(diǎn)之上的流體，性質(zhì)介于氣體和液體之間，其密度與液 體相似，粘度和擴(kuò)散系數(shù)與氣體相接近，而且表面張力小，易于滲透進(jìn)入樣品中。故超 臨界流體具有很高的溶解能力及良好的流動(dòng)、傳遞、滲透性能，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有毒、易 燃、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑。c 0 2 是最常用的超臨界流體，它可萃取非極性和中等極性的物 質(zhì)。對(duì)于極性較強(qiáng)的組分，則需要在c 0 2 中加入適量的極性溶劑充當(dāng)改良劑以提高流體 的極性，或采用極性的超臨界流體，如n 2 0 、n h 3 等。近些年來，s f e 技術(shù)在獸藥殘留分 析的樣品處理方面得到了一定的應(yīng)用。r o b e r tj m a x w e l l 等【2 8 】建立了一種同時(shí)測(cè)定雞肝中 a m 磺胺類藥物的方法。凈化雞肝樣品時(shí)，選擇c 0 2 作流體，在1 0 0 0 0 p s i 、4 0 ( 2 的條件下 進(jìn)行超臨界流體萃取，磺胺類藥物被提取后吸附于中性氧化鋁柱上，經(jīng)流動(dòng)相洗脫后， 采用h p l c 測(cè)定，獲得了較高的回收率：7 1 4 9 8 2 。 1 3 1 4 微波輔助萃取( m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n ，m a e ) m a e 就是利用極性分子可迅速吸收微波能量來加熱一些具有極性的溶劑，如乙醇、 河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文 甲醇、丙酮或水等，從而促進(jìn)溶劑萃取。因非極性溶劑不能吸收微波能量，所以在微波 萃取中不能使用1 0 0 的非極性溶劑作為萃取溶劑。一般可在非極性溶劑中加入一定比 例的極性溶劑來使用，如丙酮和環(huán)己烷( 體積比= 1 ：1 ) 就可用來作微波萃取溶劑。與其 它方法相比，m a e 具有萃取時(shí)間短、試劑用量少、污染低、回收率高和能自動(dòng)控制等優(yōu) 點(diǎn)，因此引起了廣泛關(guān)注。m p h e r m o 等【2 9 】在測(cè)定豬肉中殘留的8 種喹諾酮類藥物時(shí)， 分別采用傳統(tǒng)的液固萃取技術(shù)和m a e 技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行提取后過s p e 柱凈化。與傳統(tǒng)的液 固萃取技術(shù)相比，采用m a e 技術(shù)進(jìn)行萃取，樣品中雜質(zhì)少，凈化效果好，靈敏度高， l o d 和l o q 均低于歐盟規(guī)定的m r l 值。 1 3 1 5 免疫親和色譜( i m m u n o a f f m i t yc h r o m a t o g r a p h y ，i a c ) i a c 是一種利用抗原抗體特異性可逆結(jié)合特性的技術(shù)，根據(jù)抗原抗體的特異性親合 作用，從復(fù)雜的待測(cè)樣品中捕獲目標(biāo)化合物。其原理是將抗體與惰性微珠共價(jià)結(jié)合，然 后裝柱，將含抗原的溶液過免疫親和柱，抗原與固定了的抗體結(jié)合，而非目標(biāo)化合物則 沿柱流下，最后用洗脫緩沖液洗脫抗原，從而得到純化的抗原。i a c 的最顯著優(yōu)點(diǎn)在于 對(duì)待測(cè)物的高效、高選擇性保留能力，特別適用于復(fù)雜樣品極稀組分的凈化與富集。l i j s 等【3 0 】采用了i a c 技術(shù)對(duì)豬肉中磺胺類藥物進(jìn)行檢測(cè)。利用抗磺胺類藥物的簇特異性 抗體制備免疫親合柱，能夠同時(shí)提取復(fù)方磺胺甲嗯唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺 喹嗯啉等8 種磺胺類藥物，用紫外檢測(cè)的反相液相色譜法測(cè)定了豬肉中添加1 0 - 1 0 0 “g k g 的磺胺類藥物時(shí)的回收率，在7 0 8 9 4 1 ，檢測(cè)限達(dá)到1 - 2 t g k g 。