免疫組化雙重染色技術(shù).ppt

1 第八章 免疫組化雙重染色技術(shù) Doublestainingtechnologyinimmunohistochemistry 用免疫組化方法在同一張組織切片上同時(shí)顯示兩種或兩種以上的抗原 以發(fā)現(xiàn)其定位 形態(tài)和功能上的相互關(guān)系 一 連續(xù)切片雙重染色法A 最簡單最可靠 用同樣的免疫組化方法 在兩張相鄰切片上各顯示一種抗原 然后比較 由于每張切片上只進(jìn)行一次染色 所以不會(huì)互相干擾或出現(xiàn)假性雙標(biāo)記 B 切片厚度1 3 m 如果較厚如神經(jīng)組織切片 10 20 m 可以采用 鏡像 法 即相鄰切片翻轉(zhuǎn)后貼在載玻片上 或利用軟件PS 2 二 免疫熒光雙重染色法 用不同的熒光色素標(biāo)記不同的抗體 染色后觀察 相應(yīng)的抗原物質(zhì)顯示不同的顏色 A 直接法 1 一步法 將FITC 490 495 520 530nm 黃綠色熒光 和TRITC 550 620nm 紅色熒光 分別標(biāo)記的兩種抗體按一定比例混合 使每個(gè)抗體均為最適稀釋度 然后孵育切片 2 二步法 先后依次使用兩種熒光抗體分別孵育切片 3 3 觀察 同一個(gè)視野里 a 對(duì)每一種熒光標(biāo)記物 綠色或紅色 使用不同的濾色板進(jìn)行觀察和照相 每張照片顯示一種熒光 比較兩張照片 b 兩種熒光重疊照相 則在一張照片上可發(fā)現(xiàn)分別含不同抗原的細(xì)胞 呈綠色或紅色 如果兩種抗原存在于同一個(gè)細(xì)胞或結(jié)構(gòu) 則呈現(xiàn)兩種紅綠熒光的混合色 如黃色 免疫熒光雙重染色法 FITC綠色 TRITC紅色 混合色為黃色 4 B 間接法 1 兩種一抗不標(biāo)記 但來自不同種屬的動(dòng)物如兔和豚鼠 2 兩種來源于同種動(dòng)物或不同種動(dòng)物的二抗 如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠IgG 或羊抗 兔IgG和豬抗豚鼠IgG 分別以FITC和TRITC標(biāo)記 3 染色程序 a 先用第一種一抗和相應(yīng)的標(biāo)記二抗依次孵育切片 顯示第一種抗原 然后再用第二種一抗和相應(yīng)的標(biāo)記二抗依次孵育切片 顯示第二種抗原 b 將兩種一抗混合后孵育切片 再將兩種標(biāo)記的二抗混合后孵育切片 最后用熒光顯微鏡觀察 5 免疫熒光雙重染色法 FITC綠色 TRITC紅色 混合色為黃色 6 Y WLin USP26stainedbyAlexaFluor488andMycstainedbyAlexaFluor594inCOS7cells NucleiwerestainedbyHoechstblue 7 三 免疫酶雙重染色A 單酶法 1 原理 a 用一種酶如HRP標(biāo)記顯示兩種不同的抗原 但用不同的電子供體如DAB和CN呈現(xiàn)不同顏色的反應(yīng)終產(chǎn)物 b 兩種一抗來自同種屬動(dòng)物 兩重染色之間需將第一次染色反應(yīng)中的各級(jí)抗體和酶或各級(jí)抗體 酶和反應(yīng)產(chǎn)物從組織上洗脫 c 連續(xù)做兩次染色 所費(fèi)時(shí)間較長 8 抗體 酶和反應(yīng)產(chǎn)物洗脫 9 2 染色的最佳條件 先對(duì)兩種待檢抗原分別染色 以決定合適的抗體稀釋度和反應(yīng)條件等 3 雙重染色的先后次序 a 先顯示含量較少的抗原 b 先顯示容易受染色過程和洗脫過程影響的組織抗原 c 先用不太敏感的抗體 d 先用DAB顯色 4 對(duì)照試驗(yàn) a 單染對(duì)照 b 在進(jìn)行第二次染色前 要證明第一次染色的各級(jí)抗體和酶活性被完全除去 而且洗脫后對(duì)第二個(gè)待檢抗原無影響 10 5 抗體洗脫 a 酸洗法 pH2 2甘氨酸 HCl緩沖液 可加入適量二甲基甲酰胺 DMF 1 4小時(shí)使抗原 抗體復(fù)合物解離 b 氧化法 2 5 KMnO4 5 H2SO4 DDH2O 1 4 10 260 1分 氧化除去抗體 0 5 Na2S2O5漂白液脫色 第一次染色用CN顯色 并注意對(duì)第二種抗原的影響 c 甲醛蒸氣法 1升容器 3g多聚甲醛 切片 置80 烤箱1 4小時(shí) 蒸汽破壞抗體的Ig結(jié)合部位 第一次用ABC法 氧化法洗脫抗體 對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)此為假性雙標(biāo) 11 6 具體操作步驟 a 方法1 第一次染色后 除去抗體和酶而使有色反應(yīng)終產(chǎn)物留在抗原部位 再用同樣方法進(jìn)行第二次染色 切片處理 抑制內(nèi)源性酶及正常血清封閉同前 用PAP法完成第一次染色 CN H2O2顯色 TBS洗兩次 每次5 10分 氧化法洗脫 TBS洗如上 用PAP法完成第二次染色 0 05 DAB 0 01 H2O2顯色 TBS洗如上 甘油膠封片 12 一抗來自同種動(dòng)物的單酶法免疫酶雙重染色 13 大鼠垂體前葉促性腺激素細(xì)胞 藍(lán)色 和生長激素細(xì)胞 棕色 免疫酶 PAP法 雙重染色 14 b 方法2 第一次染色后 照相記錄結(jié)果并記住照相視野的部位 用有機(jī)溶劑將反應(yīng)終產(chǎn)物溶解除去 并將第一次染色形成的抗體復(fù)合物洗脫掉 然后進(jìn)行第二次染色 對(duì)同一部位再一次照相 比較先后照相所得照片 切片處理同上 用PAP法完成第一次染色 CN H2O2顯色 TBS洗兩次 每次5 10分 以TBS封片 照相 注意隨時(shí)從蓋片邊緣補(bǔ)加TBS 防止切片干燥 去蓋片 TBS洗 再用酒精 二甲苯 酒精處理 除去CN藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物 DDH2O洗 氧化法洗脫 然后TBS洗兩次如前 PAP法完成第2次染色 0 05 DAB 0 01 H2O2或CN H2O2顯色 TBS洗同上 封片 找出第一次照相的部位 再次照相 15 大鼠垂體前葉GnRH相關(guān)肽陽性細(xì)胞 左 藍(lán)色 與促性腺激素細(xì)胞 右 棕色 為同一種細(xì)胞 免疫酶 PAP法 雙重染色 16 B 雙酶法 1 原理 a 用兩種無關(guān)的酶分別標(biāo)記顯示兩種抗原 常用的酶為HRP和AKP 或HRP和葡萄糖氧化酶 b 兩種一抗來源于不同種屬的動(dòng)物 如兔和小鼠 或同種動(dòng)物 如小鼠 的兩種單克隆抗體 但其Ig亞類不同 如IgGl和IgG2a c 兩種二抗分別是抗兔IgG和抗小鼠IgG 或抗小鼠IgGl和抗小鼠IgG2a 可以來自同種屬動(dòng)物或不同種屬動(dòng)物 可以是酶標(biāo)抗體 一個(gè)用HRP 另一個(gè)用AKP標(biāo)記 也可以是未標(biāo)記抗體 一個(gè)用兔PAP 另一個(gè)用小鼠APAAP 17 c 可避免抗體殘留而引起的假性雙標(biāo)記 不需中間洗脫處理 由于無交叉反應(yīng) 可將兩重染色的同一層抗體混合同時(shí)使用并先后顯示兩種酶的活性 在同一張切片上獲得不同顏色的反應(yīng)終產(chǎn)物 如棕色和藍(lán)色 如兩種抗原共存于同一個(gè)細(xì)胞 則出現(xiàn)灰紫色的混合色 18 2 染色的最佳條件 先對(duì)兩種待檢抗原分別染色 以決定合適的抗體稀釋度和反應(yīng)條件等 3 雙重染色的先后次序 先顯示HRP 再顯示AKP或葡萄糖氧化酶 4 對(duì)照試驗(yàn) a 單染對(duì)照 b 必需排除兩套抗體系統(tǒng)之間的交叉反應(yīng) 如第二種羊抗兔IgG二抗可能與第一種小鼠IgG一抗結(jié)合而出現(xiàn)假性雙標(biāo)記 因此應(yīng)事先做抗體進(jìn)行交叉染色實(shí)驗(yàn) 19 5 染色步驟 以先后使用PAP法和APAAP法為例 a 切片處理 抑制內(nèi)源性酶及正常血清封閉如前 b 兩種一抗混合液 各自稀釋度由單染色決定 室溫30分或4 過夜 TBS洗兩次 每次5 10分 c 兩種二抗混合液 各自稀釋度由單染色決定 室溫30分 TBS洗同上 d PAP和APAAP混合液 各自稀釋度由單染色決定 室溫30分 TBS洗同上 e 顯示HRP 如用0 05 DAB 0 01 H2O2 鏡下控制染色 TBS洗同上 f 顯示AKP 如用萘酚AS MX磷酸鹽加固藍(lán)BB 鏡下控制染色 TBS洗同上 g 甘油膠封片 20 6 注意事項(xiàng) a 過厚切片 7 m 可能出現(xiàn)混合色 雙標(biāo)記 的假象 b APAAP法中緩沖液用TBS而不用PBS 或至少在顯示酶活性的一步中用TBS c 內(nèi)源性AKP一般不會(huì)引起問題 d 正常血清封閉用兩種二抗來源動(dòng)物的正常血清 四 免疫酶 免疫熒光雙重染色法 首先用免疫酶法顯示第一種抗原 然后用間接免疫熒光法定位第二種抗原 若兩個(gè)一抗來自同一動(dòng)物 需要注意可能發(fā)生的交叉反應(yīng) 21 五 免疫酶 免疫金 銀 雙重染色法 A 免疫酶 免疫金雙重染色法 1 用PAP法顯示第一種抗原 為了加強(qiáng)與膠體金的紅色的對(duì)比 用CN顯色 藍(lán)色 如該抗原存在于神經(jīng) 則用DAB顯色 2 用酸洗法洗脫第一次染色的抗體復(fù)合物 繼之用IGS法顯示第二種抗原 在光鏡下監(jiān)視染色 直到出現(xiàn)滿意的紅色為止 3 用PAP法后再用IGS法 可防止標(biāo)記在二抗的膠體金顆粒與抗體一起洗脫掉 金標(biāo)抗體穿透組織能力差 常需用較大的一抗和金標(biāo)抗體濃度并提高其穿透力 22 B 免疫酶 免疫金銀雙重染色法 1 用IGSS法顯示第一種抗原 用5nm小顆粒膠體金