細(xì)菌的噬菌體.ppt

細(xì)菌的噬菌體 一 一般性狀 侵染細(xì)菌的病毒稱為細(xì)菌的噬菌體 簡稱噬菌體 噬菌體由核酸和蛋白質(zhì)外殼構(gòu)成 噬菌體有絲狀的 球狀的 但大多數(shù)為蝌蚪狀的 蝌蚪狀噬菌體 噬菌體的侵染 噬菌體接觸到對它敏感的細(xì)菌時(shí) 它以尾部末端吸附細(xì)菌 其中DNA通過尾部注入到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi) 蛋白質(zhì)外殼還留在細(xì)菌體外 注入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的DNA 控制和改變了細(xì)菌的代謝活動 并在其中復(fù)制噬菌體的DNA和蛋白質(zhì)外殼 然后組成新的噬菌體 細(xì)菌就全部消解并釋放新噬菌體 噬菌體的侵染 噬菌體的侵染 噬菌斑 培養(yǎng)的細(xì)菌被侵染后就會發(fā)生明顯變化 原來混濁的細(xì)菌懸浮液就會變清 在瓊脂平板上的細(xì)菌就會出現(xiàn)無菌的透明斑 稱為 噬菌斑 噬菌體都有一定的寄生范圍 有的寄生范圍廣 可以侵染一個(gè)屬中不同種的細(xì)菌 甚至不同屬的細(xì)菌稱為多價(jià)噬菌體 有的寄生范圍窄 僅能侵染同一種細(xì)菌 甚至種內(nèi)的一個(gè)菌系 稱為單價(jià)噬菌體 前者在研究細(xì)菌親緣關(guān)系有作用 后者在細(xì)菌的鑒定上應(yīng)用 噬菌體的侵染范圍 二 研究方法 噬菌體的分離噬菌體的純化噬菌體的繁殖噬菌體的保存 1 噬菌體的分離 噬菌體的存在與寄主細(xì)菌有關(guān) 一般從寄主細(xì)菌所在的場所可以分離獲得 植物病原細(xì)菌的噬菌體 可從感病植株的感病部位 病殘?bào)w或者感病植株生長的土壤中分離獲得 在土壤中分離時(shí) 因?yàn)橥寥乐须s菌較多 分離的噬菌體也可能不是單價(jià)的噬菌體 這時(shí)需要進(jìn)行目標(biāo)菌的誘發(fā) 即把目標(biāo)菌倒入土壤中 過一段時(shí)間后 再從土壤中分離噬菌體 分離舉例 病組織提取液獲得 將病組織切碎加水研磨 濾紙過濾 濾液5ml加入試管中 加1 2ml氯仿 加塞充分搖勻 靜止30 60min 待分層 用滅菌吸管取上層液作平板分離瓊脂平板分離 提取液1 2ml和濃細(xì)菌懸浮液 109 ml 1ml加入培養(yǎng)皿中混合 再加入45 肉汁胨培養(yǎng)基 或其他培養(yǎng)基 待培養(yǎng)基凝固后 26 28 培養(yǎng) 如果有噬菌體 10 12小時(shí)后 瓊脂平板上即可見噬菌斑 如果從土壤中分離 可用樣本加水提取 離心 上清液1ml接種到30ml培養(yǎng)液中 內(nèi)接1ml濃細(xì)菌液 25 過夜 離心除去細(xì)菌 氯仿處理 平板分離 分離液中的雜菌去除 氯仿處理 濾液 氯仿 5 20 1 搖勻 靜止分層 取上清液作分離用 離心處理 6000 8000轉(zhuǎn) 分 10分鐘 可除去分離物中大部分雜菌 細(xì)菌濾器過濾 用5 6號細(xì)菌濾器過濾 此方法也會使噬菌體減少 加熱處理 噬菌體的致死溫度一般高于細(xì)菌 可用55 60 處理提取液 以殺死細(xì)菌而不影響噬菌體 以上方法可以根據(jù)情況確定 有時(shí)需要幾種方法配合使用 平板分離 分離噬菌體的培養(yǎng)基 一般選用寄主細(xì)菌生長良好的培養(yǎng)基 固體和液體培養(yǎng)基均可 細(xì)菌菌齡 分離所用的細(xì)菌菌齡對噬菌體的繁殖影響很大 最好用對數(shù)生長期前的細(xì)菌 一般24 48小時(shí) 分離方法 1 提取液和細(xì)菌懸浮液混合涂抹于瓊脂平板表面 2 提取液 細(xì)菌懸浮液和45 瓊脂培養(yǎng)基混合 放置 26 28 培養(yǎng) 10 12小時(shí)后 瓊脂平板上即可見噬菌斑 2 噬菌體的純化 從一個(gè)樣本分離獲得的噬菌體 可能不是同一個(gè)噬菌體 需要進(jìn)一步純化 噬菌體的純化和細(xì)菌的純化相似 噬菌斑就相當(dāng)于細(xì)菌的菌落 純化的方法是選擇單個(gè)噬菌斑 用挑針刺一下 洗在約1ml滅菌的0 1 蛋白胨液中 就有足夠的噬菌體 一個(gè)噬菌斑的噬菌體量很大 直徑約2mm的噬菌體數(shù)量可達(dá)107 109個(gè)噬菌體 配成的噬菌體懸浮液 按1 10的比例用0 1 蛋白胨水稀釋若干次 然后用瓊脂平板法培養(yǎng) 即可得到純的噬菌體 3 噬菌體的繁殖 純化的噬菌體 繁殖后可用于性狀的測定和保存 一般用三角瓶液體振蕩培養(yǎng)寄主細(xì)菌 培養(yǎng)24 48小時(shí)后 接種一小塊噬菌斑 再繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間 待混濁的細(xì)菌懸浮液變清后 用細(xì)菌濾器過濾 除去殘留的細(xì)菌 即為噬菌體懸浮液 4 噬菌體效價(jià)測定 噬菌體的效價(jià)是指噬菌體的濃度 或者每毫升含噬菌體的數(shù)量 效價(jià)測定 將樣本按1 10的比例稀釋6 8次 在滅菌培養(yǎng)皿中加入不同倍數(shù)的稀釋液 再加入濃細(xì)菌液和45 的培養(yǎng)基 培養(yǎng)12小時(shí) 檢查噬菌斑的多少 一個(gè)噬菌斑被認(rèn)為是由一個(gè)噬菌體繁殖起來的 噬菌斑 5 細(xì)菌的鑒定 噬菌體用于鑒定之前 必須測定其寄主范圍 測定時(shí)使用寄主和地理來源相近的菌株 單價(jià)噬菌體 只能侵染原來用于分離的寄主細(xì)菌 這類噬菌體就只能用于這類細(xì)菌的鑒定 分布等方面研究 多價(jià)噬菌體 能侵染多種細(xì)菌 往往用幾個(gè)多價(jià)噬菌體組合 研究不同細(xì)菌間的親緣關(guān)系 鑒定方法 1 噬菌體樣本多時(shí)的測定方法 噬菌體樣本較多時(shí)使用此方法 在平板上先用涂抹棒接上目標(biāo)細(xì)菌 橫向涂抹 細(xì)菌生長24小時(shí)后 再縱向涂抹不同的噬菌體樣本 一個(gè)平板上可測定幾個(gè)噬菌體樣本 培養(yǎng)后觀察劃線部位是否出現(xiàn)噬菌現(xiàn)象 劃線測定 2 細(xì)菌親緣關(guān)系測定 培養(yǎng)皿中加1ml待測定的噬菌體懸浮液 再加入45 肉汁胨培養(yǎng)基 混勻 待瓊脂平板凝固后 用滅菌的移植環(huán)蘸不同的細(xì)菌懸浮液在平板上劃線 培養(yǎng)后觀察測定的細(xì)菌能否生長 6 噬菌體的保存 用0 1 蛋白胨液或肉汁胨培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)菌 繁殖噬菌體懸浮液 過濾滅菌后保存 方法1 將噬菌體懸浮液裝入滅菌安瓶中 封口 4 保存 可保存幾個(gè)月或幾年 方法2 試管中先加入氯仿 再在其上面加噬菌體懸浮液 比例為1 1 20 不能用冷