生物固氮作用的分子機理研究.doc

項目名稱：生物固氮作用的分子機理研究首席科學家：王憶平 北京大學起止年限：2010年1月-2014年8月依托部門：教育部一、研究內容生物固氮研究的關鍵科學問題是獲得最佳生物固氮體系（包括共生固氮、聯(lián)合（內生）固氮等）和建立非豆科植物的自主固氮體系，具體包括：（1）闡明根瘤菌共生固氮基因表達調控的網絡，根瘤菌識別、傳遞環(huán)境和植物信號，調節(jié)自身基因表達的分子機理；（2）揭示固氮及氮代謝基因調控機理，與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調控偶聯(lián)機制；（3）闡明共生固氮體系中植物與微生物相互作用的機理，如植物與微生物相互識別及分子信號的傳導機制，克服宿主特異性，從而擴大根瘤菌的宿主范圍；（4）利用單細胞真核生物-酵母菌的線粒體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉化和表達的機制，為固氮基因向高等植物轉移，建立非豆科植物自主固氮體系的奠定基礎。（5）闡明固氮酶結構、功能和催化機理。圍繞上述提高生物固氮效率、擴大共生固氮植物范圍、建立自主固氮體系的關鍵問題，主要研究內容有：（1）以模式豆科植物共生固氮體系為材料，分離和鑒定參與根瘤菌結瘤因子信號傳遞的調控元件及基因，研究和建立根瘤菌與宿主植物共生關系蛋白相互作用網絡；通過對豆科植物與根瘤菌、AM真菌共生的異同以及與非豆科植物比較基因組學研究，揭示非豆科植物中存在哪些與共生相關基因的功能及調控機制，為探索擴大根瘤菌寄主范圍和建立非豆科共生固氮途徑可能性提供科學資料；分離和鑒定LysR、GntR等家簇轉錄因子及其靶基因，闡明根瘤菌主代謝與共生固氮功能的相關性和調控機理；開展根瘤菌群體感應系統(tǒng)、型分泌系統(tǒng)及胞外多糖合成基因表達調節(jié)的雙組分調控系統(tǒng)的研究，闡明這些代謝系統(tǒng)在不同環(huán)境條件下的功能和作用機制，揭示根瘤菌環(huán)境適應性與競爭結瘤之間的相關性。（2）碳代謝與氮代謝是自然界生命活動的兩大主要代謝作用。固氮基因調控機理，以及碳代謝和氮代謝之間的調控偶聯(lián)途徑已經得到了解析，但碳代謝對固氮基因的表達的抑制機理與途徑有較大不同。因此，進一步解析碳代謝調控系統(tǒng)對固氮基因的調控偶聯(lián)機理將為提高生物固氮效率打下理論基礎；建立酵母菌單細胞真核生物及其線粒體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉化的可能和表達機制。包括：酵母菌線粒體遺傳操作系統(tǒng)的構建；線粒體鉬的運輸、RNA聚合酶對固氮基因表達的影響（RNA聚合酶、 s因子、DNA折疊蛋白等）；線粒體呼吸耗氧與固氮酶厭氧的關系和影響；線粒體與細胞質之間的氨基酸穿梭往返機制對生物固氮效果的影響等。以上研究是固氮基因向真核生物轉移的新的嘗試，為非豆科植物（包括糧食作物）建立自主的生物固氮體系探索新路。（3） 聯(lián)合固氮作用有三個重要的限制因子，即氧、銨和能量。其中，能量和銨又是導致目前田間聯(lián)合固氮效率低下的最主要限制因子。我們擬利用功能基因組操作平臺，對斯氏假單胞菌和巴西固氮螺菌等聯(lián)合固氮菌和上述主要限制因子，在聯(lián)合固氮微生物功能基因組、聯(lián)合固氮基因表達調節(jié)以及固氮酶催化機制等開展工作。分析鑒定可能參與細菌氮信號傳導、調控或保持最佳固氮水平的新基因和新機制，系統(tǒng)研究聯(lián)合固氮體系形成的分子機理和聯(lián)合固氮微生物對土壤環(huán)境變化的適應能力, 探討提高作物與固氮微生物之間的聯(lián)合固氮效率的策略。（4）在固氮酶還原氮氣和質子的分子機制方面，利用生物信息學和結構化學理論，分析研究野生型及各突變株固氮酶還原N2和H+的動力學、EPR、CD波譜等特征。明確N2的絡合和還原位置及其電子質子傳遞通道。二、預期目標總體目標：本項目的總體目標是借助分子生物學和現代生物技術，開展生物固氮作用的分子機理研究，在分子水平上解析低等固氮微生物與高等植物宿主之間遺傳信息的交流；共生固氮體系的建立；固氮過程中能量及營養(yǎng)物質的交換；固氮功能的發(fā)揮等關鍵科學問題。為擴大根瘤菌宿主植物范圍、提高生物固氮效率，探索非豆科植物共生體系及自主固氮的可能性提供科學依據，為生物固氮在農業(yè)生產中的應用提供理論基礎和技術支撐，緩解和減輕農業(yè)生產中長期和大量依賴工業(yè)氮肥施用所造成的能源和環(huán)境問題，為保障我國糧食生產安全，農業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的途徑。五年目標：1）建立根瘤菌與宿主植物共生關系中蛋白相互作用網絡，分離和鑒定參與根瘤形成和發(fā)育功能基因及其調控蛋白，闡明根瘤菌共生信號在豆科植物中接受、傳遞及其調控的機制；建立豆科植物突變體庫，分離和鑒定與共生固氮相關的突變株；比較豆科植物與根瘤菌或AM真菌共生基因的異同，并比較非豆科植物基因組，闡明非豆科植物中存在哪些與共生固氮相關的基因及其功能、表達與調控機制。2）通過基因芯片等轉錄組學方法，分離和鑒定LysR和GntR家族轉錄因子調節(jié)的下游靶基因，闡明其調節(jié)共生固氮作用的分子機理；通過定向缺失突變，分離和鑒定參與根瘤菌細胞周期調控以及共生固氮作用的激酶和反應蛋白基因，并確定其相互作用網絡；分離和鑒定參與共生固氮作用的功能基因和調節(jié)蛋白，闡明根瘤菌共生固氮基因表達調控的網絡，根瘤菌識別、傳遞環(huán)境和植物信號，調節(jié)自身基因表達的分子機理。3）在結構層面和基因組水平揭示固氮及氮代謝基因調控機理，與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調控偶聯(lián)機制，為提高固氮效率奠定理論基礎；在結構層面上解析根瘤菌共生固氮的唯一碳源（能量）供應系統(tǒng)（Dct）的信號轉導原理及其調控機制，為提高共生固氮效率奠定理論基礎；構建單細胞真核生物-酵母菌的線粒體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉化和表達的機制，為固氮基因向高等植物轉移，建立非豆科植物（包括糧食作物）自主固氮體系的奠定基礎。4） 開展聯(lián)合固氮微生物比較基因組、生物固氮體系的進化、不同條件下聯(lián)合固氮微生物基因表達譜的研究，揭示生物固氮進化途徑的形成和機制，分析鑒定可能參與細菌氮信號轉導或保持最佳固氮水平的新基因；系統(tǒng)研究聯(lián)合固氮體系形成的分子機理，建立穩(wěn)定的聯(lián)合固氮體系，為提高作物與固氮微生物之間的固氮效率提出新策略；5） 分析P-cluster和FeMoco之間螺旋上單個氨基酸替換后固氮酶結構的變化和可能對電子質子傳遞的影響，對固氮酶MoFe蛋白亞單位中FeMo輔因子周圍多肽環(huán)境中保守氨基酸定位誘變并構建不同的突變株，明確FeMoco的Fe2和Fe6是否是氮的絡合和還原位置，及用于氮和質子還原的電子質子傳遞通道。6） 分離和鑒定100個左右在共生固氮系統(tǒng)中參與根瘤形成和發(fā)育、共生固氮作用的功能基因和調節(jié)蛋白、根瘤菌細胞周期調控、LysR和GntR家族調控子（regulon）的新基因；分離和鑒定30-50個與共生固氮相關的突變體；20個聯(lián)合固氮系統(tǒng)中參與細菌氮信號轉導或保持最佳固氮水平的新基因；在影響因子2以上的國際刊物上發(fā)表論文80篇或達到相應的影響因子總數的文章數目。申請國內外發(fā)明專利10個以上。在生物固氮研究領域造就一支高水平的研究隊伍，培養(yǎng)博士研究生60名以上。三、研究方案1）學術思路： 我們的學術思路和技術途經是圍繞著生物固氮菌氮碳代謝基因表達調控偶聯(lián)機理、豆科植物與根瘤菌相互作用機理、根瘤菌固氮系統(tǒng)調控機理和固氮菌固氮基因網絡調控與固氮酶催化機制等核心課題，依據多學科（生物學、化學、物理學）交叉的研究優(yōu)勢，獲得創(chuàng)新成果，促進生命科學領域的發(fā)展。同時提高生物固氮的效率，促進農業(yè)可持續(xù)發(fā)展?？傮w研究方案以下圖簡示：2）技術途徑： 總體研究方案以下圖簡示： 生物固氮作用的分子機理研究豆科植物共生信號 根瘤菌固氮系統(tǒng) 固氮菌氮碳代謝 聯(lián)合固氮菌固氮基因傳遞及作用機制 調控機理 基因調控偶聯(lián) 網絡調控與酶催化機理擴大根瘤菌 固氮基因向真核 高效穩(wěn)定的固氮體系的宿主范圍 生物的轉移非豆科植物的生物固氮生物固氮創(chuàng)新研究和農業(yè)持續(xù)發(fā)展3) 創(chuàng)新點與特色： 本建議項目是繼2002-2006年“高效生物固氮作用機理及其在農業(yè)中的應用”973項目之后，又一次跨學科、跨系統(tǒng)的全國性大型協(xié)作。我們爭取在以下問題上獲得創(chuàng)新成果：1）本項目四個課題的研究內容都集中在兩條主線上，一個研究如何提高生物固氮效率；一個是研究建立共生或自主固氮體系的基本條件。這兩條主線都為最終提高農作物產量服務。2）從豆科植物固氮根瘤形成調控系統(tǒng)和根瘤菌固氮調控系統(tǒng)兩個方面出發(fā)，結合根瘤菌及其宿主植物基因組學、功能基因組學和蛋白組學技術平臺，現代分子生物學、遺傳學理論和技術，對共生固氮體系植物和根瘤菌各自基因的表達和兩者之間分子相互作用機制研究，具有創(chuàng)新性和特色。3）碳代謝與氮代謝是自然界生命活動的兩大主要代謝作用。本建議項目從揭示存在于微生物體內的固氮及氮代謝與碳代謝之間的基因調控偶聯(lián)及其調控機理出發(fā)，進而研究固氮過程中能量的供應，對提供碳源，提高固氮作用有重要意義。這也是本建議項目的特色和創(chuàng)新點之一； 4）建立酵母菌單細胞真核生物及其線粒體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉化的可能和表達機制，是固氮基因向真核生物轉移的新的嘗試，為非豆科植物（包括糧食作物）建立自主的生物固氮體系探索新路。5）通過對野生和突變固氮酶的結構與功能進行比較，確定N2和H+在活性中心原子簇上的絡合與還原位點及其催化機理，為實現溫和條件合成氨的設想創(chuàng)造條件。在學科發(fā)展方向上具有創(chuàng)新性和特色。4）可行性分析： 我們認為上述預期成果是可以達到的，理由是：本建議是在“八五”、“九五”、“十五”的“863”計劃項目“根瘤菌和寄主相互關系的分子遺傳學研究”、“重組大豆根瘤菌的研制”、“水稻聯(lián)合固氮菌研究”、“玉米聯(lián)合固氮研究”、 “高效固氮大豆、花生根瘤菌的研制”、“高效固氮大豆、花生根瘤菌的中試研究”、“重組大豆根瘤菌的研制”、“重組固氮菌田間把關鑒定”、“高效固氮工程菌的構建及其應用”、“新型高效固氮菌劑的研制”；國家自然科學基金重點項目“我國豆科植物根瘤菌資源調查和分類”的研究、國家973項目“高效生物固氮作用機理及其在農業(yè)中的應用”基礎上提出的。本研究方案將我國的生物固氮資源與生物固氮基礎研究和應用基礎研究有機地結合起來，使近期和中長期目標更加明確、技術路線更加清晰，具有可行性和創(chuàng)新性。本建議項目將由在固氮微生物及其宿主植物的基因調控及其分子生物學、固氮微生物分子生態(tài)學及其分類、微生物與植物相互作用及其分子生物學、固氮酶生物化學及其化學模擬等研究方面的國內優(yōu)勢單位組成，具有很好的研究基礎和成熟的組織管理經驗。建議參加單位的實驗設施和裝備良好，其中有國家重點實驗室5個和部門重點實驗室3個。建議參加本項目研究任務的主要單位有北京大學、中國農業(yè)大學、華中農業(yè)大學、南京農業(yè)大學、中山大學、中科院上海植物生理生態(tài)研究所、中科院植物研究所、中國農業(yè)科學院生物技術研究所等國內優(yōu)勢單位共37人，其中包括新近引進的杰出人才10余人。 多年來，我國生物固氮研究與英國、法國、德國、荷蘭、比利時、美國、澳大利亞等國家有良好的合作基礎，其中包括政府間科技合作議定書的重點項目，如“中法先進研究計劃”、“中德科技合作項目”、“歐盟合作計劃項目”、美國洛氏基金“水稻結瘤固氮國際合作項目”、國際人類前沿科學基金（HFSPO）：“細菌中氮同化作用的調控網絡研究”等。首次在亞洲召開的國際固氮大會（第十四屆）于2004年在北京由本項目首席科學家王憶平教授主持大會并獲得圓滿成功，會議進一步展示了我國生物固氮研究的成果，并促進了我國科學家與國際同行的合作與交流。各課題間相互關系1 豆科植物固氮根瘤形成的分子機理本課題以模式豆科植物共生固氮體系為材料，研究蛋白質與蛋白質、蛋白質與核酸、蛋白質與多糖的相互作用，建立根瘤菌與宿主植物共生關系建立早期蛋白相互作用網絡。分離和鑒定參與根瘤菌結瘤因子信號傳遞的調控元件及基因，研究植物響應根瘤菌結瘤因子的作用方式、傳遞途徑及其信號蛋白的調控機制。研究豆科植物的長/短距離信號轉導途徑之間的關系，闡明根瘤形態(tài)發(fā)生以及根瘤屬性的分子機制，為提高共生固氮效率和作物產量、以及在非豆科植物建立共生或自主固氮體系奠定細胞生物學和形態(tài)發(fā)育的分子基礎。通過對豆科植物與根瘤菌、AM真菌共生的異同以及與非豆科植物比較基因組學研究，揭示非豆科植物中存在哪些與共生相關的基因及其調控機制，為探索擴大根瘤菌宿主范圍和建立非豆科共生固氮途徑可能性提供科學依據。主要研究內容：1）研究響應根瘤菌信號分子的宿主植物苜?；颍捌湓诟霭l(fā)育中的信號傳導。研究百脈根突變體rel1和rel3中，小RNA在生長素信號傳導途徑中對于根瘤發(fā)育的調控作用。通過對根瘤菌與多種豆科宿主植物（苜蓿和百脈根等）互作過程的研究，揭示結瘤因子在宿主植物中的信號傳導途徑和植物水解酶誘導的結瘤因子失活機理。2）利用酵母雙雜交技術鑒定出與根瘤菌型效應因子互作，并決定宿主特異性結瘤的豆科植物基因（即靶蛋白）。通過構建不同轉錄水平的轉基因植物來研究所克隆基因在共生中的作用。另外，將構建可表達型效應子的轉基因豆科植物，以此來研究根瘤菌型效應子在植物細胞中的功能（如：引起超敏反應；抑制植物防御反應等）。此外，應用Cre重組酶Lox-P技術，驗證型效應子-Cre融合蛋白是否從根瘤菌轉移到豆科植物。構建表達啟動子-loxP-報告基因（編碼葡糖苷酸酶或綠色熒光蛋白）的轉基因日本百脈根，接種攜帶型效應子-Cre融合蛋白的根瘤菌后，可在顯微鏡下檢測報告基因的表達活性。3）通過抑制性減法雜交技術，DNA微陣列技術和蛋白質組技術確定被根瘤菌胞外寡聚糖所誘導的豆科植物基因。通過RNA干擾技術將找到的基因進行沉默，從而研究其在共生過程中的功能。通過基因突變方案（獲得基因功能的方法）鑒定百脈根中不需要胞外寡聚糖也可以建立根瘤菌NGR234與豆科植物的固氮結瘤的突變體。4）在宿主植物與根瘤菌相互作用機理方面：根瘤菌與宿主植物共生關系早期蛋白相互作用網絡，根瘤菌結瘤因子的作用方式、傳遞途徑中的基因（如：COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因及其同源基因等）及其調控機制。豆科植物與根瘤菌、AM真菌共生的異同比較，以及與非豆科植物比較基因組學，探討在豆科根系和其他高等植物根系發(fā)育中的功能差異；在水稻中異源表達豆科植物結瘤因子信號轉導途徑中的基因（如LysM受體激酶等）；用結瘤因子處理轉基因水稻以觀測相關的菌根信號轉導途徑中的基因是否表達；研究植物與微生物共生所產生的其他特殊根形態(tài)發(fā)育（如菌根）與豆科根瘤形態(tài)發(fā)育分子調控機理的異同，揭示非豆科植物中與共生相關的基因及調控機制。5）在豆科植物固氮根瘤形態(tài)發(fā)育與其他不同器官的關系方面：整合百脈根、蒺藜苜蓿的基因組信息和豌豆EST信息，設計芯片，分析野生型和突變體的表達譜，以及應用酵母雙雜交等技術，尋找與COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因相互作用的基因/蛋白，確定COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因所參與的信號轉導途徑的遺傳調控網絡。探討根瘤及側根發(fā)育的分子途徑異同；COCH對根瘤屬性（有限和無限型）決定的分子機理。BIO1/ELE1和ELE2基因所涉及的影響豆科作物整株形態(tài)發(fā)育的信號轉導途徑，及其在根瘤形態(tài)發(fā)生的分子決定機制。預期研究目標：1) 建立根瘤菌與宿主植物共生關系早期蛋白相互作用網絡，分離和鑒定參與根瘤形成和發(fā)育功能基因及其調控蛋白20-30個；確定結瘤因子信號通路調控的結瘤因子失活的分子機理（反饋調節(jié)通路），找到抑制結瘤因子活性的結瘤因子水解酶基因，研究這些與結瘤因子相關的基因在共生結瘤過程中的作用；確定豆科植物中與根瘤菌型效應因子互作的基因，并闡明型效應因子被釋放進入了豆科宿主的細胞，及在特異性宿主結瘤過程中蛋白與蛋白互作的功能，了解型效應因子在宿主和非宿主豆科植物細胞中的分子機制。確定在豆科植物中對根瘤菌的胞外寡糖的識別和共生作用相關的基因；了解胞外寡糖在宿主和非宿主豆科植物上的作用和分子機制。進一步闡明根瘤菌共生信號在豆科植物中接受、傳遞及其調控機制。為擴大根瘤菌宿主植物范圍，探索創(chuàng)建非豆科植物共生固氮體系的可能性提供科學依據。2）建立豆科植物與根瘤菌共生固氮突變體庫，分離和鑒定30-50個與共生固氮相關的突變體，闡明根瘤形態(tài)發(fā)生以及根瘤屬性的分子機制，根瘤形成與JA等植物激素信號轉導途徑的相關性。3）通過對豆科植物與根瘤菌、AM真菌共生的異同以及與非豆科植物比較基因組學研究；通過構建對結瘤因子響應的轉基因水稻，即擁有功能性的結瘤因子信號轉導途徑的水稻，闡明非豆科植物中存在哪些與共生固氮相關基因的功能及調控機制。課題承擔單位：中山大學、中科院上海植物生理生態(tài)研究所課題負責人：Staehelin C.46博士教授中山大學主要學術骨干：程 奇43博士教授中山大學謝致平44 博士副教授中山大學羅 達 52博士教授中科院上海植物生理生態(tài)所王彥章30博士副研究員中科院上海植物生理生態(tài)所羅 利30博士副研究員中科院上海植物生理生態(tài)所陳愛民40碩士副研究員中科院上海植物生理生態(tài)所經費比例： 21.67%2 根瘤菌固氮系統(tǒng)調控的分子機理借助分子生物學和現代生物技術，開展生物固氮作用的分子機理研究，在分子水平上解決低等微生物與高等植物遺傳信息的交流、共生固氮體系的建立、固氮過程中能量物質的交換、及固氮功能的發(fā)揮等科學問題。為擴大根瘤菌宿主植物范圍、提高生物固氮效率，探索建立非豆科植物共生體系及自主固氮提供科學依據，為其應用提供理論基礎和技術支撐，以緩解農業(yè)生產中長期和大量施用工業(yè)氮肥而導致的能源、環(huán)境問題，為農業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的途徑。主要研究內容：1）苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）LysR和GntR轉錄因子家族中共生固氮必需基因的作用及其調節(jié)機理。雙組份系統(tǒng)（組氨酸激酶和反應蛋白）調節(jié)根瘤菌細胞周期相關基因表達的分子機理。2）根瘤菌群體感應系統(tǒng)、型分泌系統(tǒng)的底物蛋白及胞外多糖合成基因表達調控系統(tǒng)，這些系統(tǒng)在根瘤菌共生固氮過程中作用及其分子機理。3）類菌體及其與宿主方控制類菌體分化、固氮、衰老的功能基因組，dmtH，opa22, lpsH對華癸中生根瘤菌類菌體分化和根瘤發(fā)育的調控作用。4）根瘤菌生物多樣性及其環(huán)境與固氮作用的關系、新功能基因的發(fā)掘。預期研究目標：1) 建立類菌體分化與固氮根瘤發(fā)育過程中根瘤菌與宿主植物間蛋白相互作用網絡，分離和鑒定根瘤菌-宿主共生體系雙方控制類菌體分化、共生固氮和根瘤衰老的功能基因、調控蛋白及信號分子20-30個，闡明各功能基因的結構與功能及其調控機制。為揭示根瘤菌與宿主植物在共生中、晚期相互作用的分子機制提供科學資料。2) 建立根瘤菌“組學”研究平臺，在自生和共生條件下開展根瘤菌共生固氮基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組學的研究，分離和鑒定LysR、GntR等家簇轉錄因子及靶基因30-50個，闡明根瘤菌代謝與共生固氮功能的相關性和調控機理，為改造和提高共生固氮效率奠定理論基礎。3) 分離根瘤菌群體感應系統(tǒng)、型分泌效應子及胞外多糖等與共生相關基因20-30個，闡明這些基因在不同環(huán)境條件下的功能和作用機制，揭示根瘤菌環(huán)境適應性與競爭結瘤之間的相關性，為生物固氮在農業(yè)生產中的應用提供理論基礎和技術支撐。課題承擔單位：華中農業(yè)大學、南京農業(yè)大學課題負責人：張忠明54碩士教授華中農業(yè)大學主要學術骨干： 李友國42博士教授華中農業(yè)大學朱 輝32博士講師華中農業(yè)大學李一星30博士講師華中農業(yè)大學朱 軍40博士教授 南京農業(yè)大學鐘增濤35博士副教授南京農業(yè)大學鄭會明27碩士講師南京農業(yè)大學王 卉29博士講師南京農業(yè)大學經費比例：21.67%3 固氮菌氮、碳代謝基因表達的調控偶聯(lián)及固氮基因向真核生物的轉移長期以來，微生物體內碳代謝與固氮及氮代謝之間的調控偶聯(lián)一直不清。然而，生物固氮是一個高耗能的過程，可供固氮微生物使用的植物光合作用產物（碳水化合物）的質和量是限制其固氮效率的主要瓶頸。如何提供更多能源是提高共生固氮效率的關鍵。實為提高共生固氮效率的必由之路。目前已經有可能進行這方面的研究，但當前國際上尚未見有開展這方面的研究報道。主要研究內容：1）在結構層面和基因組水平，研究固氮及氮代謝基因調控機理，研究與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調控偶聯(lián)機制。在固氮及氮代謝基因調控機理方面，擬從s54-RNA聚合酶、AAA+家族激活蛋白、DNA彎曲蛋白及其靶位點這些主要元件出發(fā)，研究s54-RNA聚合酶激活復合體的組裝機制，及其在結構特征與功能實現之間的相互關系；在與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調控偶聯(lián)機制方面，前期工作解析了碳代謝與氮代謝之間的調控偶聯(lián)關系，因此本課題的研究內容是碳代謝與固氮之間的調控偶聯(lián)關系及其調控機制。2）結合生物物理、生物化學和生理學手段，從蛋白結構入手，對DCT系統(tǒng)上游的信號接收、轉導，直至下游的轉錄調控機制做深入的研究。研究DCT系統(tǒng)可能存在的一個“雙通路”感應機制，即DctB對四碳二羧酸的感應可能是直接與間接兩種機制并存的。而且，DctA與DctB的相互作用很可能更深層次地參與了DCT系統(tǒng)的調控。3）固氮基因向單細胞真核生物酵母菌、衣藻轉移和表達研究：酵母線粒體遺傳操作系統(tǒng)的構建；鉬運輸（molybdenum transport）系統(tǒng)的構建；研究RNA聚合酶對固氮基因表達的影響（RNA聚合酶類型、s因子種類、DNA折疊蛋白種類等）；線粒體呼吸耗氧與固氮酶厭氧的關系；探索線粒體及葉綠體與細胞質之間的氨基酸穿梭往返機制對生物固氮效果的影響。4）藍藻固氮細胞分化及其調控機制及光合與固氮的偶聯(lián)機制研究。5）根瘤菌促進水稻生長及兩者相互作用機理研究：根瘤菌接種水稻后成為內生菌分布在植物全身，并能提高光合作用，促進生長。蛋白質組學研究表明有光合作用和能量等相關的一些蛋白（如Rubisco活化酶和PSII光合放氧蛋白）表達顯著上調?；谶@個基礎，需深入研究根瘤菌因子與水稻相關基因的相互作用及其機理，為根瘤菌在非豆科植物上的廣泛應用奠定理論依據。主要研究目標：1）在結構層面上，在基因組水平揭示固氮及氮代謝基因調控機理，揭示與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調控偶聯(lián)機制，不僅對生物固氮調控有重要意義，也將對基因表達調控的基礎研究有重要貢獻為提高固氮效率奠定理論基礎。2）在結構層面上解析根瘤菌共生固氮的唯一碳源（能量）供應系統(tǒng)Dct系統(tǒng)的信號轉導原理及其調控機制，為提高共生固氮效率奠定理論基礎。3）通過建立和操作單細胞真核生物酵母菌線粒體、衣藻葉綠體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉化和表達的機制，進行固氮基因向真核生物橫向轉移的有益嘗試，為建立非豆科植物（包括糧食作物）自主固氮體系進行探索。4）在分子水平解析藍藻固氮細胞分化及其調控機制；根瘤菌作為內生菌對水稻具有促生作用的原理。課題承擔單位：北京大學、中國科學院植物研究所課題負責人：王憶平49博士教授北京大學主要學術骨干：趙進東53博士院士北京大學蘇曉東45博士教授北京大學張曉東42博士教授北京大學梁宇和38博士副教授北京大學田哲賢 38博士講師北京大學文 津42碩士講師北京大學沈世華46博士研究員中國科學院植物研究所陳 暉48博士研究員中國科學院植物研究所唐明娟37博士助研究員中國科學院植物研究所楊明峰 38博士助研究員中國科學院植物研究所經費比例：28.33%4 聯(lián)合固氮菌固氮基因網絡調控與酶催化分子機理聯(lián)合固氮作用有三個重要的限制因子，即氧(失活)、銨(抑制)和能量(限制)。其中，能量限制和銨抑制又是導致目前田間聯(lián)合固氮效率低下的最主要限制因子。我們擬利用功能基因組、基因芯片、蛋白質相互作用組等技術平臺，針對斯氏假單胞菌A1501和巴西固氮螺菌等模式聯(lián)合固氮菌和上述主要限制因子，在聯(lián)合固氮微生物功能基因組、聯(lián)合固氮基因表達調節(jié)以及固氮酶催化機制等開展研究工作。主要研究內容：1）開展聯(lián)合固氮微生物比較基因組合生物固氮體系進化研究，對生物固氮體系的不同進化類型進行結構和功能的系統(tǒng)分析，揭示生物固氮進化途徑、動力和機制。在建立全基因組和芯片平臺的基礎上，比較在不同條件下聯(lián)合固氮微生物基因表達譜及其差異，研究聯(lián)合固氮基因網絡調控機制。分析鑒定可能參與細菌氮信號傳導、調控或保持最佳固氮水平的新基因和新機制。2）充分利用我國聯(lián)合固氮微生物資源優(yōu)勢，研究環(huán)境脅迫因子（如氧敏感、氨阻遏、溫度效應等）對聯(lián)合固氮微生物根際競爭和固氮效率的影響，系統(tǒng)研究了聯(lián)合固氮體系形成的分子機理，研究聯(lián)合固氮微生物對土壤環(huán)境變化的適應能力,探討提高作物與固氮微生物之間的聯(lián)合固氮效率的策略，利用基因工程技術改造固氮微生物，為探討穩(wěn)定聯(lián)合固氮體系建立的分子機制提供了重要的理論依據。3）在固氮酶還原氮氣和質子的分子機制方面，利用生物信息學和結構化學理論，分析預測P-cluster和FeMoco之間的螺旋上單個氨基酸替換后固氮酶結構的變化和可能對電子質子傳遞的影響。采用分子生物學技術對固氮酶MoFe蛋白亞單位中FeMo輔因子（FeMoco）周圍多肽環(huán)境中保守氨基酸及與FeMoco Mo端相連的高檸檬酸的定位誘變，構建不同的突變株，研究這些突變株催化N2、H+ 和C2H2還原的性質。分別研究野生型及各突變株固氮酶還原N2和H+的動力學、EPR、CD波譜、核磁、振動光譜、穆斯堡爾光譜、時間分析光譜等特征，研究固氮酶催化活性中心結合、催化底物分子的作用機理，探明底物在活性中心上存在遷移的可能性，明確N2的絡合和還原是否在FeMo-co 中心硫原子（S2B）的Fe2和Fe6上，以及N2和H+還原的兩條電子質子傳遞通道。主要研究目標：1） 開展聯(lián)合固氮微生物比較基因組和生物固氮體系進化研究以及在不同條件下聯(lián)合固氮微生物基因表達譜研究，揭示生物固氮進化途徑、動力和機制，分析鑒定可能參與細菌氮信號轉導、調控或保持最佳固氮水平的新基因15-20個。2） 系統(tǒng)研究聯(lián)合固氮體系形成的分子機理，探討提高作物與固氮微生物之間的聯(lián)合固氮效率的新策略3-5種，為探討穩(wěn)定聯(lián)合固氮體系建立的分子機制提供了重要的理論依據。3） 分析預測P-cluster和FeMoco之間螺旋上單個氨基酸替換后固氮酶結構的變化和可能對電子質子傳遞的影響，對固氮酶MoFe蛋白亞單位中FeMo輔因子周圍多肽環(huán)境中保守氨基酸定位誘變并構建不同的突變株5-10株，明確N2的絡合和還原在靠近FeMoco 中心硫原子的Fe2和Fe6上發(fā)生，以及用于 N2和H+還原的兩條電子質子傳遞通道。課題承擔單位：中國農科院生物技術研究所、中國農業(yè)大學課題負責人：燕永亮32博士副研究員中國農科院生物技術研究所主要學術骨干：平淑珍49碩士副研究員中國農科院生物技術研究所陳 明46碩士副研究員中國農科院生物技術研究所林 敏46博士研究員中國農科院生物技術研究所徐榮旗44博士博士后