實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用.ppt

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷病原體測定腫瘤診斷基因差異表達(dá)研究 主要內(nèi)容 PCR與基因診斷技術(shù) 4 基因診斷即通過核酸的分子生物學(xué)檢測直接檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病做出診斷的方法 Polymerasechainreaction PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù) 1998年 熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測 熒光定量PCR技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記 利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測整個(gè)PCR過程 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對PCR終產(chǎn)物的分析 最終實(shí)現(xiàn)對未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù) 是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法 熒光染料 SYBRGreenI EVAGreen ResoLight熒光探針 TaqMan HybridizationProbes MolecularBeacon 6 羅氏應(yīng)用科學(xué)部整合細(xì)胞組學(xué)和基因組學(xué)的研究流程 LightCycler Real TimePCRPlatform超過十年的實(shí)時(shí)熒光PCR的技術(shù)革新 1998 2003 2009 2005 2008 LightCycler 480廣泛的應(yīng)用 絕對定量 相對定量 基于熔解曲線的基因分型 終點(diǎn)法基因分型 基于HRM的突變掃描 羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床診斷的整體解決方案基因診斷病原體測定定性分析絕對定量耐藥性研究腫瘤診斷基因差異表達(dá)研究 主要內(nèi)容 熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用 10 病毒性肝炎 HBV HBV YMDD HCV 的基因檢測性病相關(guān)病原體 CT NG UU HPV 的基因檢測優(yōu)生優(yōu)育項(xiàng)目診斷 人巨細(xì)胞病毒 HCMV 單純皰疹病毒II型 HSV 風(fēng)疹病毒其它病原體檢測 結(jié)核桿菌 肺炎支原體 EB病毒 傷寒桿菌 幽門螺旋桿菌等 HBVDNA檢測縮短 窗口期 11 有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷 熒光定量PCR方法檢測HBV感染的各期 12 乙肝的治療 13 治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類 干擾素 重組人 1b干擾素 2a 2b干擾素等核苷類似物 拉米夫定 阿德福韋 HBsAg和HBeAg均陽性而HBVDNA陰性 14 干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制 PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變 此引物與突變DNA不能配對結(jié)合 病毒DNA整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游離HBVDNA很少或缺乏 抗病毒治療中存在的問題 逆轉(zhuǎn)錄酶催化中心YMDD變異 15 YMDD 酪氨酸 蛋氨酸 天門冬氨酸 天門冬氨酸蛋氨酸 M 突變?yōu)楫惲涟?I 或纈氨酸 V 形成YIDD變異株或YVDD變異株 HBV YMDD變異檢測的臨床意義 16 動(dòng)態(tài)檢測 服用拉米夫定3個(gè)月開始 每月檢測1次提前發(fā)現(xiàn) 可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前1 4個(gè)月檢測出突變株及時(shí)調(diào)整 適時(shí)調(diào)整用藥方案 防止因耐藥而導(dǎo)致病情惡化 HRM的應(yīng)用介紹用12個(gè)MIRU VNTR位點(diǎn)對結(jié)核桿菌菌株進(jìn)行基因分型 YuPangetalJournalofMicrobiologicalMethods2011inpress 不同MIRU40位點(diǎn)重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)品的HRM分析結(jié)果 R repeat 88個(gè)菌株不同MIRU40數(shù)量的Tm值的統(tǒng)計(jì) 流行病學(xué)研究 小結(jié) 18 熒光定量PCR可以對致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測彌補(bǔ)免疫檢測的缺陷 如HCV 縮短診斷的窗口期 如HIV 利于早期診斷對治療過程進(jìn)行療效監(jiān)測指導(dǎo)用藥過程及劑量 以制定合理的療效方案結(jié)合臨床表現(xiàn) 并與傳統(tǒng)的免疫學(xué) 影像學(xué)等診斷方法來綜合評判 更為科學(xué) 羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷病原體測定腫瘤診斷突變檢測 個(gè)性化用藥甲基化基因差異表達(dá) 主要內(nèi)容 高分辨率熔解曲線定義 高分辨率熔解曲線 HRM 是傳統(tǒng)的熔解曲線分析的延伸 它要求特殊的熒光染料 高性能的熒光定量PCR儀器與專門的分析算法分辨率高 可以區(qū)分一個(gè)堿基突變的多組核酸樣本 可以區(qū)分野生型 純合子 突變型 純合子 雜合子使我們可以不必測序直接篩查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在遺傳學(xué)變異 SNPs mutations 與其它方法相比 具有高特異性 高靈敏度與方便快捷的優(yōu)點(diǎn) 而且通量更高 單次成本更低 HRM的應(yīng)用 SNP位點(diǎn)的檢測 已知與未知位點(diǎn) 單倍型分析 雜合性喪失的篩查 種群中優(yōu)勢等位基因分析 物種鑒定 DNA遺傳作圖 潛在易感基因的篩選醫(yī)學(xué)應(yīng)用 產(chǎn)前診斷 傳染病與遺傳疾病的監(jiān)控 藥物療效的觀察突變 包括小片段的插入和缺失醫(yī)學(xué)應(yīng)用 腫瘤的快速診斷 治療與預(yù)后評價(jià)甲基化應(yīng)用醫(yī)學(xué)應(yīng)用 腫瘤的快速診斷 治療與預(yù)后評價(jià) 飽和熒光染料創(chuàng)新的飽和熒光染料能夠識(shí)別單堿基突變 并且不抑制PCR反應(yīng) 不飽和雙鏈DNA熒光染料SYBRGreenI純合子和雜合子的熔解曲線基本相同飽和雙鏈DNA熒光染料ResoLight LCGreen EvaGreen都為綠色熒光染料 最佳激發(fā)波長范圍440 470nm 發(fā)射熒光波長470 520nm 序列的變化會(huì)導(dǎo)致熔解曲線的顯著變化 純合子 雜合子 創(chuàng)新的HRM染料準(zhǔn)確區(qū)分野生型純合子和雜合子LC480HRMMasterMix ResoLightDye SYBRGreenIvsLightCycler 480ResoLightDye后者提供更高的信號(hào)靈敏度和分辨率 24 HRM技術(shù)和dHPLC的分辨率比較dHPLCHRM wt mut het wtwtwtwtwtmutmutmutmutmut wthet noseparationofhomozygousvariant FABEx15J 318bpamplicon SNPA G PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于基因掃描的基因分型 26 兩種同源雙鏈 兩種異源雙鏈 觀察到的4種雙鏈結(jié)構(gòu) 雜合子擴(kuò)增 基因掃描高分辨率熔解分析 案例 LPLH3基因的突變 SNPC T 72樣品 PCR產(chǎn)物大小164bp LightCycler 480HRM應(yīng)用介紹基因掃描 顯著降低測序成本 甘露糖結(jié)合凝集素MBL2基因序列變異分析 384個(gè)樣本 擴(kuò)增子長度219bp 4種最常見的基因型在圖像上被分為4組 少量樣本呈現(xiàn)另外的3種遺傳變異 29 www roche applied 突變定量分析 CYP2C9目前約有16 的臨床藥物由其負(fù)責(zé)代謝 如華法林 甲苯磺丁脲和苯妥因 portionTallele50 1 120 1 514 1 710 1 104 1 250 144bpamplicon SNPC T 30 凝血因子VIII的突變檢測 第八因子的單堿基替換導(dǎo)致了50 急性血友病A 由于該基因轉(zhuǎn)錄本長達(dá)9kb 且外顯子較小 69 262bp 利用dHPLC或者測序檢測昂貴耗時(shí) 用HRM可篩選出90 的突變 DetectionofFactorVIIIGeneMutationsbyHigh ResolutionMeltingAnalysis Laurieetal ClinChem 2007 HRM法檢測KRAS基因的敏感性結(jié)果 31 擴(kuò)增片段92bp 突變型質(zhì)粒所占的比例分別為0 2 5 10 20 50 100 的混合質(zhì)粒DNA系列中 HRM分析方法可以明顯的檢測出只含2 的突變型DNA 不同的KRAS突變類型在HRM判讀圖譜中顯示出與野生型不同的突變型的曲線 32 羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷病原體測定腫瘤研究突變檢測甲基化檢測基因差異表達(dá)研究 主要內(nèi)容 34 在一般正常的細(xì)胞中 CpG成分處于非甲基化的狀態(tài)甲基化研究對于了解基因的調(diào)控模式以及疾病的分子生物學(xué)機(jī)制具有重要意義 發(fā)育 癌腫瘤發(fā)生 基因印跡 X染色體失活及相關(guān)遺傳性疾病在特定條件下 譬如許多發(fā)育相關(guān)基因 在發(fā)育的特殊階段去甲基化表達(dá)腫瘤的DNA甲基化改變表現(xiàn)為總體的甲基化水平降低與啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化水平升高 抑癌基因與修復(fù)基因的甲基化導(dǎo)致抑癌基因沉默與修復(fù)基因失活 而總體低甲基化使反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 癌基因活化和染色體不穩(wěn)定基于甲基化特定標(biāo)志物的量化情況 對不同的病人進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)水平分級 DNA甲基化現(xiàn)象和疾病研究 2 PCR擴(kuò)增 脲嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后變?yōu)樾叵汆奏?使甲基化差別轉(zhuǎn)換為堿基序列差別 T C mC U 1 重硫酸鹽處理已變性的DNA 未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)殡遴奏?mC mC C U 3 分析 測序 甲基化特異性PCR 引物延伸 限制性酶消化 雜交 orReal timePCR DNA甲基化研究的常規(guī)流程 結(jié)直腸癌FFPE樣品啟動(dòng)子甲基化測定 HighQualityAssessmentofDNAMethylationinArchivalTissuesfromColorectalCancerPatientsUsingQuantitativeHigh ResolutionMeltingAnalysis Balic M etal 2009 J Mol Diagn 11 102 108 在腫瘤發(fā)生過程中 超甲基化的啟動(dòng)是一個(gè)常見的抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制 它也同時(shí)被視為腫瘤發(fā)生的特點(diǎn)之一 適當(dāng)保存的組織是檢測重要的生物標(biāo)志物的重要來源 在早期癌癥監(jiān)測 風(fēng)險(xiǎn)分析和治療中 DNA甲基化分析方法是一個(gè)理想的手段 使用HRM分析方法 可以穩(wěn)定地檢測到1 的甲基化DNA 37 甲基轉(zhuǎn)移酶MGMT與腫瘤預(yù)見性 個(gè)體化治療 Krypuy M etal Rapidhigh throughputmethylationanalysisusingtheLightCycler 480system Biochemica1 11 13 2008 O6 甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MGMT 是細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的一種酶 可以修復(fù)由各種烷化劑造成的細(xì)胞DNA烷基化損傷細(xì)胞中的MGMT水平?jīng)Q定了細(xì)胞對烷化劑的耐藥程度MGMT的甲基化程度直接反映了其表達(dá)水平 羅氏應(yīng)用科學(xué)部在臨床醫(yī)學(xué)的整體解決方案基因診斷病原體測定腫瘤診斷基因差異表達(dá)研究早期篩查分子指紋 主要內(nèi)容 qPCR圖譜作為腫瘤指紋用于早期篩查 早期篩查 腫瘤的惡性生長會(huì)引起血液生化環(huán)境的特征性變化 這些變化將會(huì)影響血細(xì)胞某些基因的表達(dá) 根據(jù)不同腫瘤與免疫系統(tǒng)的關(guān)系 對外周血細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行人類全基因的表達(dá)差異分析 生物芯片 篩選出腫瘤相關(guān)表達(dá)差異基因 乳腺癌早期診斷 熒光定量PCR法 通過對外周血細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行人類全基因組的表達(dá)差異分析 篩選乳腺癌早期診斷的基因標(biāo)記物 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 檢測臨床血液樣本中乳腺癌標(biāo)志物的表達(dá)差異 檢測結(jié)果可用于乳腺癌的早期篩查和輔助診斷 qPCR圖譜作為成神經(jīng)細(xì)胞瘤指紋Predictingoutcomesforchildrenwithneuroblastomausingamultigene expressionsignature Vermeulen J etal 2009 LancetOncol 10 663 671 在最大的成神經(jīng)細(xì)胞瘤庫 n 579 中建立 驗(yàn)證了大量的預(yù)后多基因表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR qPCR 檢測 只需20ngRNA 使用59種預(yù)后基因和5種內(nèi)參基因 這個(gè)驗(yàn)證結(jié)果構(gòu)成的 指紋信息 可以作為一種獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測機(jī)制 使得在當(dāng)前的治療組中能鑒別出病情可能加重的病人 41 多因子疾病治療預(yù)后Amultiplexreal timePCRmethodfordetectionofGSTM1andGSTT1copynumbers Timofeeva M etal 2009 ClinicalBiochemistry42 500 509 對于致癌物質(zhì)解毒和藥物代謝 谷胱甘肽結(jié)合十分重要 人體中大量的GSTT1和GSTM1發(fā)生缺失 GST基因缺失的多樣性對于多因子疾病 例如不同類型的癌癥 有潛在的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)見因素 在LightCycler480上使用多重PCR反應(yīng)對GSTM1和GSTT1進(jìn)行基因分型 內(nèi)參基因?yàn)閍lbumin 所有的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)化比例使用LightCycler480軟件進(jìn)行相對定量 這種新的半定量基因分型方法具有高靈敏度 是大型分子流行病和臨床研究的理想工具 42 EuropeanSpaceAgencyMission歐洲航天計(jì)劃宇航員的基因表達(dá)在太空旅行前后是否有變化 GPCRs通過cMAP介導(dǎo)的信號(hào)通路影響免疫學(xué)功能樣本來源 進(jìn)入外太空前后的宇航員血樣UPL通用探針庫讓您更快地從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到開始實(shí)驗(yàn)Roche 1dayOthers 2weeks 43 外太空環(huán)境對免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因表達(dá)的影響 ChangesinexpressionpatternbeforeandaftertriptotheISS RealTimereadyGPCRpanel DatakindlydistributedfromDr Dr S Kreth PDDr A Chouker andProf Dr M Thiel LMUMunich Germany ESAProjectIMMUNO 出發(fā)前 返回后1 7 30天分別進(jìn)行相對定量檢測5位宇航員的基因表達(dá)水平檢測到顯著差異 UPL通用探針庫讓您更快地從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到開始實(shí)驗(yàn)Roche 1dayOthers 2weeks Mechanismofaction 44 RealTimereadyHumanGPCRPanel宇航員在進(jìn)入外太空前后血樣中的基因表達(dá)變化 相對定量檢測多個(gè)基因在血液中表達(dá)量的變化 進(jìn)入外