E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn).pptVIP

E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn) 中山醫(yī)學(xué)院免疫教研室2012 04 ERosetteFormingCellTest 掌握E花環(huán)形成的原理熟悉E花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)的步驟及光鏡下E花環(huán)的形態(tài)熟悉磁珠分離的原理 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?T細(xì)胞的表面分子是T細(xì)胞與其它細(xì)胞和分子間相互識(shí)別及作用的物質(zhì)基礎(chǔ) 它們?cè)赥細(xì)胞活化 增殖和分化等過(guò)程中起重要作用 TCR CD3復(fù)合物參與T細(xì)胞的抗原識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) CD2 CD28 CTLA 4 CD45 CD40L等膜蛋白參與T細(xì)胞活化及T細(xì)胞與其它細(xì)胞間相互作用 CD4 CD8分子輔助TCR識(shí)別結(jié)合抗原 參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 根據(jù)CD4和CD8分子的表達(dá)將其分為CD4 T和CD8 T細(xì)胞 T細(xì)胞表面分子 依靠表面標(biāo)記的分離方法 流式細(xì)胞術(shù)分離法 利用各種熒光素標(biāo)記的表面標(biāo)記特異性抗體 使不同表面標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)合上不同的熒光素 借助熒光活化細(xì)胞分選儀將各種細(xì)胞分離開(kāi)來(lái) 免疫磁珠分離法 將針對(duì)細(xì)胞某種表面標(biāo)記的特異性抗體包被在磁性微珠上 與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結(jié)合具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞 然后用強(qiáng)磁場(chǎng)可將具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞分離出來(lái) 磁珠 microbead 標(biāo)記細(xì)胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到 磁珠分離策略 一 陽(yáng)性分選 磁珠標(biāo)記目的細(xì)胞 未標(biāo)記細(xì)胞先行流出 移出磁場(chǎng)后收集目的細(xì)胞 CD4 T細(xì)胞 分離柱 CD4 T細(xì)胞 磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞 目的細(xì)胞先行流出 二 陰性分選 成熟的人T細(xì)胞表面表達(dá)綿羊紅細(xì)胞 SRBC 受體 即CD2分子 能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu) 可在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù) 本法可用于分離外周血T細(xì)胞及檢測(cè)T細(xì)胞的數(shù)量和比例 E花環(huán)分離法原理 實(shí)驗(yàn)材料 1 肝素抗凝血2 Hank s液3 淋巴細(xì)胞分離液4 綿羊紅細(xì)胞懸液5 滅活小牛血清6 水平離心機(jī) 37 溫箱 顯微鏡等 實(shí)驗(yàn)方案 取外周血 綿羊紅細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 分離 顯微鏡下觀察 實(shí)驗(yàn)步驟 用Hank s液配成106細(xì)胞 0 1ml 加等量滅活小牛血清 0 1ml 取0 1ml 加入0 5 綿羊紅細(xì)胞0 2ml 混勻 37 溫箱放置5分鐘 1000rpm離心5min 加1小滴1 美藍(lán) 用毛細(xì)吸管輕輕混勻 取1滴于玻片上 加上蓋玻片 高倍鏡下觀察玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞 置4 冰箱 5min 30 45min 結(jié)果判斷 凡能結(jié)合三個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞者為玫瑰花形成陽(yáng)性細(xì)胞 正常人的花環(huán)形成率50 70 大致可以代表周?chē)蠺細(xì)胞的百分?jǐn)?shù) 左 甲紫染色 800 可見(jiàn)2個(gè)被綿羊紅細(xì)胞包圍而形成玫瑰環(huán)的T淋巴細(xì)胞 右 吖啶橙染色 圖中可見(jiàn)3個(gè)染成橙黃色熒光的T淋巴細(xì)胞被綿羊紅細(xì)胞所包圍 T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán) T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)掃描電鏡 6500 測(cè)定外周血中的T細(xì)胞數(shù) 觀察受檢者的細(xì)胞免疫功能及免疫增強(qiáng)劑的療效 觀察免疫抑制劑的效果 協(xié)助進(jìn)行惡性腫瘤療效的觀察及預(yù)后判斷等 臨床應(yīng)用 注意事項(xiàng) 1