植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展.doc

植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展 08生物科學(xué) 081003011 余蕓摘要： 利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物具有十分廣闊的前景。對(duì)利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的條件控制、生產(chǎn)方法和在制藥工業(yè)上的應(yīng)用進(jìn)行了綜述,并對(duì)該技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。關(guān)鍵字：植物細(xì)胞培養(yǎng) 次生代謝產(chǎn)物 工業(yè)應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)始于本世紀(jì)初，并不可爭(zhēng)議地具有工業(yè)化潛力。目前植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的化合物很多，包括糖類、酚類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸以及帖類和生物堿等初生和次生代謝產(chǎn)物，植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用主要包括以下3個(gè)方面：有用物質(zhì)（次生代謝產(chǎn)物）的生產(chǎn)；植物無(wú)性系的快速繁殖和遺傳突變體的篩選；植物細(xì)胞遺傳、生理、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的局限性使得植物細(xì)胞仍難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，迫切需要進(jìn)一步研究和發(fā)展細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化控制及其工藝。1 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究歷史及現(xiàn)狀植物次生代謝的概念是在1891年南KOSSZEL首先明確提出的1。植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)源于德國(guó)著名植物學(xué)家HABERLANDT(1902)提出的細(xì)胞全能性學(xué)說(shuō)。植物細(xì)胞具備生物合成的全能性，即每個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞保留著完整的遺傳信息，能生產(chǎn)所有母體植物中合成的化學(xué)物質(zhì)。11植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)特點(diǎn)與其它的方法相比，應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物爨有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)能夠保證產(chǎn)物在一個(gè)限定的生產(chǎn)系統(tǒng)中連續(xù)、均勻生產(chǎn)，不受病蟲(chóng)害、地理和季節(jié)等各種環(huán)境因素的影響；(2)可以在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，并通過(guò)控制環(huán)境條件得到超過(guò)整株植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物；(3)所獲得的產(chǎn)物可從培養(yǎng)體系內(nèi)直接提取，并快速、高效的回收與利用，簡(jiǎn)化了分離與純化的步驟；(4)有利于細(xì)胞篩選、生物轉(zhuǎn)化，合成新的有效成分2。；(5)有利于研究植物的代謝途徑，還可以利用某些基因工程手段探索與創(chuàng)造薪的合成路線，得到價(jià)值更高的產(chǎn)品；(6)節(jié)省大量用于種植原料的農(nóng)田，以便進(jìn)行糧食作物的生產(chǎn)。12植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究歷史與現(xiàn)狀1956年ROUTIOR秘NIKZELL首次提出應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)商業(yè)化生產(chǎn)植物化合物的設(shè)想，1967年KAUL和STABA采用多并發(fā)酵罐對(duì)Ammivisnaga進(jìn)行了細(xì)胞大量培養(yǎng)的研究，并首次用此方法得到了藥用成分呋哺色酮，使這一設(shè)想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)3。但是，由于植物細(xì)胞培養(yǎng)體系中細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，目標(biāo)代謝產(chǎn)物極低(通常不到細(xì)胞于重的1)4等特點(diǎn)，再加上植物細(xì)胞所特有的生理生化特性還沒(méi)被人們所認(rèn)識(shí)，人們單純的模擬培養(yǎng)微生物的條件來(lái)培養(yǎng)植物細(xì)胞及當(dāng)時(shí)有效成分的分析手段落后等原因，人們并沒(méi)有看到該技術(shù)在生產(chǎn)天然產(chǎn)物方面的潛能。20世紀(jì)70年代以后，該技術(shù)有所發(fā)展，利用植物細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)一些藥用有效成分在工業(yè)上獲得成功，據(jù)20世紀(jì)80年代末期的統(tǒng)計(jì)，當(dāng)時(shí)全世界有40多種植物的細(xì)胞培養(yǎng)工程研究獲得成功，部分懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中次生物質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到或超過(guò)整體植株的產(chǎn)量，有些藥用植物的研究達(dá)到中試水平，其中利用紫草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧的成功令人矚目5。1984年日本的Mitsui公司利用紫草生產(chǎn)紫草寧規(guī)模達(dá)到750 L，產(chǎn)物最終濃度達(dá)到1400 mgL。20世紀(jì)90年代至今，利用植物細(xì)胞進(jìn)行天然產(chǎn)物的生產(chǎn)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的發(fā)展階段，它與基因工程、快速繁殖形成了新世紀(jì)生物技術(shù)領(lǐng)域的三大主流6。迄今為止，全世界已經(jīng)有1 000多種植物進(jìn)行過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的研究。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物被人類廣泛應(yīng)用，一些天然成分如紫杉醇、紫草寧、迷迭香酸和人參皂甙等已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段。同時(shí)探索出了懸浮培養(yǎng)、兩相培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)、冠癭培養(yǎng)、反義技術(shù)等先進(jìn)的培養(yǎng)方法。據(jù)1996年報(bào)道，國(guó)際上通過(guò)植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行食品成分商業(yè)純生產(chǎn)最成功者是日本。3。下面列出幾個(gè)利用植物培養(yǎng)技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)有用代謝物的例子，如紫杉醇的生產(chǎn)，自從1991年CHRISTEN等人申請(qǐng)有關(guān)紅豆杉組織培養(yǎng)的專利以來(lái)，在培養(yǎng)體系紫杉醇含量已提高100多倍，達(dá)到153 mgL，美國(guó)的Phytoncatalytic公司已在德國(guó)進(jìn)行了75 t發(fā)酵罐的試驗(yàn)；其他如日本三井石油公司生產(chǎn)紫草寧和小檗堿(750 L)、日本日東電工公司生產(chǎn)人參皂甙和花色素(500L)、西德ANattermann&GieGmbH公司生產(chǎn)迷迭香酸(75 000 L)、英國(guó)的辣椒素生產(chǎn)、美國(guó)的香子蘭代謝物生產(chǎn)、加拿大的血根堿生產(chǎn)等7。植物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行有效成分的生產(chǎn)發(fā)展到現(xiàn)在，已經(jīng)取得令人矚目的成就。然而在植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中普遍存在的細(xì)胞系不穩(wěn)定、細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、不耐剪切力及代謝物產(chǎn)量低等問(wèn)題又成為其實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)的瓶頸。在目前已經(jīng)研究過(guò)的植物中，僅有15左右種類的培養(yǎng)物中目的產(chǎn)物的含量接近或超過(guò)原植物，多數(shù)情況下培養(yǎng)合成某些次生代謝物的能力下降甚至消失8。因此充分利用基因工程的手段，篩選高產(chǎn)細(xì)胞系，深入研究特定代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研究和開(kāi)發(fā)適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器是解決這些問(wèn)題的根本途徑。2生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的條件調(diào)控2.1高表達(dá)細(xì)胞系的選擇篩選高產(chǎn)而穩(wěn)定的細(xì)胞系,可以大大增加次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量. 目前,使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)和瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)9 ,生產(chǎn)出帶有目的基因的高產(chǎn)細(xì)胞系,然后進(jìn)行大量篩選,可獲得能生產(chǎn)特定次生代謝產(chǎn)物的目的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)細(xì)胞系目的投資小,成本低,使用安全,植物細(xì)胞的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單,易于成活,便于進(jìn)行遺傳操作。 經(jīng)轉(zhuǎn)化后的目的細(xì)胞系易于儲(chǔ)藏,方便生產(chǎn)。 楊振泉等通過(guò)選擇和改造啟動(dòng)子、改造和優(yōu)化目的基因、進(jìn)行合適的亞細(xì)胞定位,增加了目的細(xì)胞系獲得的概率 10 。轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得目的細(xì)胞系的主要方法有:土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、重組病毒感染植株、基因槍轉(zhuǎn)化法和花粉管通道轉(zhuǎn)化法 11 . 細(xì)胞工程技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合后,人工可設(shè)計(jì)出目的基因,使其控制細(xì)胞系的某些特定的生理性狀,再進(jìn)行篩選,這將引起細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的新突破。2.2合適的環(huán)境條件光照對(duì)次生代謝產(chǎn)物的合成有重要影響. 不同植物細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時(shí),對(duì)光質(zhì)和光量的要求是不同的,如玫瑰茄懸浮細(xì)胞合成花青素時(shí),藍(lán)光是促進(jìn)玫瑰茄細(xì)胞產(chǎn)生花青素的最有效單色光,產(chǎn)量為416 mg/ L ,和全色光差不多,紅光和橙光無(wú)效,其他單色光隨其波長(zhǎng)接近藍(lán)光,正效應(yīng)增強(qiáng)12。植物細(xì)胞培養(yǎng)的最適宜p H 值在56 之間, 但也存在差異。不同種類的植物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度的要求是不同的,最適的溫度為25 左右,超過(guò)30 ,對(duì)生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。較低的溫度有利于生物堿的合成,而高溫則會(huì)導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的合成基本停止13 。接種量影響次生代謝產(chǎn)物的有效積累,接種時(shí)必須滿足一定的接種量。在植物細(xì)胞生物反應(yīng)器及其放大的生產(chǎn)類型中,還要考慮通氣狀況對(duì)次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的影響。 國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)長(zhǎng)春花細(xì)胞生產(chǎn)阿瑪堿時(shí),溶解氧在29 %43 %時(shí),溶解氧與阿瑪堿的產(chǎn)量顯著相關(guān).激素通常作為誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)愈傷組織生長(zhǎng)的重要因素而用于次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn),當(dāng)然也有特殊不需激素的情況,如Ri 質(zhì)粒誘導(dǎo)的毛狀根在無(wú)激素培養(yǎng)基上培養(yǎng),可迅速增殖。2. 3 合適培養(yǎng)基的選用改良的B5 培養(yǎng)基利于愈傷組織的誘導(dǎo)和以后的培養(yǎng)。培養(yǎng)基中糖濃度直接影響某些細(xì)胞的干重和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,不同植物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基成分的需求也各不相同。3 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用前景雖然植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物在過(guò)去幾十年取得了飛速發(fā)展，但真正應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)的事例不多，就目前的工藝，以低于1 000$kg的生產(chǎn)成本來(lái)獲得某種次生代謝物是困難的14，況且許多基礎(chǔ)理論和工程技術(shù)問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。展望未來(lái)，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要想實(shí)現(xiàn)真正意義的工業(yè)化，必須從以下幾方面努力：(1)篩選高產(chǎn)細(xì)胞系；(2)利用基因工程手段，對(duì)次生代謝中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行修飾和改造，提高次生代謝物的產(chǎn)量；(3)與工程技術(shù)相結(jié)合，針對(duì)不同的培養(yǎng)體系，研制高效的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。隨著這幾方面研究的不斷深入，植物細(xì)胞培養(yǎng)這種方興未艾的技術(shù)將在生產(chǎn)有價(jià)值的植物天然成分方面發(fā)揮越來(lái)越大的作用。參考文獻(xiàn)1董妍玲，潘學(xué)武植物次生代謝產(chǎn)物簡(jiǎn)介J生物舉通報(bào)，2002，37(11):1719.2采關(guān)玲，楊謙，高興喜，等植物細(xì)胞培養(yǎng)中天然植物成分生產(chǎn)在工地上應(yīng)用j東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，31(5)：78803彭志莢食品生物技術(shù)M北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，19994 GIRI A，DHINGRA V，GIRI C C，et a1。Biotransformationsusing plant cells，organ cultures and enzymesystems：current trends and future prospectsjBiotechnologyAdvances，2001，19：1751995 CURTIN M EHarvesting profitable products fremplanttissue cultureJBiol Tech，1983，(1)：6496576 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