植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究進展.doc

植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究進展 08生物科學 081003011 余蕓摘要： 利用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物具有十分廣闊的前景。對利用植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的條件控制、生產(chǎn)方法和在制藥工業(yè)上的應用進行了綜述,并對該技術的發(fā)展趨勢進行了展望。關鍵字：植物細胞培養(yǎng) 次生代謝產(chǎn)物 工業(yè)應用植物細胞培養(yǎng)始于本世紀初，并不可爭議地具有工業(yè)化潛力。目前植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的化合物很多，包括糖類、酚類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸以及帖類和生物堿等初生和次生代謝產(chǎn)物，植物細胞培養(yǎng)的應用主要包括以下3個方面：有用物質(zhì)（次生代謝產(chǎn)物）的生產(chǎn)；植物無性系的快速繁殖和遺傳突變體的篩選；植物細胞遺傳、生理、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的局限性使得植物細胞仍難以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，迫切需要進一步研究和發(fā)展細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化控制及其工藝。1 植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究歷史及現(xiàn)狀植物次生代謝的概念是在1891年南KOSSZEL首先明確提出的1。植物細胞培養(yǎng)技術源于德國著名植物學家HABERLANDT(1902)提出的細胞全能性學說。植物細胞具備生物合成的全能性，即每個培養(yǎng)細胞保留著完整的遺傳信息，能生產(chǎn)所有母體植物中合成的化學物質(zhì)。11植物細胞培養(yǎng)技術特點與其它的方法相比，應用植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物爨有以下優(yōu)點：(1)能夠保證產(chǎn)物在一個限定的生產(chǎn)系統(tǒng)中連續(xù)、均勻生產(chǎn)，不受病蟲害、地理和季節(jié)等各種環(huán)境因素的影響；(2)可以在生物反應器中進行大規(guī)模培養(yǎng)，并通過控制環(huán)境條件得到超過整株植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物；(3)所獲得的產(chǎn)物可從培養(yǎng)體系內(nèi)直接提取，并快速、高效的回收與利用，簡化了分離與純化的步驟；(4)有利于細胞篩選、生物轉(zhuǎn)化，合成新的有效成分2。；(5)有利于研究植物的代謝途徑，還可以利用某些基因工程手段探索與創(chuàng)造薪的合成路線，得到價值更高的產(chǎn)品；(6)節(jié)省大量用于種植原料的農(nóng)田，以便進行糧食作物的生產(chǎn)。12植物細胞培養(yǎng)技術研究歷史與現(xiàn)狀1956年ROUTIOR秘NIKZELL首次提出應用植物細胞培養(yǎng)技術商業(yè)化生產(chǎn)植物化合物的設想，1967年KAUL和STABA采用多并發(fā)酵罐對Ammivisnaga進行了細胞大量培養(yǎng)的研究，并首次用此方法得到了藥用成分呋哺色酮，使這一設想變?yōu)楝F(xiàn)實3。但是，由于植物細胞培養(yǎng)體系中細胞生長緩慢，目標代謝產(chǎn)物極低(通常不到細胞于重的1)4等特點，再加上植物細胞所特有的生理生化特性還沒被人們所認識，人們單純的模擬培養(yǎng)微生物的條件來培養(yǎng)植物細胞及當時有效成分的分析手段落后等原因，人們并沒有看到該技術在生產(chǎn)天然產(chǎn)物方面的潛能。20世紀70年代以后，該技術有所發(fā)展，利用植物細胞工程技術生產(chǎn)一些藥用有效成分在工業(yè)上獲得成功，據(jù)20世紀80年代末期的統(tǒng)計，當時全世界有40多種植物的細胞培養(yǎng)工程研究獲得成功，部分懸浮細胞培養(yǎng)體系中次生物質(zhì)的產(chǎn)量達到或超過整體植株的產(chǎn)量，有些藥用植物的研究達到中試水平，其中利用紫草懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧的成功令人矚目5。1984年日本的Mitsui公司利用紫草生產(chǎn)紫草寧規(guī)模達到750 L，產(chǎn)物最終濃度達到1400 mgL。20世紀90年代至今，利用植物細胞進行天然產(chǎn)物的生產(chǎn)進入了一個嶄新的發(fā)展階段，它與基因工程、快速繁殖形成了新世紀生物技術領域的三大主流6。迄今為止，全世界已經(jīng)有1 000多種植物進行過細胞培養(yǎng)的研究。利用植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物被人類廣泛應用，一些天然成分如紫杉醇、紫草寧、迷迭香酸和人參皂甙等已進入工業(yè)化生產(chǎn)階段。同時探索出了懸浮培養(yǎng)、兩相培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)、冠癭培養(yǎng)、反義技術等先進的培養(yǎng)方法。據(jù)1996年報道，國際上通過植物細胞和組織培養(yǎng)的方法進行食品成分商業(yè)純生產(chǎn)最成功者是日本。3。下面列出幾個利用植物培養(yǎng)技術工業(yè)化生產(chǎn)有用代謝物的例子，如紫杉醇的生產(chǎn)，自從1991年CHRISTEN等人申請有關紅豆杉組織培養(yǎng)的專利以來，在培養(yǎng)體系紫杉醇含量已提高100多倍，達到153 mgL，美國的Phytoncatalytic公司已在德國進行了75 t發(fā)酵罐的試驗；其他如日本三井石油公司生產(chǎn)紫草寧和小檗堿(750 L)、日本日東電工公司生產(chǎn)人參皂甙和花色素(500L)、西德ANattermann&GieGmbH公司生產(chǎn)迷迭香酸(75 000 L)、英國的辣椒素生產(chǎn)、美國的香子蘭代謝物生產(chǎn)、加拿大的血根堿生產(chǎn)等7。植物細胞培養(yǎng)進行有效成分的生產(chǎn)發(fā)展到現(xiàn)在，已經(jīng)取得令人矚目的成就。然而在植物細胞培養(yǎng)過程中普遍存在的細胞系不穩(wěn)定、細胞生長緩慢、不耐剪切力及代謝物產(chǎn)量低等問題又成為其實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸。在目前已經(jīng)研究過的植物中，僅有15左右種類的培養(yǎng)物中目的產(chǎn)物的含量接近或超過原植物，多數(shù)情況下培養(yǎng)合成某些次生代謝物的能力下降甚至消失8。因此充分利用基因工程的手段，篩選高產(chǎn)細胞系，深入研究特定代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，研究和開發(fā)適合植物細胞培養(yǎng)的生物反應器是解決這些問題的根本途徑。2生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的條件調(diào)控2.1高表達細胞系的選擇篩選高產(chǎn)而穩(wěn)定的細胞系,可以大大增加次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量. 目前,使用轉(zhuǎn)基因技術中的穩(wěn)定表達系統(tǒng)和瞬時表達系統(tǒng)9 ,生產(chǎn)出帶有目的基因的高產(chǎn)細胞系,然后進行大量篩選,可獲得能生產(chǎn)特定次生代謝產(chǎn)物的目的細胞系。轉(zhuǎn)基因技術生產(chǎn)細胞系目的投資小,成本低,使用安全,植物細胞的培養(yǎng)條件簡單,易于成活,便于進行遺傳操作。 經(jīng)轉(zhuǎn)化后的目的細胞系易于儲藏,方便生產(chǎn)。 楊振泉等通過選擇和改造啟動子、改造和優(yōu)化目的基因、進行合適的亞細胞定位,增加了目的細胞系獲得的概率 10 。轉(zhuǎn)基因技術獲得目的細胞系的主要方法有:土壤農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、重組病毒感染植株、基因槍轉(zhuǎn)化法和花粉管通道轉(zhuǎn)化法 11 . 細胞工程技術與分子生物學技術結(jié)合后,人工可設計出目的基因,使其控制細胞系的某些特定的生理性狀,再進行篩選,這將引起細胞培養(yǎng)技術的新突破。2.2合適的環(huán)境條件光照對次生代謝產(chǎn)物的合成有重要影響. 不同植物細胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時,對光質(zhì)和光量的要求是不同的,如玫瑰茄懸浮細胞合成花青素時,藍光是促進玫瑰茄細胞產(chǎn)生花青素的最有效單色光,產(chǎn)量為416 mg/ L ,和全色光差不多,紅光和橙光無效,其他單色光隨其波長接近藍光,正效應增強12。植物細胞培養(yǎng)的最適宜p H 值在56 之間, 但也存在差異。不同種類的植物細胞培養(yǎng)對溫度的要求是不同的,最適的溫度為25 左右,超過30 ,對生長有明顯的抑制作用。較低的溫度有利于生物堿的合成,而高溫則會導致次生代謝產(chǎn)物的合成基本停止13 。接種量影響次生代謝產(chǎn)物的有效積累,接種時必須滿足一定的接種量。在植物細胞生物反應器及其放大的生產(chǎn)類型中,還要考慮通氣狀況對次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的影響。 國外學者研究發(fā)現(xiàn):利用生物反應器培養(yǎng)長春花細胞生產(chǎn)阿瑪堿時,溶解氧在29 %43 %時,溶解氧與阿瑪堿的產(chǎn)量顯著相關.激素通常作為誘導和調(diào)節(jié)愈傷組織生長的重要因素而用于次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn),當然也有特殊不需激素的情況,如Ri 質(zhì)粒誘導的毛狀根在無激素培養(yǎng)基上培養(yǎng),可迅速增殖。2. 3 合適培養(yǎng)基的選用改良的B5 培養(yǎng)基利于愈傷組織的誘導和以后的培養(yǎng)。培養(yǎng)基中糖濃度直接影響某些細胞的干重和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,不同植物細胞對培養(yǎng)基成分的需求也各不相同。3 植物細胞培養(yǎng)技術應用前景雖然植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物在過去幾十年取得了飛速發(fā)展，但真正應用于商業(yè)化生產(chǎn)的事例不多，就目前的工藝，以低于1 000$kg的生產(chǎn)成本來獲得某種次生代謝物是困難的14，況且許多基礎理論和工程技術問題有待于進一步研究。展望未來，植物細胞培養(yǎng)技術要想實現(xiàn)真正意義的工業(yè)化，必須從以下幾方面努力：(1)篩選高產(chǎn)細胞系；(2)利用基因工程手段，對次生代謝中的關鍵酶基因進行修飾和改造，提高次生代謝物的產(chǎn)量；(3)與工程技術相結(jié)合，針對不同的培養(yǎng)體系，研制高效的生物反應器系統(tǒng)。隨著這幾方面研究的不斷深入，植物細胞培養(yǎng)這種方興未艾的技術將在生產(chǎn)有價值的植物天然成分方面發(fā)揮越來越大的作用。參考文獻1董妍玲，潘學武植物次生代謝產(chǎn)物簡介J生物舉通報，2002，37(11):1719.2采關玲，楊謙，高興喜，等植物細胞培養(yǎng)中天然植物成分生產(chǎn)在工地上應用j東北林業(yè)大學學報，2003，31(5)：78803彭志莢食品生物技術M北京：中國輕工業(yè)出版社，19994 GIRI A，DHINGRA V，GIRI C C，et a1。Biotransformationsusing plant cells，organ cultures and enzymesystems：current trends and future prospectsjBiotechnologyAdvances，2001，19：1751995 CURTIN M EHarvesting profitable products fremplanttissue cultureJBiol Tech，1983，(1)：6496576 朱西儒，雷光富。藥用植物細胞培養(yǎng)代謝全能性及產(chǎn)物檢測技術的研究進展J廣西科學院學報，1998，14(5)：16。7鐘建江，沈林南，王斯靖植物細胞培養(yǎng)工程的最新進展j。工業(yè)微生物，1995，25(1)：2529。8 肖春橋，張華香，高洪，等促進植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的幾種途徑J武漢化工學院學報，2005，27(1)：28319 高書穎,郭藹光,金偉波,等. 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白研究進展J . 西北植物學報,2003 ,23 (6) 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