基因工程(全英).ppt

全國高等醫(yī)藥教材建設(shè)研究會衛(wèi)生部規(guī)劃教材全國高等學校教材供七 八年制臨床醫(yī)學等專業(yè)用醫(yī)學分子生物學MedicalMolecularBiology主編馮作化人民衛(wèi)生出版社2005年8月第一版課件制作 吳耀生 版權(quán)所有 廣西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室2009 12 第十三章 基因工程與基因體外表達 GeneEngineeringandGeneExpression 目的與意義 1 獲得感興趣的目的基因 2 研究基因結(jié)構(gòu)特征 3 表達基因產(chǎn)物 4 研究基因功能 基本要素 1 目的基因 targetgenes 2 工具酶 toolenzymes 3 載體 vectors 4 宿主細胞 hostcells Maincontents 工具酶 DNA載體 基因克隆過程 真核細胞基因轉(zhuǎn)染 基因改造 克隆基因表達 電子克隆 基本概念及背景 ForExample 如何從植物中克隆法呢基焦磷酸合酶 FPS 1 查資料認識FPS 2 設(shè)計實驗方案 3 可行性分析 ForExample FPS克隆 RT PCR 3 RACE 5 RACE 改進的異硫氰酸胍一步法提取三七根部總RNA RT PCR擴增fps部分保守序列 3 RACE及克隆測序 5 RACE及克隆測序 序列拼接 mRNA 5 AAAAAA3 TTTTTTT 接頭 cDNA OligodT接頭 基因特異性引物 3 FullRACE原理圖 5 FullRACE原理圖 1 5 端磷酸化RT Primer 逆轉(zhuǎn)錄 RNA分解 用RNAligase進行環(huán)化或形成首尾連接物 1stand2ndPCR 5 端磷酸化RTprimer部位 包含未知的5 上游區(qū)域的擴增產(chǎn)物 2 3 4 ThankYou DNA重組DNArecombination Someconcernedconcepts DNA重組技術(shù)DNArecombinationtechnique 分子克隆Molecularcloning 基因工程Geneticengineering 克隆Cloning 三大理論基礎(chǔ) 1953年 Watson和Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復制原理 解決了基因的自我復制和傳遞的過程 40年代 O T Avery等通過肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗發(fā)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì) 50年代末到60年代初 相繼提出了 中心法則 和操縱子學說 成功破譯了遺傳密碼 闡明了遺傳信息的流向和表達問題 三大技術(shù)發(fā)明 DNA分子的體外切割與連接技術(shù)1970年Smith Wilcox流感嗜血桿菌 Haemopbilusinfluenzae HindII1972年BoyerEcoRI GAATTC 1967年世界上5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNAligase1970年T4DNAligase 大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立 復制工廠 基因工程載體的使用 plasmid phage viruses 1978年Nobel醫(yī)學與生理學獎 TheNobelPrizeinMedicinewasawarded in1978 toDanielNathans WernerArber andHamiltonSmithforthediscoveryofrestrictionendonucleases TheirdiscoveryleadtothedevelopmentofrecombinantDNAtechnologythatallowed forexample thelargescaleproductionofhumaninsulinfordiabeticsusingE colibacteria Over3000restrictionenzymeshavebeenstudiedindetail andmorethan600oftheseareavailablecommerciallyandareroutinelyusedforDNAmodificationandmanipulationinlaboratories DNAligaserepairingchromosomaldamage ligaseI DNA ATP dependent 第一節(jié)基因克隆是利用工具酶進行操作 工具酶 Toolenzymes 用于對DNA分子進行定點切割 連接 擴增 標記等操作的特殊酶類 已被純化并商品化進行應用 一 限制酶 RE restrictionendonuclease 二 其他工具酶 othertoolenzymes 一 RE在基因克隆中用于切割DNA RE restrictionenzyme restrictionendonuclease 限制性核酸內(nèi)切酶 限制酶 能識別DNA雙鏈內(nèi)特異位點并水解磷酸二酯鍵 產(chǎn)生特定末端的酶 RestrictionenzymeFunctions 能識別DNA內(nèi)部特異位點并且裂解磷酸二酯鍵 1 Sortingofrestrictionenzyme有三型 但最重要的是II型酶 2 NamingofRE 細菌屬名 細菌種名 細菌菌株 編號 EscherichiacoliRY13I 屬 Genus 種 species 菌株 strain EcoRI Twocatalyticmanganeseions onefromeachmonomer areshownasmagentaspheresandareadjacenttothecleavedsitesintheDNAmadebytheenzyme depictedasgapsintheDNAbackbone StructureofthehomodimericrestrictionenzymeEcoRI cyanandgreencartoondiagram boundtodoublestrandedDNA browntubes basedonthePDB1QPSX raycrystallographiccoordinates 3 限制酶的識別和切割位點Characters 通常識別4 6個堿基 少數(shù)識別8個所識別的序列一般為回文結(jié)構(gòu) palindrome 在特異位點內(nèi)切割DNA雙鏈 產(chǎn)生兩種末端 粘性末端 平端 5 粘性末端 3 粘性末端 5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5 5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5 平端切割 bluntend suchasSmaI Goto109 5 GGTGAATTCAGC 3 3 CCACTTAAGTCG 5 5 TTGCTGCAGAAG 3 3 AACGACGTCTTC 5 5 粘性末端 EcoRI 3 粘性末端 PstI 5 GGTGAATTCAGC 3 3 CCACTTAAGTCG 5 5 TTGCTGCAGAAG 3 3 AACGACGTCTTC 5 4 同工異源酶 isoschizomers 來源不同 但能識別和切割同一位點的RE例 BamHI不需ATPRE識別序列長度與切點數(shù) 對同一DNA 識別序列短的 切點數(shù)多 片段較短 反之則反之 二 基因克隆需要具有不同功能的工具酶 其他工具酶 用于對DNA分子進行多種操作 也叫修飾酶 作用 剪切 補平 連接 化學修飾等 常用 1 DNApolymeraseI KlenowFragment 2 Reversetranscriptase 3 T4DNAligase 4 Alkalinephosphatase 5 Terminaldeoxynucleotidyltransferase TdT 6 TaqDNApolymeraseSoon 1 DNApolymeraseIActivities 5 3 聚合活性 5 3 及3 5 外切活性Functions 在生物體內(nèi) 填補引物切除后留下的空缺 修復在生物體外 缺口平移制備探針 DNApolymeraseI Klenowfragment 76KD Anothersmallfragment 枯草桿菌蛋白酶 Klenow片段 E coliDNApolI 5 3 外切酶 5 3 聚合酶 3 5 外切酶 用枯草桿菌蛋白酶裂解全酶 5 3 聚合酶 3 5 外切酶 Klenowfragment用途 1 補齊雙鏈DNA的3 末端2 通過補齊3 端使3 端標記3 在cDNA克隆中 第二股鏈的合成4 DNA序列分析 常用的reversetranscriptase 禽類成骨細胞性白血病病毒 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 2 Reversetranscriptase 用途 合成cDNA 構(gòu)建cDNA文庫 Moloney小鼠白血病病毒 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 第二節(jié)基因克隆需要特定的DNA載體 基因克隆為什么需要載體 載體的類型 克隆載體 表達載體 載體的來源 細菌質(zhì)粒 噬菌體DNA DNA M13DNA 病毒DNA 人工載體 cosmid 等 DNA載體 vector 能與DNA片段連接 構(gòu)建成新的重組DNA分子 并可攜帶該外源DNA片段進入一定宿主細胞 在宿主中擴增甚至表達 并有遺傳標記進行篩選 載體的概念 Cloningvector 能夠攜帶感興趣的外源DNA targetDNA 進入宿主細胞 并將外源DNA在宿主內(nèi)進行克隆和擴增 而采用的一些DNA分子稱為Cloningvector Cloningvectorclasses PlasmidDNA 質(zhì)粒DNA PhageDNA 噬菌體DNA VirusDNA 病毒DNA Expressionvector 能使外源基因在宿主中表達的載體 Expressionvector 含表達調(diào)控有關(guān)的元件 WhenEcoliisusedashostcell plasmid phage cosmid M13phagecanusuallybeusedasvectors 載體的本質(zhì)是什么 Vectorcharacters cloningvector 能在宿主細胞中自我復制 自我表達分子相對較小 在宿主細胞中有高拷貝具有遺傳標志有多個限制性酶單一酶切位點 多克隆位點 易與宿主DNA相分離 一 常用克隆載體主要來自質(zhì)粒和病毒 一 質(zhì)粒是常用的克隆載體 Examples pBR322pUC Characters Smallmolecularweight highcopiesMorethanonegeneticmarkMultiplecloningsites MCS pBR322 Turnto64 pUC19 二 噬菌體經(jīng)過重組也可以攜帶外源DNA Examples bacteriophage phage M13phageItisakindofviruswhichcaninfectbacteria bacteriophagesincommonuse EMBLspectrum gtspectrumCharonspectrum bacteriophage phage 噬菌體是侵犯細菌的病毒 在菌體內(nèi)為環(huán)狀DNA分子 分離產(chǎn)物為雙鏈線狀DNA分子 有天然的粘性末端 稱COS位點 進入宿主菌后可自行環(huán)合 基因組DNA長約為48 5Kb 共有66個基因 較復雜 Character 1 其生長必需的序列位于左右二臂上 中部約30 為生長非必需 2 成熟需要包裝 大小為原來的75 105 時 Twokindsofvectors 置換型載體 插入型載體 置換型 噬菌體載體 用限制酶切除中央片段供目的基因替代 目的基因與左 右載體兩臂結(jié)合 替代片段可達9 23Kb 左臂 中央片段 右臂 酶切點 酶切點 切除后用目的基因取代 COS位點 COS位點 12bp Thelifeperiodof phage 噬菌體的生活周期 Lysogenicpathway 溶原生長途徑 Lysispathway 溶菌生長途徑 溶原生長 溶菌生長 溶原轉(zhuǎn)溶菌生長 以噬菌體為媒介的轉(zhuǎn)導作用 gt10 insertionvector multiplecloningsite CI Thepositivemarksofscreening Whethertherecombinantvectorcanbewrapped IfnoextraneousDNAreplaced thevectorwouldbetoosmalltobewrapped Withinsertion CIactivitylost tobetransparentspots Withoutinsertion CIkeepsintact tobeturbidspots gt11 insertionvector MCS lacZ expressed Withinsertionintolaczof gt11 whitespotsOtherwisebluespots 四 粘性質(zhì)粒適合克隆較大的DNA片段 粘性質(zhì)粒 cosmid 由 DNA的cos區(qū)與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體 具有與質(zhì)粒相同的結(jié)構(gòu)特點 為雙鏈環(huán)狀DNA Itisconstructedwiththecosregionof DNAandplasmid whichisdoublecycleDNAwithbiggercontentforcloning 40 50kb Characters 1 Withantibioticsmarksandreplicationelementitself2 Withcosregionof phage canbewrapped3 Withoneormorecloningsites4 Smallmolecularweight5 non recombinationcosmidtoosmalltobewrapped soitisscreenedeasily 三 M13噬菌體適合制備單鏈DNA M13bacteriophage ItisakindofEcoliphage thegenome6 5kb acycleDNAcontainingsinglestrandDNA Twoforms Wildform Replicationform RF Themostmerit Canbereleasedfromhostassinglestrand M13phageCharacters Invivo doublestrandsDNA canbereplicated Invitro singlestrandDNA canbeusedastemplateforDNAsequencing ormakeDNAprobesforhybridization Afterenteringhostcells itisreplicatedtodoublestrandsDNAandbecomesreplicationalformDNA RFDNA whichcanbeusedascloningvector 五 病毒載體可將外源DNA帶入哺乳動物細胞 Virusvectorsincommonuse 逆轉(zhuǎn)錄病毒 腺病毒 腺相關(guān)病毒 EB病毒等病毒載體 可將外源基因?qū)胧荏w細胞 Characters 多數(shù)均已質(zhì)?；?由病毒啟動子 包裝元件 選擇性遺傳標記及pBR322復制起始點組成 Othervectors YAC yeastartificialchromosome 0 5 2Mb BAC bacterialartificialchromosome 0 4Mb 二 表達載體將外源基因帶入宿主并表達 ExpressionvectorsConcept Theconditionsforexpressionvector Withexpressionstructuresexceptforthecharactersofcloningvectors ThevectorswhichcanmaketheextraneousDNAbeexpressedinhostcellsaretermedasexpressionvectors Sorts ExpressionvectorsofEcoli prokaryote Expressionvectorsofeukaryote Expressionvectorsofmammalanimals 一 原核表達載體適于原核細胞表達外源基因 ExpressionvectorsofEcoli 除克隆所需成分外 還含有啟動子 核糖體結(jié)合位點 轉(zhuǎn)錄終止序列等表達元件 Trp lacpromoter ortacpromoter Inducer IPTGStrains RB791 XL 1 blue SB221 JM109 1 Promoter T7ofT7phageItisahigheffectiveexpressionpromoterStrain JM109 DE3 PLof phage temperatureinducepromoter ControlledbycIts857 sensitivetotemperature clts857為溫度敏感阻抑物Strain M5219 原核生物mRNA與核蛋白體小亞基結(jié)合的分子機制 A U UCCU C CACUAGG 核蛋白體小亞基的16S rRNA 5 AGGAPuPuUUUPuPuAUG 3 mRNA Rps辨認序列 SD序列 Ribosome bindingsite RBSIncludingAUG SDsequence 2 核糖體結(jié)合位點 RBS 作用 3 轉(zhuǎn)錄終止序列 保證外源基因在宿主中的高效表達 使讀碼框架能夠正確轉(zhuǎn)錄 二 真核表達載體適于真核細胞表達外源基因 Eukaryoteexpressionvectors 含有一定的原核序列 Ecoli中的ori位點 antibacterialsite 含有一定的真核序列 真核細胞中的藥物抗性基因 真核表達組件 如真核復制起點 啟動子 增強子 克隆位點 加尾信號等 ExpressionvectorsofmammalanimalIfageneneedstobeexpressedinmammalanimalcells theeukaryoteexpressionvectormustbeused Theessentialelementsincluding Replicaorigin antibioticssites eukaryotepromoter enhancer cloningsites terminationsignal polyAsignal 第三節(jié)基因克隆過程包括五個基本部分 Genecloningprocess 1 制備目的基因及相關(guān)載體 2 將目的基因與載體進行連接 3 將重組DNA導入受體細胞 4 DNA重組體的篩選與鑒定 5 DNA重組體擴增 表達及其他研究 分 切 接 篩 轉(zhuǎn) 一 采用不同方法獲取目的基因 Methodstogetatargetgene 1 Topreparegenomiclibrary 2 TopreparecDNAlibraryorcDNA 3 ToPCR 4 TosynthesizetheDNAfragmentbychemicalmethod 一 從基因組文庫中獲得目的基因 Genomiclibrary 指含有一個機體基因組DNA的全套重組DNA分子的克隆群體 用于構(gòu)建基因組文庫的載體 噬菌體 phage 粘性質(zhì)粒 cosmid Genomiclibraryconstruction 分離高分子量DNA 分離回收15 25kb的DNA片段 部分消化 以切成一定大小片段 回收片段與適當載體連接 所有重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細胞并擴增 基因組文庫 隨機文庫克隆數(shù)目計算 隨機文庫指代表基因組各部分DNA的摩爾數(shù)相等 對于隨機文庫 有 N 克隆數(shù)目 P 設(shè)定的概率值 如 0 99 x 插入片段平均大小 15 20kb y 植物基因組大小 以kb計 如果插入片段平均大小為20kb 某植物基因組大小為4x108bp P 0 99時 根據(jù)上式 N 1X105 含1X105個克隆的基因文庫相當覆蓋了5倍的基因組 在片段隨機分布時 從文庫中找到任一序列的概率不低于0 99 植物基因組大小及克隆文庫所需噬菌斑數(shù) 植物種類基因組大小 bp a重組噬菌斑數(shù)b 擬南芥7 7X1072 1X104 大豆8 7X1082 4X105 菜豆1 8X1094 9X105 碧東茄1 9X1095 1X105 煙草3 8X1091 0X106 玉米3 9X1091 1X106 小麥1 5X10104 1X106 a 基因組大小引自Rogers和Bendich b 假設(shè)插入片段為17kb 概率為0 99 二 從cDNA文庫中獲得目的基因 cDNAlibrary 指含有一個機體某種特定細胞或特定狀態(tài)下表達基因的全部cDNA克隆的群體 cDNAlibrarycharacters 不含內(nèi)含子 用mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建 cDNAlibraryvectors gt10 gt11 Ziploxetal cDNAlibraryconstruction 分離mRNA RNaseH水解去掉mRNA 以oligo dT 為引物 合成cDNA第一鏈 隨機引物 DNApolI合成第二鏈 修齊兩端 加人工接頭 與載體連接 得到cDNA重組體 所有cDNA重組體均轉(zhuǎn)入宿主擴增 cDNA文庫 三 利用PCR技術(shù)獲得目的基因 采用T載體 AT克隆 pGEM Tvector pMD18 TVector 合成長度有限 可人工設(shè)計相應的序列 不必使用天然模板 四 人工合成目的基因 Plasmid phagecosmidM13phage Capacity 10kb 22kb40 50kb 1kbofcloninggDNAlibrary cDNAlibrary Subcloning Sequencing Ecoliexpression 二 依據(jù)基因克隆的目的選擇和準備載體 Cloningvectorsincommonuse 1 TheligationbycohesiveendsAdvantage easilylinkedDisadvantage easilytobecycledselfbidirectioninsertion 2 Theligationwithartificiallinker 3 Theligationwithhomopolymerictail 4 TheligationbybluntendsHighATPcon T4DNAligaseshouldbeused 三 選擇適當?shù)牟呗詫NA片段進行連接 Methodsincommonuse 一 粘性末端的連接 全同源粘性末端最方便 但載體自身環(huán)化 并為雙向插入 例 用EcoRI分別切割載體和目的DNA 切割載體 切割目的DNA 雙向插入示意圖 粘性末端的連接 二 用人工接頭法克隆cDNA 連接酶 堿性磷酸酶 三 同聚物接尾法克隆雙鏈DNA 轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗?退火 載體 一 轉(zhuǎn)化 transformation 四 重組DNA需要導入宿主細胞進行擴增 Methodsincommonuse 二 感染 infection 三 轉(zhuǎn)染 transfection 四 電穿孔 electroporation 一 轉(zhuǎn)化是直接將DNA導入細菌的方法 Transformation 指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導入處于感受態(tài)的宿主菌 并使其獲得新的表型的過程 宿主菌 Ecoli 感受態(tài)細胞的制備 低溫CaCl2處理 使細胞通透性增加 易于攝取外源DNA 這種細胞稱為感受態(tài)細胞 competentcell 二 感染是利用噬菌體將外源DNA導入宿主 Infection 指 噬菌體 粘性質(zhì)?；蛘婧思毎《緸檩d體的重組DNA分子 在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒 然后感染適當宿主細胞的過程 用于包裝的宿主菌 琥珀突變株Dam溶菌物 含頭部蛋白 突變株Eam溶菌物 含尾部蛋白 Dam溶菌物 Eam溶菌物 DNA重組體 包裝噬菌體 重組有外源DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 感染 輔助病毒 2細胞 包裝成病毒顆粒有感染能力 三 轉(zhuǎn)染是將外源DNA導入真核細胞的方法 Transfection 指真核細胞主動攝取或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程 Methods 電穿孔 磷酸鈣共沉淀法 脂質(zhì)體融合法 進入細胞的DNA存在方式 染色體外 整合至宿主基因組中 一 遺傳學方法 五 重組DNA導入宿主后篩選與鑒定 Methodsincommonuse 二 免疫學方法 檢測表達產(chǎn)物 三 核酸雜交 四 PCR技術(shù) 抗性標記 表型標記 插入失活 互補 五 酶切鑒定 Goto23 Goto103 Goto104 Goto105 第四節(jié)真核細胞基因轉(zhuǎn)染 Transfection 指真核細胞主動攝取或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程 一 真核細胞轉(zhuǎn)染的方法與基本原理 二 轉(zhuǎn)染細胞可利用抗性標記進行篩選 一 磷酸鈣共沉淀示介導基因轉(zhuǎn)染 一 真核細胞轉(zhuǎn)染的方法與基本原理 Methodsincommonuse 二 電穿孔法介導基因轉(zhuǎn)染 electroporation 三 DEAE 葡聚糖法介導基因轉(zhuǎn)染 DEAE dextran 四 脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染 liposome 五 顯微注射法 microinjection Calciumphosphateco precipitation 1 Electroporation 電穿孔法 ExtraneousDNA Hostcells Electricitywithhighfrequency 一 利用TK 細胞突變株進行轉(zhuǎn)染細胞篩選 二 轉(zhuǎn)染細胞可利用抗性標記進行篩選 Methodsincommonuse 二 藥物篩選轉(zhuǎn)染細胞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選 一 利用TK 細胞突變株進行轉(zhuǎn)染細胞篩選 Principle TK thymidinekinase 是催化核苷酸補救合成的關(guān)鍵酶 氨基喋呤 aminopterin A 是從頭合成途徑的抑制劑 A的加入使細胞主要依賴于補救合成 TK 選擇系統(tǒng) Host TK 細胞株 TK表達缺陷 培養(yǎng)基 HAT培養(yǎng)基 H hypoxanthine A aminopterin T thymine Tk 氨基蝶呤 A 處理 抑制二氫葉酸還原酶 四氫葉酸逐漸耗盡 dUMP dATPdCTP H dATPdCTP T dTTP Tk 培養(yǎng)基含H T A 細胞不能存活 細胞能夠存活 補救合成 tk基因?qū)雝k 細胞 細胞能夠存活 在含HAT培養(yǎng)基中 tk選擇系統(tǒng)原理圖解 越過A的抑制 Thescreeningwithantibiotics G418 geneticin 新霉素衍生物 二 藥物篩選轉(zhuǎn)染細胞 Themostusedantibioticmarker neor 新霉素抗性選擇系統(tǒng) 新霉素 干擾原核生物蛋白合成 不影響真核生物蛋白合成 新霉素類似物G418 干擾原核生物蛋白合成 干擾真核生物蛋白合成 細菌新霉素抗性基因neor 表達氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 APH 使G418失活 表達neor的細胞可在含G418的培養(yǎng)基中存活 第五節(jié)利用重組DNA技術(shù)進行基因改造 Methodsincommonuse 定點誘變技術(shù) 寡核苷酸介導定點誘變技術(shù) PCR介導定點誘變技術(shù) 目的 改變基因的一級序列特征 一 對特定基因可進行定點誘變 Whatisthesite directedmutagenesis 目的基因的定點誘變 Itmeanstheprocessthattheoneormoresitesofgenebereplacedordeletedbyartificialmethod 一 帶突變位點的寡核苷酸可介導定點誘變 Thesite directedmutagenesismediatedbyoligonucleotide Characters Itcancausefinelythemutagenesisatthespecialsiteaccordingtothedesignofresearchers Processes 1 TheuseofKlenowfragmentandaprimerwithanincorrectpairedbase M13assinglestrandtemplate 2 ToextendtheprimertogetaheterozygousdoublestrandsDNA 3 TotransformtheheterozygousDNAintoEcoli thewildDNAandmutatedDNAwillbeyielded 4 ToscreenanddecidethemutatedDNA furtherresearchthemutatedDNA 誘變寡核苷酸引物 單鏈M13模板 Klenowfragment dNTP T4DNApol 雜交雙鏈DNA 轉(zhuǎn)化Ecoli 瓊脂平皿 標記誘變寡核苷酸原位分子雜交放射自顯影 寡核苷酸介導的定點誘變基本實驗步驟 理論上最高誘變效率只有50 二 含U模板可以提高寡核苷介導定點誘變效率 Principle 建立含U單鏈模板 U取代T 正鏈 合成雜合雙鏈DNA 雜合雙鏈DNA轉(zhuǎn)化野生型Ecoli中 尿嘧啶核苷酶降解含U的正鏈 帶誘變位點的負鏈能保存 合成雙鏈DNA 突變體突變率90 誘變寡核苷酸引物 Klenowfragment dNTP T4DNApol 轉(zhuǎn)化野生型Ecoli 含尿嘧啶核苷酶 可降解含U模板 標記誘變寡核苷酸原位分子雜交放射自顯影 U模板介導的定點誘變基本實驗步驟 含突變體的負鏈保存下來并進行復制擴增 篩選鑒定 突變率90 三 PCR技術(shù)適合進行基因的定點誘變 Principle 兩對引物 三次PCR 一對常規(guī)引物a d 一對帶誘變點的引物b c a b及d c分別擴增出兩個帶突變點的片段 上述兩個片段等量混合 變性 退火 用KlenowDNA聚合酶補齊 利用a d引物對進行PCR擴增 即得所需片段 5 5 3 3 a b c d 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 5 5 3 3 a d 5 3 5 3 PCR1 PCR2 變性 退火 Klenowfragment dNTP PCR3 圖8 8PCR介導的定點誘變法 二 利用基因定點誘變技術(shù)改造基因工程蛋白 目的 使工業(yè)酶具有更好的理化特性便于應用 使臨床生物蛋白或多肽制劑療效高副作用小 獲得更多對人類有益的蛋白或多肽產(chǎn)物 Forexample Insulin GeneengineeringInsulin 1 定點誘變制備長效Insulin 半衰期延至35 3h 2 定點誘變制備快速吸收Insulin 減少六聚體形成 3 定點誘變增加Insulin與受體的親和力 B27Thr Arg C端氨基化 A21Asn Gly B10His Asp 體外活性較野生型提高5倍 第六節(jié)克隆基因在適當宿主細胞的表達 Expressionsystems Expressionvectors Appropriatehostcells Aim Togetalotofproteinsorpolypeptides Theexpressionsystemsincommonuse Ecoliexpressionsystem Mammalanimalexpressionsystem Insectexpressionsystem Yeastexpressionsystem 一 大腸桿菌 Ecoli 表達系統(tǒng) Characters 目標基因表達水平高 遺傳背景清楚 易于培養(yǎng) 培養(yǎng)方法簡單 生長快 培養(yǎng)周期短 抗污染能力強 成本低 一 表達外源基因需要一些基本要素 1 來自真核細胞的基因需要適當改選 2 必須選用Ecolivectors 3 目的基因與載體可用不同方式連接 4 選擇適當?shù)氖荏w菌和誘導條件 表達非融合蛋白 表達融合蛋白 Ifthetargetgenecomefromeukaryote itshouldbecDNA Why 1 來自真核細胞的基因需要適當改選 Thesignalpeptideofsecretaryproteinhastobedeletedtoo The5 endsequencebeforeATGoncDNAisuseless soithastobedeleted ThevectorsmustbeEcoliexpressionvectors whichcontainthepromoters PL tac T7 recognizedbyDDRPinEcoliandSDsequence Why 2 必須選用Ecolivectors Promoters Effectivelyinducetranscription轉(zhuǎn)錄效應強 Canbecontrolledeasily能被有效控制 5 3 SD Targetgene a Toexpressthenon fusionproteinsUseNdeI CATATG orNcoI CCATGG tobringinATG SD Targetgene Fragmentofstructuregeneofprokaryote 3 目的基因與載體可用不同方式連接 Themodelsoflinkage b Toexpressthefusionproteins Fusionprotein N Thepeptideoftargetgene peptideofprokaryote C ItmeansthatthepeptideexpressedconsistsofN endofpeptidecodedbyprokaryoteDNAandC endofpeptidecodedbythecloningfragmentofeukaryoteDNA whichistermedasfusionprotein Theadvantagesoffusionprotein a Morestable b Withthesignalpeptide thesecretaryproductcouldbeyielded c Itcanbepurifiedbyaffinitychromatography d Thepeptideofprokaryotecanbecutoutbyproteinase andthenthepeptideofeukaryotecanbereleasedinnaturalform 二 采用適當措施可提高外源基因表達水平 1 多種策略提高翻譯水平 2 將細菌生長與外源基因表達在時間上分開 3 采用不同措施提高表達蛋白的穩(wěn)定性 表達融合蛋白 采用突變菌株 表達分泌蛋白 調(diào)整SD與ATG之間距離 增加mRNA穩(wěn)定性 點突變改變堿基 二 哺乳動物表達系統(tǒng) Characters EukaryoteexpressionsystemsareneededThegenetobeexpressedcancomefromgenomeDNAorcDNAWhy Howcanthevectorsbetransformedintohostcells Plasmidvectors Calciumphosphateco precipitation Electroporation DEAE Dextran Microinjection MaketheextraneousDNAintocellsmediatedbyliposome Virusvectors Thevirusvectorshavetobeintroducedintowrapcells thenthepseudo virusparticleswouldbeproducedandusedtoinfectthehostcells Thescreeningmarkers Antibioticsgenes neor codetheaminosaccharidephosphatetransportase makeG418lostactivity Advantages Theexpressionproductshavescarcelyeffectonhostcells andnoteasilybedegraded 1 Insectexpressionsystem1 Drosophilamelanogaster Fruitfly expressionsystem DES 果蠅表達系統(tǒng) 2 Bacilliformvirusexpressionsystem 桿狀病毒表達系統(tǒng) 三 其他真核表達系統(tǒng) 2 Microzyme yeast expressionsystem 啤酒酵母 Saccharomycescerevisiae Goto101 第七節(jié)電子克隆輔助基因克隆 Insilicocloning 通過對基因數(shù)據(jù)庫進行序列搜索 對比分析 拼接整合 預測新的 假定的全長基因 然后通過分子生物學實驗方法 加以證實 并從相應組織 細胞中獲得這種基因 稱為電子克隆Insilicocloning Note Insilicoisnottherealgenecloning Summary Thebasicelementsforgenecloning Thebasicprocessforgenecloning Thegenesite directedmutagenesis Thegeneexpre