微生物實驗預(yù)習(xí)報告.doc

實驗三 細(xì)菌革蘭氏染色法及芽孢染色法一、實驗?zāi)康?. 初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色的步驟；2. 掌握細(xì)菌芽孢染色的方法。 二、實驗內(nèi)容1. 制作細(xì)菌染色裝片。 2. 進(jìn)行革蘭氏染色法操作。 三、實驗材料和用具大腸桿菌(Ecoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液，枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)的斜面菌種。革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、香柏油、二甲苯和5孔雀綠水溶液。 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈和燒杯。 四、操作步驟(一) 革蘭氏染色 1涂菌 用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而勻、直徑約1cm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。2. 干燥 于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。3固定 目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法即將細(xì)菌涂片向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止茵體燒焦、變形。此制片可用于染色。4. 初染 于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。5. 媒染 滴加盧戈氏碘液，1min后水洗。6. 脫色 滴加95乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚薄需時30s至1min水洗。7. 復(fù)染 滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1min，水洗。8用濾紙吸干,油鏡鏡檢。 (二)芽孢染色法 1方法1 (1) 取37培養(yǎng)18-24h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定(參見“細(xì)胞單染色法”) 。(2) 于載片上滴人35滴5孔雀綠水溶液。(3) 用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時開始計算時間約4-5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。(4) 傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。(5) 用0.5沙黃水溶液(或o05堿性復(fù)紅)復(fù)染1min，水洗。(6) 制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。 2方法2 (1) 加1-2滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取23環(huán)培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分期勻打散，制成濃稠的菌液。 (2) 加5孔雀綠水溶液23滴于小試管中用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。 (3) 將此試管浸干沸水浴(燒杯)中，加熱1520min。 (4) 用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片通過微火3次固定。 (5) 水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為比。 (6) 加沙黃水溶液，染23min后，傾去染液，不用水洗。(7) 干燥后用油鏡觀察。芽孢綠色，菌體紅色。(三) 結(jié)果 革蘭氏陽性菌染成藍(lán)紫色, 革蘭氏陽性菌染成淡紅色。 (四) 檢測未知菌 用以上方法對未知菌進(jìn)行革蘭氏染色呵芽孢染色，并繪圖、記錄染色結(jié)果。 五、注意事項 1涂片務(wù)求均勻切忌過厚。2在染色過程中，不可使染液干涸。 3脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌。 4老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。 5供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽泡仍保留在菌體上為宜。六、演示1. 無菌操作取菌、涂片及涂片的固定；2. 制片方法及染色過程。 七、實驗報告(一) 繪圖 大腸桿菌革蘭氏染色視野圖； 金黃色葡萄球菌革蘭氏染色視野圖；枯草芽孢桿菌及巨大芽孢桿菌的菌體及芽孢形態(tài)，芽孢的著生位置。(二) 記錄革蘭氏染色法步驟，并進(jìn)行結(jié)果分析。 (三) 未知菌的檢測結(jié)果。 七、問題和思考 1涂片后為什么要進(jìn)行固定，固定時應(yīng)注意什么? 2. 什么是革蘭氏染色法?染色過程應(yīng)注意什么? 3. 試分析革蘭氏染色法在細(xì)菌分類中的意義。 4. 為什么芽孢染色要加熱?為什么芽孢及營養(yǎng)體能染成不同的顏色?實驗四 油鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)的觀察一、 實驗?zāi)康膹?fù)習(xí)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸的使用方法。二、實驗內(nèi)容： 1學(xué)習(xí)油浸系物鏡的使用方法。 2用油鏡觀察枯草芽抱桿菌和金黃色葡萄球菌染色裝片。 三、實驗材料和用具枯草芽孢桿菌(Bacillus .subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色裝片。 香柏油、二甲苯、 顯微鏡、擦鏡紙 。 四、操作步驟(一) 觀察前的準(zhǔn)備 1將顯微鏡置于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約為4cm。坐正，練習(xí)用左眼觀察。2調(diào)節(jié)光源：將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，把光圈完全打開，聚光器升至與載物臺相距約1mm左右。轉(zhuǎn)動反光鏡采集光源，光線較強的天然光源宜用平面鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對光至視野內(nèi)均勻明亮為止。觀察染色裝片時，光線宜強；觀察未染色裝片時，光線不宜太強。 3. 低倍鏡觀察染色裝片 首先下降載物臺，將枯草芽孢桿菌染色裝片置于載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至距裝片0.5cm處，適當(dāng)縮小光圈,然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升(或使鏡臺下降)至發(fā)現(xiàn)物像時，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。移動裝片，把合適的觀察部分移至視野中心. 4. 高倍鏡觀察 眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與破片相撞。再用目鏡觀察，仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部分移至視野中心，繪圖。不要移動裝片位置，準(zhǔn)備用油鏡觀察。5. 油鏡觀察 (1). 下降載物臺約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位(鏡頭的正下方)滴香柏油。 (2). 從側(cè)面注視，小心慢慢上升鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。 (3). 將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將載物臺徐徐下降(切忌反方向旋轉(zhuǎn))，直至視野中有物像為止。（二）細(xì)菌形態(tài)的觀察1. 觀察細(xì)菌的基本形態(tài) 用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察革蘭氏染色的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，芽胞染色的蘇去金桿菌，并分別在油鏡下繪圖。五、注意事項 1注意擦鏡頭時，只能用擦鏡紙。2觀察完畢，必須將鏡筒上升，才能取下裝片放入另一裝片后，要按使用油鏡要求，重新操作不能在油鏡下直接取下和替換裝片，切記。3無菌操作過程中，接種環(huán)滅菌后不能觸及其他物品，挑菌不能過多。六、演示 1細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)裝片示范鏡；2無菌操作過程；3怎樣蓋蓋玻片才不產(chǎn)生氣泡。七、實驗報告（一)繪圖 給出你所觀察到的幾種細(xì)菌的個體形態(tài)視野圖。 繪出你所觀察到的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)視野圖，并注明各部分。 （二)試指出在制備活菌裝片時，應(yīng)注意什么問題? 八、問題和思考1. 用明視野顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)時，你認(rèn)為用染色裝片好還是用非染色裝片好？觀察活體裝片與染色裝片，光線調(diào)節(jié)各有什么不同? 2. 無菌操作過程中，可否將棉寒放在桌面上?為什么? 3. 試設(shè)一個準(zhǔn)備該實驗的工作方案。 實驗五 放線菌、酵母菌和霉菌形態(tài)觀察一、實驗?zāi)康?觀察細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的代表種類的菌落形態(tài)特征。2放線菌、酵母菌和霉菌的細(xì)胞形態(tài)觀察。二、實驗原理菌落形態(tài)是指某種微生物在一定的培養(yǎng)基上由單個菌體形成的群體形態(tài)。細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌，每一類微生物在一定培養(yǎng)條件下形成的菌落各具有某些相對的特征，利用觀察這些特征，來區(qū)分各大類微生物及初步識別、鑒定微生物，方法簡便快速，在科研和生產(chǎn)實踐中常被采用。三、實驗材料和用具圓褐固氮菌，枯草芽孢桿菌，灰色鏈霉菌，釀酒酵母，青霉的單個菌落平板，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；Bouin氏固定液，0.01結(jié)晶紫溶液，酒精等。顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)。四、操作步驟（一）四大菌落的形態(tài)觀察觀察圓褐固氮菌、枯草芽孢桿菌、灰色鏈霉菌、釀酒酵母、青霉的單個菌落特征，并按實驗菌落特征描述的方法記錄結(jié)果。（二）放線菌的形態(tài)觀察用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的放線菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。然后將長有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡觀察。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細(xì)和色澤差異。（三）霉菌的形態(tài)觀察1粘片觀察：取一滴棉藍(lán)染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。2假根觀察：將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標(biāo)本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種構(gòu)造。（四）酵母菌的形態(tài)觀察酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測定1以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。2. 取0.05%美藍(lán)染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色23min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母菌個體形態(tài)，區(qū)分其母細(xì)胞與芽體，區(qū)分死細(xì)胞(藍(lán)色)與活細(xì)胞(不著色)。3. 在一個視野里計數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞，共計數(shù)56個視野。酵母菌死亡率一般用百分?jǐn)?shù)來表示，以下式來計算：死亡率=死細(xì)胞總數(shù)死活細(xì)胞總數(shù)100%五、注意事項1用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新鮮、表面濕潤；在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加大移種量，可提高子囊形成率；通過微加熱增加酵母的死亡率，易于觀察死亡細(xì)胞。2培養(yǎng)放線菌中要注意，放線菌的生長速度較慢，培養(yǎng)期較長，在操作中應(yīng)特別注意無菌操作，嚴(yán)防雜菌污染。3玻璃紙法培養(yǎng)接種時注意玻璃紙與平板瓊脂培養(yǎng)基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長，六、實驗報告1. 將觀察到的微生物菌落特征填入下表中。2. 計算酵母菌的死亡率3根霉和青霉形態(tài)圖，示各部。七、問題和思考1. 試比較細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的菌落形態(tài)的差異？ 2酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別?3在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?實驗六 微生物顯微計數(shù)和大小測量一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容 目的：學(xué)會測微尺的使用和計算方法及對球菌和桿菌的測量 內(nèi)容： 1認(rèn)識測微尺，學(xué)習(xí)目鏡測微尺的標(biāo)定。 2測定金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌體的大小。3計數(shù)板直接鏡檢計數(shù)。 4載玻片直接鏡檢計數(shù)。 5平板菌落計數(shù)。二、實驗材料和用具 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)斜面培養(yǎng)物(約培養(yǎng) 10h)、培養(yǎng) 57d 的大腸桿菌(E.coli)菌液。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、美藍(lán)染色液、；結(jié)晶紫染色液、香柏油、二甲苯。 顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)板、目鏡測微尺、酒精燈、鏡臺測微尺、擦鏡紙、酒精燈、濾紙條、載玻片、蓋玻片、無菌微量移液管、接種環(huán)、無菌試管、涂布器、無菌培養(yǎng)皿。 三、操作步驟 (一)計數(shù)板直接鏡檢計數(shù) 1血細(xì)胞計數(shù)板的構(gòu)造 血細(xì)胞計數(shù)板由四條平行槽構(gòu)成 3個平臺，中間的平臺較窄，其中間又被一短槽隔成兩半，每邊平臺面各有一個含 9 個大格的方格網(wǎng)，中間大格為計數(shù)室。計數(shù)室的長和寬各為l mm，中間平臺下陷 0.01 mm，故蓋上蓋玻片后計數(shù)室的總?cè)莘e為 0.1 mm3。血細(xì)胞計數(shù)板的構(gòu)造見圖 16. 常見血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)室有兩種規(guī)格。一種是 16x 25 型，稱為麥?zhǔn)涎?xì)胞計數(shù)板共有 16個小格，每個小格分為 25 個小格。另一種是 25x16 型，稱為希里格式血細(xì)胞計數(shù)板，共有 25 個中格，每個中格又分成 16 個小格。但是不管哪種規(guī)格的血細(xì)胞計板其計數(shù)室的小格均由 400 個小方格組成。應(yīng)用血細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計算微生物細(xì)胞的數(shù)量，方法是先測定若干個方格中的微生物細(xì)胞，再換算成每 m1 菌液(或每 g 樣品)中微生物細(xì)胞數(shù)量。 2細(xì)菌數(shù)量的測定 (1) 稀釋加樣：取枯草芽孢桿菌斜面少量菌體至 100mL無菌水中，稀釋混勻后待用(濃度約為 104 - 105mL)。先將蓋玻片放在計數(shù)室上，用吸管吸取以上稀釋液滴于蓋玻片的邊緣，讓菌液自行滲人，多余菌液用濾紙吸去，稍待片刻，待細(xì)菌細(xì)胞全部沉降到計數(shù)室底部，將計數(shù)板放于載物臺的中央，按下列步驟尋找計數(shù)室并計數(shù)。(2) 找計數(shù)室：先在低倍鏡下尋找計數(shù)板大方格網(wǎng)的位置，轉(zhuǎn)換高倍鏡后調(diào)節(jié)光亮度至菌體和計數(shù)室線條清晰為止，再將計數(shù)室一角的小格移至視野中。順著大方格線移動計數(shù)板，使計數(shù)室位于視野中間。 (3) 計數(shù)：計數(shù)時，如用 16x 25 則計數(shù)板則按對角線方位，取左上、右上、左下、右下 4 個大格(共4 個大格，100 個小格)內(nèi)的細(xì)胞逐一進(jìn)行計數(shù)；如使用規(guī)格為 2516 型的計數(shù)板，則除取左上、右上、左下、右下 4 個大格外，還需加中央的一個大格(共 5 個大格，80 個小格)內(nèi)的細(xì)胞。計數(shù)時當(dāng)遇到大格線上的細(xì)菌時，一般只計此大格的上方及右方線上的細(xì)胞(或只計下方及左方線上的細(xì)胞)，將計得的細(xì)胞數(shù)填人結(jié)果表中對每個樣品重復(fù)計數(shù) 3 次，取具平均值，按下列公式計算每 mL 菌液中所含的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)。(二)載玻片直接鏡檢計數(shù) 1搖動菌液使其混合均勻，用無菌微量移液管取菌液 0.01mL于載玻片上并用無菌接種環(huán)均勻地涂布 1cm2的面積上。風(fēng)干，固定，結(jié)晶紫染色lmin，沖洗干燥備用。 2用物鏡測微尺，測量顯微鏡油鏡觀察時的視野直徑，并以S=r2公式，計算出視野面積。 3將涂片置于載物臺，滴香柏油，以油鏡觀察，不斷變化視野共觀察 N 個視野，計數(shù)每一視野中細(xì)菌個數(shù)。以下列公式計算每毫升菌液中的含菌數(shù)量： (三)平板菌落計數(shù) 另取滅菌移液管吸取上述枯草芽孢桿菌稀釋液 1mL，放人已滅菌的培養(yǎng)皿中，再倒人融化而冷卻到 50左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,同時制作 3 個平板皿中鋪成薄層，并使平皿作前后和左右滑動，使樣品和培養(yǎng)基混勻待其凝固后倒置，37培養(yǎng) 24 h 后汁算菌落數(shù)，并計算其每 mL的含菌量。（四）細(xì)菌大小測定l測微尺的構(gòu)造 顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺接物測微尺組成，目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在 5mm 刻尺上分 50 份(圖 151B)。目鏡測微尺每格實際代表的長度隨使用接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，因此在使用前必須用鏡臺測微尺進(jìn)行標(biāo)定。鏡臺測微尺為專用中央有精確等分線的載玻片(圖 151A)，一般將長為 1mm的直線等分 100個小格，每格長 0.01mm, 即 10um，是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。2目鏡測微尺的標(biāo)定 把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放入目鏡的隔板上使有刻度的一面朝下。將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行并使兩尺左邊的一條線重合，向右另外一條兩尺相重合的直線(圖 151B)、 3計算方法 ： 例如，目鏡測微尺 20 個小格等于鏡臺測微尺 3 個小格，已知鏡臺測微尺每格為 10um，則 3 小格的長度為 31030um，那么相應(yīng)地在目鏡測微尺上每小格長度為 3X10201.5(um)。用以上計算方法分別校正低倍鏡,高倍鏡及油鏡下目鏡測微尺每格實際長度。4菌體大小的測定 將鏡臺測微尺取下，分別換上大腸桿菌及金黃色葡萄球菌玻片標(biāo)本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數(shù)，再以目鏡測微尺每格的長度計算出菌體的長和寬。并詳細(xì)記錄于表中。 例如目鏡測微尺在這架顯微鏡下，每格相當(dāng)于 1.5 um，測量的結(jié)果，若菌體的平均長度相當(dāng)于目鏡測微尺的 2 格則菌體長應(yīng)為 21.5 um3.0um。 一般測量菌體的大小應(yīng)測定 10 - 20 個菌體求出平均值才能代表該菌的大小。 四、注意事項 1鏡臺測微尺的玻片很薄，在標(biāo)定油鏡頭時，要格外注意，以免壓碎鏡臺測微尺或損壞鏡頭。 2標(biāo)定目鏡測微尺時要注意淮確對正目鏡測微尺與鏡臺測微尺的重合線。3直接鏡檢計數(shù)完畢，用蒸餾水沖洗計數(shù)板。絕不能用硬物洗刷。洗后待自行晾干或用濾紙沾干。最后用擦鏡紙擦干凈。若計數(shù)是病原微生物，則需先浸泡在 5的石炭酸溶液中進(jìn)行消毒，然后再進(jìn)行清洗。五、演示 1目鏡測微尺、鏡臺測微尺的顯微鏡下示教 2.標(biāo)定及測量方法示范4平板菌落計數(shù)操作過程。六、實驗報告 1. 目鏡測微尺標(biāo)定結(jié)果： 低倍鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 高倍鏡下 倍目鏡測微尺每格長度為 油鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 2菌體大小測定結(jié)果：試與已知的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的大小作一比較是否一致，為何? 3. 計數(shù)板直接鏡檢計數(shù)結(jié)果：4. 涂片直接鏡檢計數(shù)結(jié)果：5. 平板菌落計數(shù)結(jié)果七、問題和思考 1 根據(jù)你的體會，血細(xì)胞計數(shù)板計算的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何減少誤差? 2比較各種計數(shù)法的優(yōu)點和缺點。 3設(shè)計一個方案如何計數(shù)市售酸奶或三株口服液或菌肥制品的單位含菌數(shù)。4. 為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時必須重新用鏡臺測微尺對目鏡測微尺進(jìn)行標(biāo)定? 5. 若目鏡不變，目鏡測微尺也不變，只改變物鏡，那么目鏡測微尺每格所測量的鏡臺上的菌體細(xì)胞的實際長度(或?qū)挾?是否相同?為什么? 實驗七 E.coli生長曲線的測定一、實驗?zāi)康?1 了解細(xì)菌生長曲線特點及測定原理；2 學(xué)習(xí)用比濁法測定細(xì)菌的生長曲線。二、基本原理 三、器材 1菌種：大腸桿菌 2培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基3儀器和器具： 四、方法與步驟 1標(biāo)記編號 取11支無菌試管，分別用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)時間，分別編號為0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h。2接種用5.0 mL無菌吸管分別準(zhǔn)確吸取2.5 mL種子液加入盛有50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的三角瓶中，混合均勻后分別取5.0 mL混合液放入上述標(biāo)記的11支無菌試管中。3 培養(yǎng)于37下振蕩培養(yǎng)250 r/min，分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h，將標(biāo)記有相應(yīng)時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，待培養(yǎng)結(jié)束時一同測定OD值。 4生長量測定 將未接種的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基傾倒入比色杯中，選用600nm波長進(jìn)行比濁測定。并對不同時間培養(yǎng)液從0h起依次進(jìn)行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定，使其OD值在0.10.0.65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD值。 五、實驗結(jié)果 1 將測定的OD值填入下表： 2 以上述表格中的時間為橫坐標(biāo)，OD600 值為縱坐標(biāo)，繪制大腸桿菌的生長曲線。3思考：（1）用本實驗方法測定微生物生長曲線，有何優(yōu)點？ (2) 細(xì)菌生長繁殖所經(jīng)歷的四個時期中，哪個時期其代時最短？若細(xì)胞密度為103/ml，培養(yǎng)4.5h后，其密度高達(dá)2108/ml，計計算出其代時。實驗八 細(xì)菌的生理生化反應(yīng)一、 實驗?zāi)康?. 證明不同微生物對各種有機大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同的微生物有著不同的酶系統(tǒng)；2. 掌握進(jìn)行微生物大分子物質(zhì)水解實驗的原理和方法 3. 掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法；4. 了解IMViC反應(yīng)的原理及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。二、 實驗原理 （請補充）三、 實驗器材 （請補充）四、 實驗步驟淀粉水解試驗：1. 用記號筆在淀粉培養(yǎng)基平板底部劃分4部分。2. 將Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes，staphylococcus aureus分別在不同的部分劃線接種，在平板的反面分別寫上菌名。3. 將平板倒置37生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（A-509），24 h后觀察各種細(xì)菌生長情況：打開蓋子，滴入少量盧戈氏碘液，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪面整個平板。糖發(fā)酵試驗：1. 用記號筆在試管外壁上分別表明表明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種的細(xì)菌菌名。2. 取3支含糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管，其中2支分別接種Escherichia coli，Enterobacter aerogenes，另外1支保留不接種的培養(yǎng)基為對照。3. 37恒溫培養(yǎng)24 - 48 h后觀察，如指示劑變黃，表示產(chǎn)酸，為陽性，不變或變藍(lán)為陰性；倒立德漢氏小管中如有氣泡，表示代謝產(chǎn)氣。4. 實驗結(jié)果記錄：產(chǎn)酸產(chǎn)氣用“”表示，只產(chǎn)酸的用“+”表示，不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的用“”表示。吲哚試驗1. 將Escherichia coli，Enterobacter aerogenes，分別接種于2支蛋白胨水培養(yǎng)基中，37恒溫培養(yǎng)24 h。2. 在培養(yǎng)基中加入乙醚1.0 mL ,充分振蕩使吲哚溶于乙醚中，靜置2 min，待乙醚層浮于培養(yǎng)液上面后，再沿試管壁慢慢加入吲哚試劑10滴。乙醚層呈玫瑰紅色的為陽性。注意：加入試劑后，不許搖動，否則無紅色或紅色不明顯。甲基紅（M. R.）試驗和伏-普（V. P.）試驗1. 將Escherichia coli，Enterobacter aerogenes，分別接種于2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37恒溫培養(yǎng)24 h。2. M. R.試驗：各取出1支培養(yǎng)好的試管，取沿管壁加入M. R. 試劑3 4滴，觀察，培養(yǎng)基由原來的橘黃色變?yōu)榧t色的為陽性反應(yīng)。3. V. P.試驗：各取1支培養(yǎng)好的試管，加入10滴40%的KOH，然后加入等量的5%的-萘酚溶液，用力振蕩，37恒溫15 - 30 min，培養(yǎng)物呈紅色的為陽性反應(yīng)。五、 實驗結(jié)果（表格見黑板）六、 結(jié)果分析（對實驗進(jìn)行總結(jié)與分析）實驗九 環(huán)境因素對微生物生長的影響一、實驗?zāi)康?、 學(xué)會自己設(shè)計實驗測試一些環(huán)境因素對微生物生長的影響的方法與步驟。2、 掌握物理因素、化學(xué)因素、生物因素對微生物生長的影響的原理。3、 掌握培養(yǎng)基的配置及滅菌方法。4、 了解并會使用微生物實驗室的基本儀器及常用滅菌方法。二、實驗原理微生物的生命活動是由其細(xì)胞內(nèi)外一系列物化環(huán)境系統(tǒng)統(tǒng)一體所構(gòu)成的，除營養(yǎng)條件外，影響微生物生長的環(huán)境因素，包括物理因素、化學(xué)因素和生物因素對微生物的生長繁殖、生理生化過程均能產(chǎn)生很大影響，總之一切不良的環(huán)境條件均能使微生物的生長受抑制，甚至導(dǎo)致菌體死亡。1、 物理因素pHPH通過影響細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性或電離性來影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的生長速率。2、化學(xué)因素消毒劑（碘酒） 通過誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的方式殺死細(xì)胞。2、 生物因素抗生素（青霉素）能抑制微生物生長或殺死微生物的化合物，它們主要通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，破壞細(xì)胞質(zhì)膜，作用于呼吸鏈以干擾氧化磷酸化，抑制蛋白質(zhì)和核酸合成等方式來抑制微生物的生長或殺死微生物。三、實驗材料菌種：3號金黃色葡萄球菌、5號大腸桿菌儀器：高壓滅菌鍋、電子天平、電熱爐、恒溫培養(yǎng)箱、紫外分光光度計、移液槍、打孔器器皿：玻璃棒、大燒杯、錐形瓶、試管和培養(yǎng)皿（使用時滅菌）、接種環(huán)、涂布棒槍頭試劑：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏，蛋白胨，NaCl,瓊脂粉，水，PH7.27.4） 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液（同上，不加瓊脂粉） 無菌水 1mol/L HCL 1mol/L NaOH四、實驗步驟1. pH對微生物的影響（1） 配置不同PH值得培養(yǎng)基，0.3克 牛肉膏、1克蛋白胨、0.5克氯化鈉、100毫升的水。從最低PH 值開始調(diào)：3.5、5.5、7.5、9.5、11.5五個PH濃度各5毫升分裝十支試管，即每個梯度做兩管。進(jìn)行標(biāo)記后滅菌。（2） 制備菌液，取37