分離分析新技術(shù)

分離分析新技術(shù)在天然藥物研究中的應(yīng)用,馬建蘋,Tel:(O) E-mail:,超臨界流體萃取技術(shù),一.基本原理,1. 超臨界流體的特性,(1)被提取物的性質(zhì)(2)壓力的影響(3)溫度的影響(4)夾帶劑的影響,2. 超臨界CO2流體的溶解性能,3.超臨界CO2流體萃取的優(yōu)勢(shì),(1)防止熱敏性物質(zhì)可能產(chǎn)生的氧化和分解,保持各組分的原有特性。(2)無(wú)溶劑殘留問(wèn)題。(3)實(shí)現(xiàn)選擇性提取。(4)提取較完全。(5)儀器聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)高效、快速、準(zhǔn)確分析。(6)CO2超臨界流體適合于工業(yè)化生產(chǎn)。,萃取釜減壓閥分離釜加壓泵,4.超臨界CO2流體萃取設(shè)備簡(jiǎn)介,蜂膠的SFE純化流程,(1)萃取壓力(2)萃取溫度(3)CO2流量(4)萃取時(shí)間(5)粒度(6)夾帶劑,二.超臨界CO2流體萃取工藝的影響因素,1.超臨界CO2流體萃取穿心蓮有效成分功效：清熱解毒、消腫止痛。有效成分：二萜內(nèi)酯類化合物(穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯)傳統(tǒng)方法： 水提法：ChP1990淘汰 醇提法：熱浸：得率較高、有效成分容易分解或聚合、雜質(zhì)較多 冷浸：質(zhì)量較好、雜質(zhì)少、有效成分不分解、生產(chǎn)周期較長(zhǎng)超臨界CO2流體萃取法：所得有效成分含量較高、具有該藥的天然香味,三.超臨界流體萃取在天然藥物提取中的應(yīng)用,穿心蓮不同提取方法所得浸膏的質(zhì)量比較,2.揮發(fā)油的提取傳統(tǒng)提取方法的缺點(diǎn)：易造成揮發(fā)油的分解或氧化等； 收率普遍較低實(shí)例：月見(jiàn)草油 SFE提取, 25 MPa, 50 萃取率 20% -亞麻酸 10.6% 色澤與透明度 -亞麻酸 杏仁油： SFE與石油醚提取工藝比較 收油率是后者的2.5倍 薄荷揮發(fā)油： 23 MPa, 55 加7% 乙醇夾帶劑 薄荷醇收率 0.16% 比水蒸汽蒸餾法 高 3倍 比有機(jī)溶劑法 高0.6倍,優(yōu)于溶劑法,四.超臨界流體萃取技術(shù)展望,(1)成本上難以與傳統(tǒng)提取工藝競(jìng)爭(zhēng)(2)對(duì)許多強(qiáng)極性和分子量較大的成分很難進(jìn)行有效地提取(3)基礎(chǔ)研究比較薄弱(4)需要結(jié)合傳統(tǒng)中藥所要求的藥效來(lái)考察有效成分是否被萃取出及性能是否穩(wěn)定(5)考慮中藥成分的協(xié)同和互溶作用,大孔樹(shù)脂吸附分離技術(shù),一.大孔吸附樹(shù)脂的結(jié)構(gòu)、原理和特點(diǎn),1. 大孔吸附樹(shù)脂的結(jié)構(gòu)、原理及種類(1)結(jié)構(gòu) 新型非離子型高分子聚合物吸附劑 白色球形顆粒 20-60目 具多孔性 聚合單體 苯乙烯 交聯(lián)劑 二乙烯苯 致孔劑 甲苯、二甲苯(2)分離原理 吸附性和篩選性相結(jié)合 (3)大孔樹(shù)脂的種類 按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為以下四類： 非極性 如苯乙烯、二乙烯苯聚合物 中極性 存在極性基團(tuán)COOR,具有一定的極性 極性 含硫氧、酰胺、腈等基團(tuán) 如丙烯酰胺 極性大于酯基 強(qiáng)極性 如吡啶基、氨基等,一些代表性的大孔吸附樹(shù)脂,2. 大孔吸附樹(shù)脂的特點(diǎn)(1)分離性能優(yōu)良 選擇性良好 分離效能高 脫色能力強(qiáng)(2)理化性質(zhì)穩(wěn)定 穩(wěn)定性高 機(jī)械強(qiáng)度好 經(jīng)久耐用 避免環(huán)境污染和對(duì)設(shè)備的腐蝕(3)應(yīng)用范圍廣 與離子交換樹(shù)脂相比 pH不變 發(fā)酵液分離抗生素(4)使用方便 流體阻力小(5)溶劑用量少 避免乳化現(xiàn)象 提高提取效率(6)可重復(fù)使用 再生容易(7)其他方面 價(jià)格較貴 吸附效率易受流速和溶質(zhì)濃度的影響 品種有限 操作較復(fù)雜 對(duì)樹(shù)脂的技術(shù)要求較高,二.大孔吸附樹(shù)脂吸附分離技術(shù)要求,大致操作步驟：樹(shù)脂預(yù)處理樹(shù)脂上柱藥液上柱樹(shù)脂的解吸 樹(shù)脂的清洗、再生樹(shù)脂預(yù)處理：加甲醇或丙酮浸泡24小時(shí)，加熱回流洗脫裝柱：蒸餾水濕法裝柱，乙醇流動(dòng)清洗，大量蒸餾水清洗,藥液的上柱吸附：（1）泄漏曲線與吸附容量的考察（2）藥液上柱前的預(yù)處理（3）上柱工藝條件的選擇 樹(shù)脂自身特性、樣品濃度、pH值、吸附柱徑高比、上樣流速（4）樹(shù)脂的解吸 樹(shù)脂的清洗、再生： 無(wú)水乙醇或95乙醇洗至無(wú)色，大量水洗去醇,三.大孔吸附樹(shù)脂技術(shù) 在天然藥物提取純化中的應(yīng)用,在天然藥物有效成分的提取、純化領(lǐng)域大有用途：1.許多提取成功的單味中草藥，奠定良好的基礎(chǔ)2.不斷有新型的吸附樹(shù)脂問(wèn)世到目前為止,已成功用于黃酮類、皂苷類、生物堿類、酯類、萜類等成分的分離,1.黃酮類藥物的提取,實(shí)例：銀杏葉提取物 （GBE） 主要有效成分 黃酮苷 萜內(nèi)酯 溶劑萃取法 24 6 樹(shù)脂吸附法 Amberlite XAD-7 30 未達(dá)標(biāo) Duolite-761 達(dá)標(biāo) 達(dá)標(biāo) ADS-F8 6065 2530,其他中草藥：毛冬青根、山楂、葛根、黃芩根、苦蕎麥、沙棘等,2.皂苷類藥物的提取,實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷 研制出強(qiáng)極性吸附樹(shù)脂ADS-7、S-038 S-038，吸附量達(dá)65.5 mg/ml，70乙醇洗脫,人參皂苷 吸附和脫色雙重作用 ADS-7 ，70乙醇洗脫，粗品（棕色） 白色或微黃色,實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷 絞股藍(lán)：葫蘆科植物絞股藍(lán)的根狀莖或全草，多年生草質(zhì)藤本植物 功效：鎮(zhèn)咳、清熱解毒有效成分：皂苷、黃酮類、多糖類 “綠色的金子” “第二人參” “人參寶草”提取工藝：絞股藍(lán)干莖葉 熱水浸提 浸提除雜 樹(shù)脂吸附乙醇解吸 脫色 濃縮干燥 粉碎 絞股藍(lán)皂苷粉末,7-8倍熱水浸提三次,調(diào)節(jié)酸堿性靜置除雜,DA大孔樹(shù)脂水洗除雜,50%乙醇70%乙醇,DB樹(shù)脂,真空干燥,80-100目,3.生物堿的提取,實(shí)例：喜樹(shù)堿 弱堿 AB-8 pH 8，鹽濃度(1-2.5)mol/L, 吸附量達(dá)160 mg/g,小檗堿 堿性大 水溶性大 10%H2SO4, 10%NaOH, 非極性吸附樹(shù)脂 小檗堿含量為原生藥含量的97%,4.影響大孔樹(shù)脂分離純化天然藥物效果的因素,(1)樹(shù)脂性質(zhì) 吸附容量大 吸附速度快 機(jī)械強(qiáng)度好(2)藥液pH 酸性物質(zhì)易在酸性溶液中被吸附 堿性物質(zhì)在堿性溶液中被吸附(3)藥液濃度 符合Frendich 和 Augmur經(jīng)典吸附式 (4)上柱液溫度 室溫(5)鹽濃度 無(wú)機(jī)鹽的加入降低了吸附質(zhì)在介質(zhì)內(nèi)的溶解度(6)樹(shù)脂柱徑高比 合適的徑高比為分離提供較高的柱效(7)樹(shù)脂柱的清洗 非吸附性成分 水 吸附性雜質(zhì) 一定濃度的酸或堿液(0.1-1.0 M NaOH 或 HCl) (8)洗脫液的選擇及解吸,制備色譜技術(shù),色譜技術(shù)：有效成分的定性與定量工作開(kāi)發(fā)出療效好、質(zhì)量指標(biāo)明確的中藥新藥,一.色譜技術(shù)的基本原理,按照分離過(guò)程的原理不同分為：吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜親和色譜,二.制備色譜工藝流程單色譜柱：最簡(jiǎn)單、最為常用，能分離復(fù)雜組分的混合物 溶劑消耗量大，回收溶劑的能耗高模擬移動(dòng)床色譜：分離效率高、溶劑消耗低、便于連續(xù)操作 設(shè)備復(fù)雜、工藝要求高柱切換、移動(dòng)進(jìn)料和移動(dòng)接口色譜等： 實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組分分離、大大提高吸附劑生產(chǎn)率、 減少溶劑消耗、減少設(shè)備投資和操作費(fèi)用,三.常用的制備色譜工藝,1.薄層色譜 操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、應(yīng)用廣泛新型薄層色譜法 離心制備薄層色譜 （PCLC）旋轉(zhuǎn)離心、連續(xù)洗脫的圓形色譜技術(shù)，分離效果優(yōu)于常規(guī)的制備薄層色譜和柱色譜獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)固定相不會(huì)造成損壞 裝填容量、分離速度和分離效能得到極大提高,實(shí)例：龍膽屬植物 Sstrictiffora 甲醇提取物 bellidifolin 和 desmethylbellidifolin 離心薄層色譜法 聚酰胺開(kāi)口柱色譜 30 min. 12hr.,2.柱色譜特殊的柱色譜：（1）干柱色譜干法裝填上樣洗脫推出、切割譜帶溶劑萃取特點(diǎn)：溶劑消耗很少，操作迅速（1530min）（2）真空液相色譜 (VLC)抽真空裝柱低極性溶劑沖柱上樣洗脫收集餾分、抽干特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、處理量大（一次可達(dá)30g）,3.壓力液相色譜 (PLC)閃蒸色譜 (約0.2 MPa) 價(jià)格低廉、操作方便低壓液相色譜 ( 2.0 MPa) 分離效率高、應(yīng)用范圍廣實(shí)例：銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、白果內(nèi)酯的分離純化硅膠H柱 (10-40 m) 流動(dòng)相：乙酸乙酯石油醚（8：2）(5) 超臨界流體色譜 介于液相色譜和氣相色譜之間的色譜方法特點(diǎn)：分離速度快、產(chǎn)品易回收、應(yīng)用范圍廣、有可能替代正相HPLC,4.離子交換色譜固定相：離子交換樹(shù)脂 可再生性和重復(fù)使用性交換功能基團(tuán)：陽(yáng)離子和陰離子形態(tài)：凝膠型（水溶脹）和大孔型（永久性微孔）特點(diǎn)：使用方便、成本低廉、重復(fù)使用性好、分離速度快應(yīng)用范圍：生物堿、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)以及核酸實(shí)例：總生物堿制備生藥粗粉0.1%HCl滲漉強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂蒸餾水洗樹(shù)脂倒出晾干10%NaOH堿化樹(shù)脂氯仿回流干燥重結(jié)晶,5.逆流色譜 (CCC)以液相物質(zhì)為固定相的液液色譜離心逆流色譜 (CCCC)：（1）分離物質(zhì)的極性范圍很寬（2）沒(méi)有拖尾現(xiàn)象（3）樣品定量回收實(shí)例：銀杏葉中的黃酮糖苷 固定相：水，流動(dòng)相：乙酸乙酯乙酸乙酯（異丁醇）乙酸乙酯/異丁醇 (6:4)高速逆流色譜 (HSCCC),6.其他形式色譜體積排阻色譜 分子篩機(jī)理凝膠過(guò)濾色譜凝膠滲透色譜優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、快捷、流動(dòng)相選擇寬泛(2)親和色譜 大多被利用來(lái)分離純化生物大分子載體：瓊脂糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠(3)疏水作用色譜 主要分離對(duì)象為蛋白質(zhì)特點(diǎn)：分離條件溫和，易于保持生物蛋白質(zhì)的活性,7.多種色譜方法的聯(lián)用最初分離步驟：如閃蒸色譜、逆流色譜或凝膠過(guò)濾色譜等最后的純化過(guò)程：如HPLC實(shí)例：生物堿 液相色譜法排阻色譜法,實(shí)例：水飛薊黃酮的提取 水飛薊：也叫乳薊，菊科植物，一年或兩年生草本 功效：抗肝臟中毒和保護(hù)肝細(xì)胞有效成分：水飛薊素提取工藝：水飛薊種子 去油種子餅 去油種子渣 過(guò)濾 提取液 濃縮 總黃酮油液 總黃酮 溶解 上柱 洗脫 濃縮干燥 水飛薊素,機(jī)械榨油,粉碎,提取4次每次4h,分離植物油,丙酮,硅膠柱,四. 制備色譜技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵：色譜過(guò)程放大和操作最優(yōu)化柱色譜：分辯率高、結(jié)合容量大、成本低、放大快速簡(jiǎn)便 現(xiàn)有色譜分離工藝70連續(xù)性色譜技術(shù)：移動(dòng)床色譜、環(huán)形色譜、錯(cuò)流梯度色譜 模擬流動(dòng)床SMB： 特點(diǎn)：設(shè)備結(jié)構(gòu)小、放大快速簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高和生產(chǎn)能力大,指紋圖譜技術(shù),一.概述1.中藥指紋圖譜： 運(yùn)用光譜、色譜、X-射線衍射或各種技術(shù)的聯(lián)用等現(xiàn)代分析技術(shù)，對(duì)中藥化學(xué)信息通過(guò)色譜圖（液相色譜圖、氣相色譜圖或薄層色譜圖等）方式進(jìn)行表征，并通過(guò)計(jì)算、分析、比較、評(píng)價(jià)等過(guò)程，以技術(shù)參數(shù)、指紋特征等加以說(shuō)明。 制備分析比較評(píng)價(jià)校驗(yàn),分析圖譜：準(zhǔn)確的辨認(rèn) 精密的測(cè)量比較圖譜：相似 相同評(píng)價(jià)結(jié)果：模糊屬性 求索細(xì)枝末節(jié) 分析比較的結(jié)果：對(duì)差異性或一致性作出評(píng)價(jià),2.中藥指紋圖譜的分類：狹義：中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜廣義： 中藥材（原料藥材）指紋圖譜應(yīng)用對(duì)象 中藥原料藥（包括飲片、配伍顆粒）指紋圖譜 中藥制劑指紋圖譜 中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜 最主要、常用 中藥HPLC指紋測(cè)定手段 中藥生物指紋圖譜,3. 中藥指紋圖譜研究的目的及意義：目的：（1）對(duì)中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充和提高（2）控制中間體、成品的一致性，減少批間差異意義： 中藥現(xiàn)代化 表征中藥有效物質(zhì)的整體性和復(fù)雜性 推動(dòng)中藥新藥研究開(kāi)發(fā)和傳統(tǒng)產(chǎn)品的二次開(kāi)發(fā),4.中藥指紋圖譜建立的原則：系統(tǒng)化學(xué)成分研究和相同的藥理學(xué)研究為依托系統(tǒng)性：應(yīng)包括中藥有效部位所含大部分成分的種類，或指標(biāo)成分的全部 如：中藥人參 皂苷類成分 銀杏葉 黃酮類和銀杏內(nèi)酯類特征性：化學(xué)成分信息具有高度選擇性，區(qū)分中藥的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，成為“化學(xué)條碼” 如：五味子 已知木脂素 未知木脂素 成分之間的順序、比值重現(xiàn)性：在規(guī)定的方法和條件下，不同操作者和不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能做出指紋圖譜,二.中藥指紋圖譜的建立,1.指紋圖譜測(cè)定方法的選定色譜法：TLC、HPLC、GC、CE光譜法：UV、IR、NIR其他方法：X射線衍射法、NMR及聯(lián)用技術(shù)等HPLC法最常用，具有如下特點(diǎn)： 分離效能高 選擇性高 檢測(cè)靈敏度高 分析速度快 應(yīng)用范圍廣,HPLC指紋圖譜測(cè)定方法的選定,研究對(duì)象的確定及預(yù)處理 文獻(xiàn)調(diào)研，確定分析檢測(cè)目標(biāo) 例如：黃芪含黃酮、皂苷及多糖三類有效成分 黃芪多糖注射液 多糖 原藥材 黃酮、皂苷及多糖 復(fù)方：君臣佐使 供試品的制備 例如：黃芪 黃酮 堿水萃取 皂苷 大孔樹(shù)脂吸附 除雜，避免干擾或?qū)ιV柱的損耗色譜條件選擇 最重要、關(guān)鍵性 流動(dòng)相：對(duì)樣品有一定溶解度、適用于使用的監(jiān)測(cè)器、化學(xué)惰性好、低黏度、低沸點(diǎn) 純度高、安全、毒性低、環(huán)境友好 改性劑、助溶劑（異丙醇、四氫呋喃、氯仿） 、梯度洗脫 檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、色譜柱、進(jìn)樣量、檢測(cè)器,黃酮類、酚酸類 乙腈水酸系統(tǒng)皂苷類 乙腈水系統(tǒng)生物堿類 乙腈三乙胺系統(tǒng),2.色譜條件的優(yōu)化及規(guī)范化 (1) 樣品中所有組分能被檢出或檢出組分?jǐn)?shù)目盡可能多 (2) 各組分達(dá)到滿意的分離度 (3) 分析時(shí)間短優(yōu)化：流動(dòng)相組成、濃度、值、添加劑規(guī)范化：色譜柱、試劑、儀器操作參數(shù)固定，可重現(xiàn)3.指紋圖譜的信息化和知識(shí)化指紋圖譜信息化指紋圖譜知識(shí)化4.指紋圖譜的建立與辨認(rèn),三.中藥指紋圖譜的應(yīng)用,1.丹參藥材指紋圖譜研究 有效成分： 水溶性 丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、丹參素丙、丹參酸乙、丹酚酸A、丹酚酸 B、迷迭香酸、丹參酸 A、3,4-二羥基桂皮酸、-谷甾醇-葡萄糖苷、異阿魏酸、原紫草素、紫草酸 脂溶性成分 丹參酮類 （丹參酮A）(1) 供試品的制備 水提取酸化乙酸乙酯萃取檢測(cè) 方法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好(2) 參照物的制備 主成分：原兒茶醛作參照物檢測(cè)方法 流動(dòng)相的選擇 甲醇-0.1%冰乙酸（5:95） 檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm 穩(wěn)定性及精密度試驗(yàn) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 3.0% 重現(xiàn)性試驗(yàn) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 3.0%,(4) 丹參原藥材HPLC指紋圖譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn) 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)： 填充劑 ODS 流動(dòng)相 甲醇-0.1% (5:95) 檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm 柱溫 室溫 流速 1.0 mL/min