【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）TGF-β3對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響脂肪干細(xì)胞的研究進(jìn)展

蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 1 文獻(xiàn)回顧 脂肪干細(xì)胞的研究進(jìn)展 1. 引言 脂肪干細(xì)胞 (存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞 (具有多向分化的潛能。該細(xì)胞 由 于 2001年首次從人抽脂術(shù)中抽取的脂肪組織懸液中分離獲得 1。目前，發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞廣泛分布于不同物種，如人、鼠、豬、犬及兔等不同部位的脂肪組織中。由于提取方法簡單、創(chuàng)傷小、獲得的細(xì)胞數(shù)量大，脂肪干細(xì)胞已成為組織工 程中種子細(xì)胞研究的熱點 2。 2. 脂肪干細(xì)胞的分離 分離脂肪干細(xì)胞的脂肪組織主要來源于抽脂術(shù)后廢棄和切取的脂肪組織。從脂肪組織中分離細(xì)胞的方法最早由 0世紀(jì) 60年代報道，隨后又不斷的被改進(jìn) 3。顯然，良好的分離技術(shù)可獲得更多數(shù)量的脂肪干細(xì)胞，保證脂肪干細(xì)胞的活性功能和維持其多向分化潛能。脂肪組織供體的差異可能也影響分離的脂肪干細(xì)胞活性。一般認(rèn)為，脂肪干細(xì)胞的附著和增殖能力隨供體年齡增加而降低。但 肪干細(xì)胞的衰老與供體的體質(zhì)指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而與年齡無關(guān)。由于不同部位脂肪組織的生 物代謝特點不同，來源于不同部位的脂肪干細(xì)胞數(shù)量和分化潛能可能不同 4。 腹部、大腿和乳房來源的脂肪組織相比，人前臂脂肪組織中含有更多的脂肪干細(xì)胞 5。有研究還發(fā)現(xiàn)，不同脂肪組織中的脂肪干細(xì)胞含量不同。脂肪干細(xì)胞在鼠白色脂肪組織中的含量明顯高于棕色脂肪組織 6。 3. 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng) 脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，同樣需要保持細(xì)胞增殖活性和多向分化潛能。很明顯，培養(yǎng)條件是影響脂肪干細(xì)胞的重要因素。 報道，低糖可能更有利于維持脂肪干細(xì)胞的多分化潛能，而培養(yǎng)液中的抗生素對脂肪干細(xì) 胞的細(xì)胞表型和分化能力無影響。由于脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)常處于低氧環(huán)境中， 研蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 2 究了氧濃度對脂肪干 細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)氧濃度和血清濃度過高、過低均不利于維持脂肪干細(xì)胞的生物特性 7。最近，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硒處理后的脂肪干細(xì)胞增殖活性和多向分化能力均明顯增強(qiáng)，其機(jī)制可能是通過抑制 調(diào)節(jié)2 和 號通路發(fā)揮作用 8。脂肪干細(xì)胞的需求量大，常需凍存。研究表明，長時間凍存對脂肪干細(xì)胞的表型、增殖和分化沒有影響 。有學(xué)者比較不同凍存液對脂肪干細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 存 液保存的脂肪干細(xì)胞活性最高，但各凍存液對脂肪干細(xì)胞的分化能力沒有影響 9。 4. 脂肪干細(xì)胞的鑒定 人的脂肪干細(xì)胞和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞 (面抗原 90 以上都是一致的。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞存在存 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞情況正相反 10。有研究表明，不同來源和分離培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞表面抗原基本是一致的，其中， 為多向分化標(biāo)志，表明脂肪干細(xì)胞具有多向分化潛能。已 經(jīng)證實 一種干細(xì)胞因子受體，在全能或多能干細(xì)胞中表達(dá)，包括胚胎干細(xì)胞 (而且脂肪干細(xì)胞還表達(dá)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記物，如 4， 可能是脂肪干細(xì)胞跨胚層分化的分子基礎(chǔ) 11。最近有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞的標(biāo)記物會隨著培養(yǎng)時間的延長而有所改變。早期原代培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞中存在造血干細(xì)胞以及內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)志分子，培養(yǎng) 3-5 d 后顯著下降，這可能與原代培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞含有多種細(xì)胞成分有關(guān)。但也提示脂肪干細(xì)胞可能存在不同的 “干細(xì)胞 亞群 ”12。眾所周知，干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞的特異細(xì)胞標(biāo)記物，因此，通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化為多種成熟功能細(xì)胞的方法可鑒定獲得脂肪干細(xì)胞 13。 5. 脂肪干細(xì)胞的多向分化潛能 軟骨細(xì)胞分化 多次傳代后的脂肪干細(xì)胞仍能保持向軟骨分化的能力。 研究表明，脂肪干細(xì)胞向軟骨分化后，長時間培養(yǎng)，其軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)，不同部位來源的脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞能力不同，關(guān)節(jié)周圍組織來源的誘導(dǎo)成軟蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 3 骨的能力更強(qiáng) 14。一 般認(rèn)為，低濃度胎牛血清有利于脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。但最近國內(nèi)有學(xué)者報道，含 10 軟骨誘導(dǎo)液更利于脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向增殖和分化。研究還發(fā)現(xiàn)，高密度種植更利于脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，這可能因為密集種植脂肪干細(xì)胞，減少了細(xì)胞間的間隔，使細(xì)胞間相互作用增加而促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化 15。目前，常用的生長因子有轉(zhuǎn)化生長因子 、胰島素樣生長因子 I、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、表皮生長因子等。對于哪種生長因子最好，目前還不了解。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，單純應(yīng)用生長因子可使脂肪干細(xì)胞表達(dá)膠原 X、軟骨細(xì)胞發(fā)生退變，而且 ，單一生長因子在體外可能不能誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞表達(dá) 型膠原。由于體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，生長因子眾多，因此聯(lián)合應(yīng)用生長因子效果可能更好。大劑量的生長因子能提高誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞中 型膠原和蛋白多糖的含量，改善組織工程軟骨的生物品質(zhì) 16。 脂肪細(xì)胞分化 已證實誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞可表達(dá)脂蛋白、脂肪酶、過氧化物酶體增殖物激活受體 等多個脂肪細(xì)胞基因，而且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴形成。多次傳代后，脂肪干細(xì)胞仍有向脂肪細(xì)胞分化的能力。目前，對脂肪干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的機(jī)制仍不清楚。有報道認(rèn)為，抑制脂肪干細(xì)胞中的 號通路 可提高脂肪干細(xì)胞的成脂能力 17。值得注意的是，多個獨立研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞的成脂與成骨密切相關(guān)。 發(fā)現(xiàn)，大約有 65 個基因參與調(diào)控脂肪干細(xì)胞成脂與成骨的平衡。深入研究這些基因，可能有助于理解調(diào)節(jié)脂肪干細(xì)胞的成脂成骨分化的機(jī)制。與誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞一樣，不同的培養(yǎng)條件對脂肪干細(xì)胞的影響不同。有研究稱無糖的 高糖的 能促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成脂分化 18。 成骨細(xì)胞分化 脂肪干細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞分化的能力，并且不受供體年齡的限制。供體性別可能對 脂肪干細(xì)胞的成骨分化有影響。雄性新西蘭大白兔的脂肪干細(xì)胞的成骨能力高于雌性大白兔。目前，多個研究小組對脂肪干細(xì)胞的成骨機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn) 號通路對調(diào)節(jié)脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化起重要作用 19。 認(rèn)為，抑制 號通路可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，同時也降低了脂肪干細(xì)胞的增殖 ， 但也有相反報道。也有學(xué)者報道，降低 表達(dá)，可抑制脂肪干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的成骨分化，同時不影響脂肪干細(xì)胞的成脂分化?？梢?，可能有多個信號途徑參與調(diào)節(jié)脂肪干細(xì)胞的成骨分化。研究還發(fā)現(xiàn)，蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 4 適度的機(jī)械刺激能 促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，這可能有助于組織工程構(gòu)建大塊骨組織 20。 其他細(xì)胞分化 現(xiàn)發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞還可跨胚層分化成中胚層以外的細(xì)胞，如肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰腺細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。目前，對脂肪干細(xì)胞的這種跨胚層分化機(jī)制仍不了解。盡管對脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)能否分化成具有功能的中胚層以外的細(xì)胞還有爭議，但這已經(jīng)預(yù)示了脂肪干細(xì)胞具有廣泛的應(yīng)用前景。作為組織工程的種子細(xì)胞：現(xiàn)認(rèn)為應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)或組織工程的理想干細(xì)胞必須符合以下條件：含量豐富；分離方法無傷害性；多分化潛能具有可調(diào)控性和可再生性；自體 或異體移植具有高效性和安全性；具有符合目前醫(yī)療實踐指南的操作標(biāo)準(zhǔn)。已知脂肪干細(xì)胞含量豐富，分離方法簡單，吸脂術(shù)安全，對患者傷害小，脂肪組織易再生，可反復(fù)獲取 21。應(yīng)用于直接細(xì)胞治療：脂肪干細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素 管內(nèi)皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、腫瘤壞死因子等。因此，脂肪干細(xì)胞還有可能通過旁分泌細(xì)胞因子促進(jìn)組織修復(fù)。經(jīng)靜脈注射的脂肪干細(xì)胞可自主聚集于病灶部位參與修復(fù)損傷。脂肪干細(xì)胞的這種 “歸巢 ”作用，其具體機(jī)制不明。有報道稱通過增加膜型基質(zhì)金屬蛋白酶 1 表達(dá)和促進(jìn) 原的激活可增 強(qiáng)脂肪干細(xì)胞的遷移。近期研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞能釋放新的線粒體至損害的細(xì)胞，從而挽救有氧代謝的過程。這說明脂肪干細(xì)胞可通過多種機(jī)制參與組織的修復(fù) 22?；蛑委煹妮d體：由于體外條件下外源基因容易導(dǎo)入脂肪干細(xì)胞，并且在體內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)，因此，脂肪干細(xì)胞還可作為基因治療的目的基因載體。最近， 利用脂肪干細(xì)胞作為藥物細(xì)胞載體，通過其 “歸巢 ”作用成功抑制了小鼠黑色素瘤的生長 23。 6. 存在問題與展望 雖然對脂肪干細(xì)胞的研究越來越深入，但仍然有許多問題尚未解決。由于體外不能充分誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的分化，且分 化后的細(xì)胞功能與正常成熟細(xì)胞存在差異。如何高效、廉價、安全的誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化和應(yīng)用是目前急需解決的難題。現(xiàn)多數(shù)脂肪干細(xì)胞的研究為體外試驗，對于體內(nèi)微環(huán)境特別是病理狀態(tài)下的微環(huán)境與脂肪干細(xì)胞的相互作用，以及脂肪干細(xì)胞如何被調(diào)控定向分化，幾乎一無所知，而這恰是理解體內(nèi)脂肪干細(xì)胞作用機(jī)制的關(guān)鍵所在。脂肪干細(xì)胞是一種來源廣泛、含量豐富、分離簡單的成體間充質(zhì)干細(xì)胞。隨著作用機(jī)制的深入研究，脂蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 5 肪干細(xì)胞有望成為臨床上良好的種子細(xì)胞。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 6 參考文獻(xiàn) 1 A,et 001,7(2):2112 ,et of of SC)an in 007,359(2):313 of of (of on 966,241(1): 4 ,J,et of 004,6(1):75 ,G,on of 008,60(5):5386 ,et to in 006,312(6):727 7 T,E,E,et of in 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干細(xì)胞一樣具有自我更新和多向分化的能力，在適宜誘導(dǎo)條件下經(jīng)誘導(dǎo)可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等 5,6。因此誘導(dǎo) 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞分化，合成與纖維軟骨相似的細(xì)胞外基質(zhì) (有可能是纖維軟骨組織工程中解決細(xì)胞來 源問題的重要途徑。轉(zhuǎn)化生長因子 (廣泛用于脂肪 干細(xì)胞的 纖維軟骨分化 7。國內(nèi)外許多研究表明使用轉(zhuǎn)化生長因子 導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化 8,9。但使用 轉(zhuǎn)化生長因子 導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向纖維軟骨細(xì)胞分化 的研究 卻很少見。 族的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)及功能：轉(zhuǎn)化生長因子 一族多肽類生長因子，胚胎形成期可誘導(dǎo)原始的間充質(zhì)干細(xì)胞 (化形成軟骨組織 2。所有 族成員都具有一些共同的結(jié)構(gòu)特征 3，是由多種細(xì)胞和組織產(chǎn)生的一類同源二聚體多肽分子，分子量約 25條多肽鏈含 110氨基酸殘基。所有 關(guān)因子顯示與 序列相似性，是 家族的一員，通過 體及其細(xì)胞內(nèi)信號系統(tǒng) 將信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)而起到多種不同的生理調(diào)節(jié)作用 4。 本研究采用聚集體培養(yǎng)通過使數(shù)量較多的 鼠 合在一起，選用轉(zhuǎn)化生長因子 用于 察 分化和生物合成情況 ，充分發(fā)揮 自分泌及旁分泌作用，有可能促進(jìn)纖維軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)分泌以及表型的表達(dá)； 通過觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，組織學(xué)和免疫熒光染色等 檢測生 括 I/膠原和蛋白多糖 )的情況，初步評價 為工蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 9 程化纖維軟骨種子細(xì)胞的可行性。 1. 材料與方法 材料與儀器 鼠 購自 司 ； 胞培養(yǎng)液購自 司 ； 胎牛血清購自杭州四季青公司 ； 兔抗鼠 I 型膠原抗體， 膠原抗體購自 司 ； 記的羊抗兔抗體 購自 司； 阿利新藍(lán)染色購自 司 ； 熒光顯微鏡 號 1 鼠 培養(yǎng) 胞解凍后種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入 10%胎牛血清的 養(yǎng)液，置于 37 5% 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 48 小時首次換液，以后每隔 2 天換液一次，逐漸除去非貼壁細(xì)胞，約 5后細(xì)胞達(dá)到融合，當(dāng)細(xì)胞融合至 80加入 酶消化液，按 1:3 的比例傳代。 導(dǎo) 纖維軟骨細(xì)胞分化的細(xì)胞形貌觀察 選擇第三代細(xì)胞以 度接種于離心管中進(jìn)行三維培養(yǎng)。隨機(jī)分為兩組：第一組加入含 0g/成纖維軟骨誘導(dǎo)液 (含 10%胎牛血清 (杭州四季青公司 )和高糖 養(yǎng)基 (誘導(dǎo)分 化培養(yǎng) 14 天；第二組加入不含 基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照組。通過顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞生長 狀態(tài)。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 10 阿利新藍(lán)染色 細(xì)胞培養(yǎng) 14 天后，采用 4多聚甲醛 固定細(xì)胞后石蠟包埋組織制作顯微切片，阿利新藍(lán)染色液 (50浸染 30 分鐘。蒸餾水終止染色。 95%乙醇分化 10秒，顯微鏡下觀察染色 結(jié)果 。 免疫組織化學(xué)染色 消化細(xì)胞種植在離心管中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞數(shù)量為 2 天換培養(yǎng)液， 4多聚甲醛固定后石蠟包埋組織制作顯微切片，加入 300l 穿透液(穿透 30 分鐘。吸去穿透液，加入正常山羊血清封閉液 140l，封閉 50 分鐘后，吸去封閉血清，分別加入 100l ， 1： 200， 在保濕盒中 4 孵育過夜。 膠原兔抗鼠抗體 (I， 1:200， 在保濕盒中 37孵育 1 小時。吸出抗體溶液后加入 記的羊抗兔抗體 H+L)， 115 1:100 稀釋，分別加入 100l， 37光孵育 1 小時，然后取出 入 140l 液 (室溫避光孵育 30 分鐘。吸去染液，加入 滌；最后添加 用熒光倒置顯微鏡觀察各抗體表達(dá)情況。 2 結(jié)果 導(dǎo)分化前后的細(xì)胞形態(tài)變化 倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示 胞在 導(dǎo)下呈現(xiàn) 明顯 不同的形貌特征。圖 1（ a）顯示 在未加入 長因子下，細(xì)胞呈聚集生長，細(xì)胞外基質(zhì)分泌較少；經(jīng) 長因子誘導(dǎo)之后，細(xì)胞有明顯的聚集生長現(xiàn)象，形態(tài)呈多角形、多邊形，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多（圖 1（ b）。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 11 圖 1 倒置顯微鏡下觀察 用前后形態(tài)變化情況（ 200）。 （ a）未加入 b）加入 a) b) 00). 利新藍(lán)染色 阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示 未有 導(dǎo)下，未見明顯的藍(lán)色，空泡多見（圖 2a）。而經(jīng) 導(dǎo)后 胞染色呈藍(lán)色，并且可見明顯的異染性著色，空泡少見（圖 2b）。這表明 長因子誘導(dǎo)下能合成大量的 糖胺 聚糖。 圖 2 糖胺聚糖阿利新藍(lán)染色（ 400）。 （ a）無 照組；（ b） 。 00). (a) (b) 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 12 型膠原和 型膠原免疫組織化學(xué)染色 圖 3 顯示了合成膠原基質(zhì)的免疫組織化學(xué)染色。 I 型膠原免疫化學(xué)細(xì)胞染色結(jié)果顯示，在沒有 誘導(dǎo)下，沒有明顯的 I 型膠原合成，表達(dá)不明顯，胞漿呈淺黃色，而胞核染色為藍(lán)色（圖 3A）；在 誘導(dǎo)下 , I 型膠原免疫化學(xué)細(xì)胞染色顯示染色結(jié)果明顯，呈強(qiáng)陽性，胞漿呈明顯的棕褐色，胞核染色呈藍(lán)色，且在 I 型膠原表達(dá)越密集的區(qū)域染色越強(qiáng)（ 圖 3C）。 對于 膠原的染色結(jié)果顯示，在對照組中， 膠原免疫化學(xué)染色陰性，細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)均少見，偶見胞漿呈淺黃色（圖 3B）；而在誘導(dǎo)組的細(xì)胞染色顯示 , 膠原合成較多，細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒，胞核藍(lán)染（圖 3D）。 圖 3 I 和 膠原免疫組織化學(xué)染色（ 400）。 I 型膠原對照組未見明顯表達(dá)（ A）； I 型膠原 呈陽性表達(dá)（ C）； 膠原對照組未見明顯表達(dá)（ B）；而 膠原 呈明顯的陽性表達(dá)（ D）。 (400). A); C)； I B); I D)； 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 13 3. 討論 關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)仍是臨床面臨的挑戰(zhàn)之一。傳統(tǒng)的治療方法如軟骨移植及關(guān)節(jié)置換術(shù)并不 能完全恢復(fù)軟骨的結(jié)構(gòu)，組織工程學(xué)的興起為關(guān)節(jié)軟骨損傷治療提供了新的選擇 10。組織工程軟骨的構(gòu)建中，關(guān)鍵的任務(wù)是尋找合適的種子細(xì)胞。多能干細(xì)胞因為具有多向分化能力 11，近 20 年來成為研究的熱點。 12于 2001 年在人體皮下脂肪組織中提取到了具有多向分化能力的細(xì)胞，并稱之為脂肪來源的成體干細(xì)胞 ( 實驗表明吸脂手術(shù)吸取的每 100 脂肪組織中， 數(shù)量相當(dāng)于等量骨髓中 40 倍，且成纖維細(xì)胞集落形成單位 (驗中表明， 干細(xì)胞數(shù)目至少是骨髓的 500 多倍 13,14，而且 其他的干細(xì)胞分化時間要短，是目前生長最快的干細(xì)胞 15，因此有望成為優(yōu)秀的纖維軟骨組織工程的種子細(xì)胞。 但是，體外培養(yǎng)條件下 纖維軟骨細(xì)胞的分化受多種因素的影響，如細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞密度、細(xì)胞因子、空間組織以及機(jī)械力等 16,17。目前對干細(xì)胞的定向分化和擴(kuò)增尚缺乏有力的調(diào)控手段，干細(xì)胞作為移植物定向增殖分化為器官 18，用于組織損傷修復(fù)的技術(shù)瓶頸成為阻礙其進(jìn)入臨床的難題 19。 轉(zhuǎn)化生長因子 系列生長因子是一族具有多種功能的多肽，它能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì) 20。 一種具有雙向調(diào)節(jié)作用的生長因子。關(guān)節(jié)軟骨合成 無活性的形式貯存在基質(zhì)，能被局部下降的 和蛋白酶激活， 用于間充質(zhì)來源的細(xì)胞，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增生、分化和蛋白質(zhì)合成 21。 組織學(xué)實驗結(jié)果表明，經(jīng) 用后， 胞開始向成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞分化。阿利新藍(lán)染色，實驗組為陽性，表明誘導(dǎo)后細(xì)胞有合成 能力。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示 I、 膠原呈強(qiáng)陽性，表明誘導(dǎo)后的細(xì)胞產(chǎn)生膠原的能力明顯增強(qiáng)。 本研究在體外聚集體培養(yǎng)條件下證實了 以在 作用下，細(xì)胞向成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞分化，能夠合成 I 型膠原及 型膠原，細(xì)胞形成許多有功能的聚集體，這些聚集體中可能具有接近的細(xì)胞 形成蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 14 類似于體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，因而表現(xiàn)出比早先單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞更好的生理功能。說明經(jīng)過適當(dāng)微環(huán)境誘導(dǎo)， 以向纖維軟骨細(xì)胞方向分化，有望成為纖維軟骨組織工程的種子細(xì)胞。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 15 參考文獻(xiàn) 1 2010. 2006. 2 郝偉 ,胡蘊(yùn)玉 ,魏義勇 ,等 中國矯形外科雜志 ,2006;21:16573 , , , et of an in 2007;2:314 H, J, Y, Y, C, M, H, C. in , 2012;18:21145 S, I. of on of , 2010;16:35696 T, , A, M, J, . of 2008;372:2307 A, A. of on 2005;11:11418 N, J, A. of on MJ 2011;7:17108. 9 J, A. of as a 2011;32:20528. 10 A, P. m,1994;27:26311 , K. 010;85:64712 A, , , et 001;7(2):21113 K, , , et an of 006;24:15014 K, , , et 008;449:5915 , 010;42:12416 ,et of on in 006;290: 17 I,A,F,et of 004;113:58518 of in 2008;22:262蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 16 19 M,. of of J 009;218:920 r J, D, et of on of 000;61:100321 , ,et of on in 004;10:1414蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 向纖維軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響 17 第二部分 誘導(dǎo)時間對 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響 關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)一直是骨科醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。近年來，利用軟骨組織工程原理修復(fù)軟骨缺損已經(jīng)成為該領(lǐng)域研究的熱 點。它是結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)、材料科學(xué)和外科學(xué)，旨在重建新的 功能組織，為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，以期能夠獲得最終的長期的功能恢復(fù)，目前成為解決軟骨修復(fù)難題中較有前景的一種途徑 1但種子細(xì)胞和生物活性因子是該組織工程的難題 3目前應(yīng)用的以軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的自體軟骨細(xì)胞移植等方法存在諸多缺點，如種子細(xì)胞來源有限，軟骨細(xì)胞體外擴(kuò) 增培養(yǎng)時易發(fā)生去分化、無法維持其生物學(xué)特性，軟骨供區(qū)損傷等。因此，該方法的應(yīng)用受到了很大限制 5 因此，具有強(qiáng)大增殖和多向分化能力的干細(xì)胞，尤其是脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞 (成為軟骨組織工程研究的熱點 7脂肪間質(zhì)干細(xì)胞是來源于脂肪組織的干細(xì)胞，與其它成體干細(xì)胞一樣具有自我更新和多向分化的能力，在適宜誘導(dǎo)條件下可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。脂肪間質(zhì)干細(xì)胞在組織工程和細(xì)胞治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景，吸