【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）多菌靈酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究免疫分析技術(shù)及其應(yīng)用碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 多菌靈酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究 : 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 摘要 i 摘 要 鑒于我國有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥的大量應(yīng)用，蔬果中農(nóng)藥殘留超標(biāo)不容忽視。為了滿足我國農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)場和快速檢測的需要，選取應(yīng)用廣泛、具有廣譜殺蟲效果和具有 代表性 的氨基甲酸酯類農(nóng)藥多菌靈作為研究對象，根據(jù)酶聯(lián)免疫分析的原理，試圖 建立快速、低成本、適宜于現(xiàn)場檢測的多菌靈殘留的酶聯(lián)免疫快速檢測技術(shù)， 為 進(jìn)一步 研制 劑盒 及其工藝流程定型 提供基礎(chǔ)， 也將為蔬果 中農(nóng)藥殘留的快速、現(xiàn)場檢測和監(jiān)控提供技術(shù)支撐。 多菌靈，通用名 子式： 學(xué)名稱 ，與苯菌靈等具有相似的特異結(jié)構(gòu) 苯并咪唑，與 托布津、甲基托布津的代謝物結(jié)構(gòu)相同。 本研究設(shè)計了兩條多菌靈半抗原的合成路線。其一，活化 苯 并 咪唑環(huán)上的 亞氨基 ， 使之帶上可以利用的羥基 ，合成半抗原 1氧羰乙基丙酸 2苯并咪唑氨基甲酸甲酯 ，多菌靈中的 苯并咪唑環(huán)和氨 基甲酸甲酯部分均 被 保留 ；其二 ， 多菌靈原藥在堿性條件下水解，生成 2氨基苯并咪唑氨基甲酸甲酯，再經(jīng) 琥珀酰化，得到半抗原 2琥珀酰苯并咪唑。合成的兩種半抗原經(jīng)核磁共振和紅外鑒定，證明合成成功。分別采用混合酸酐法、活性酯法使兩種半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備了免疫原 包被原 聯(lián)比均在 3 35： 1 之間，符合小分子免疫的要求。 經(jīng)過免疫得到了抗血清，但是第一種免疫原的抗血清效價較低，不滿足 法的要求。而第二種免疫原 制備 的 多克隆抗體，效價在 64000 以上，同時除了與苯菌靈具有很高的交叉率 、與噻苯達(dá)唑交叉率達(dá)到 8外，與托布津、甲基托布津等其它農(nóng)藥的交叉率均小于 2，符合 析技術(shù)建立對 抗 血清效價 的要求，并用辛酸一硫酸銨鹽析法對抗血清進(jìn)行純化。 本研究從包被條件與方法選擇、抗體 （抗血清） 工作濃度優(yōu)化和基質(zhì)條件優(yōu)化（鹽濃度、 方面初步得到間接 析的最佳工作條件，并在優(yōu)化條件下建立多菌靈檢測的間接 ，抑制率與多菌靈的濃度對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，符合回歸方程Y=x)+回歸 系數(shù) ，測定范圍 ， 最低 檢測 10%的甲醇提取中的添加回收率平均為 109，變異 系數(shù) 16 ， 初步鑒定 滿足多菌靈的實(shí)際檢測需求。 采用多菌靈間接 對 結(jié)構(gòu)類似 物進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)。當(dāng)多菌靈對抗體抗原反應(yīng)的抑制率為 50%時，所需多菌靈的濃度為 g，苯菌靈的濃度為 4.0 ng/g，噻苯達(dá)唑濃度為 30 ng/g，交叉反應(yīng)率為 8%，甲基托布津、托布津濃度均大于 200 ng/g，交叉反應(yīng)率為小于 2%， 2氨基苯并咪唑濃度大于 500 ng/g，交叉反應(yīng)率小于 此法可以 用于苯菌靈及其代謝物多菌靈的檢測 ，但是如何區(qū)分苯菌靈和多菌靈殘留尚需進(jìn)一步研究 。 以建立的 測方法對來自土壤和水中的添加樣品進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，并與常規(guī)的 接 測定土壤中多菌靈的添加回收率土壤中回收率為 109，變異 系數(shù) ，河水中的回收率為 變異 系數(shù) ，純水中變異 系數(shù) 16 ，平均回收率 109。 綜合分析， 所 建立的多菌靈間接 ，可適用于 現(xiàn)場快速檢測 ， 成本 和簡便性等方面較傳統(tǒng)的儀器分析 具 有明顯的優(yōu)勢。 關(guān)鍵詞： 多菌靈，苯菌靈，農(nóng)藥殘留，酶 聯(lián) 免疫分析 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 t is of in in to of In to of in to a a to a to an of in ， as of of of as (1) To on to of 1(2) To to 2NM R of of of , of of 4000 by It to 00%), to as It to of of of of A in N of Y=x)+ is x of , , of 09% 6. of to of .0 ng/g 30 ng/g %， 00 ng/g %，00 ng/g is to 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 At g/ BC in 09 in % of to 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 目錄 I 目 錄 摘 要 . i . 錄 . I 第一章 引 言 . 1 藥殘留免疫速測研究的意義 . 1 藥免疫檢測技術(shù)基本原理 . 2 疫與抗原抗體反應(yīng) . 2 分子免疫 . 2 藥免疫檢測原理 . 3 藥免疫檢測技術(shù)研究的方法 . 3 抗原的分子設(shè)計 . 3 抗原與載體蛋白的偶聯(lián) . 3 藥人工抗原偶聯(lián)比例的測定 . 4 藥免疫分析的發(fā)展趨勢 . 4 疫傳感器 . 5 組分分析物免疫分析 (. 5 動注射免疫分析 (. 5 疫 術(shù) （ . 5 疫親和層析 . 6 研究的立題依據(jù)及意義 . 6 第二章 多菌靈人工抗原的合成與鑒定 . 7 料與方法 . 7 學(xué)試劑及主要儀器 . 7 菌靈結(jié)構(gòu)類似物的合成與鑒定 . 8 菌靈人工抗原（免疫原和包被原）的制備及鑒定 . 10 果與分析 . 13 抗原核磁的鑒定結(jié)果 . 13 工抗原的紫外圖譜 . 15 菌靈抗原的生物鑒定 . 17 論 . 19 于多菌靈半抗原結(jié)構(gòu)類似物的設(shè)計 . 19 于多菌靈抗原的合成與鑒定 . 19 第三章 定量測定多菌靈的間接競爭 法的建立 . 20 料與方法 . 21 劑及主要儀器 . 21 體制備純化及其特性考察 . 23 菌靈競爭 佳工作條件的確定 . 24 測方程的建立及添加回收試驗(yàn) . 26 果與分析 . 26 體的特性 . 26 菌靈競爭 佳工作條件的確定 . 27 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 目錄 檢測方程的建立及添加回收試驗(yàn) . 31 論 . 33 于抗體的特性 . 33 于抗體最佳工作濃度的確定 . 34 于影響 測方法的系列因素 . 34 于標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)用性 . 34 第四章 主要結(jié)論 . 35 要結(jié)論 . 35 工抗原 的設(shè)計合成 . 35 多菌靈多克隆抗體的制備 . 35 菌靈殘留 接競爭）的建立 . 35 菌靈殘留 接競爭）的檢驗(yàn) . 36 參考文獻(xiàn) . 37 致 謝 . 43 作者簡歷 . 44 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 藥殘留免疫速測研究的意義 我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)、穩(wěn)定增長，農(nóng)產(chǎn)品供給由長期短缺到總量基本平衡、豐年有余，同時，也付出了資源 過度消費(fèi)和環(huán)境質(zhì)量日益惡化的沉痛代價。化肥、化學(xué)農(nóng)藥、除草劑等農(nóng)用化學(xué)品的長期、大量、不合理使用，對我國農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)畜產(chǎn)品的安全生產(chǎn)及人體健康與生命構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。全國每年因農(nóng)業(yè)污染造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá) 160 多億元。 20 世紀(jì) 90 年代以來，我國 蔬菜和水果農(nóng)藥殘留引起人畜中毒死亡事件頻繁發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計， 1981 ，死亡 ， 1985 年全國農(nóng)藥中毒人數(shù) ，死亡 ；近 10 年來，我國平均每年發(fā)生中毒事故約 10 萬人，死亡 1 萬多人（單正軍等， 1997）。其中 1992 年至 1996 年全國 26個省市發(fā)生農(nóng)藥中毒事件 247349 例，死亡 24612 人 (陳曙陽 王鴻飛， 1997)，我國每年因農(nóng)藥中毒的人數(shù)占世界同類事故中毒人數(shù)的 50%。據(jù)農(nóng)業(yè)部 2000 年底對我國 14 個省會城市 2110 個樣品的檢測結(jié)果，蔬菜中農(nóng)藥超標(biāo) 率 高達(dá) 其中北京、天津、上海、廣州、南寧、昆明等大城市蔬菜農(nóng)藥 殘留超標(biāo)率超過 50%(彭紅蘭 陳永寧， 2000)。近年來，我國蔬菜、茶葉出口中每年因 農(nóng)藥 殘留超標(biāo)而被進(jìn)口國拒收、扣留、遲貨、索賠、終止合同、拒絕入關(guān)等事件時有發(fā)生，給國家?guī)砭薮蟮慕?jīng)濟(jì)損失并丟失了國際市場，有損國家形象。隨著我國加入 及人民生活水平的提高，在國際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中，將面臨更加苛刻 的 農(nóng)藥殘留 等有毒化學(xué)品殘留標(biāo)準(zhǔn)的制約。同時，我國的農(nóng)貿(mào)市場小而多，中規(guī)模以上的就有 5000 多個，農(nóng)藥殘留的檢測與市場準(zhǔn)入控制將面臨大量的農(nóng)藥殘留超標(biāo)篩選，缺少快速 、 靈敏 、 準(zhǔn)確的檢測技術(shù)就難以進(jìn)行，難以消除消費(fèi)者的心理 影響。所以農(nóng)藥殘留的快速檢測問題，已成為我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)和貿(mào)易發(fā)展的重要制約因素之一。急需研究建立蔬、果、茶 中農(nóng)藥殘留 快速檢測技術(shù)，研發(fā)小型、便攜、適于現(xiàn)場檢測快速實(shí)用的速測產(chǎn)品，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與 市場監(jiān)控 提供技術(shù)支撐。 國內(nèi)已有的檢測技術(shù)和儀器設(shè)備重點(diǎn)是對產(chǎn)后農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的精確測定， 而 對殘留快速檢測技術(shù)及速測產(chǎn)品的研制起步晚 。 隨著我國人民生活現(xiàn)代化和生活質(zhì)量的不斷提高，消費(fèi)者對蔬、果、茶等農(nóng)產(chǎn)品中 的 農(nóng)藥 殘留提出了更高的要求，現(xiàn)有的速測技術(shù) 不能滿足我國農(nóng) 產(chǎn)品安全生產(chǎn)監(jiān)測及廣大消費(fèi)者的需求。 隨著待測樣本 數(shù) 量 ，特別是要求現(xiàn)場快速檢測樣品 數(shù) 量的迅速增加，迫切需要開發(fā)和運(yùn)用高效 、 快速 的 新技術(shù) 和方法 。為了滿足當(dāng)前農(nóng)藥殘留 檢測 的要求，有效地開展快速篩選和監(jiān)測農(nóng)藥殘留的危害，一些新興的分析技術(shù)不斷涌現(xiàn)，如農(nóng)藥殘留的多殘留快速檢測方法等均取得了進(jìn)展。農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)不斷朝著更加快速、方便、靈敏與可靠的方向發(fā)展。 免疫分析法 (一種以抗體作為生物化學(xué)檢測器，對化合物、酶或蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的技術(shù)，它基于抗原與抗體的特異性反應(yīng)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高 (檢測限可達(dá) 1 1000 )、方便 快捷、分析容量大、檢測成本低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。一般不需要貴重儀器 ， 可大大簡化甚至省去前處理過程 ， 對使用人員的 專業(yè) 技術(shù)要求不高 ， 容易普及和推廣 ，尤其適宜現(xiàn)場篩選和大量樣品的快速分析 。 該技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品 檢測試劑盒 ， 可廣泛應(yīng)用于大量中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 引言 2 樣品的快速 篩選 檢測 和現(xiàn)場檢測 。 20 世紀(jì) 90 年代以來它在檢測糧食、水果、蔬菜、肉、奶、水和土壤中農(nóng)藥的殘留分析上得到迅速發(fā)展 ， 成為研究比較多的一項(xiàng)分析技術(shù)。世界糧農(nóng)組織 ( )已向許多國家推薦此項(xiàng)技術(shù)。因此 ， 人們稱免疫分析技術(shù)是 21 世紀(jì)最具競爭性和挑戰(zhàn)性的檢測分析技術(shù)。 藥免 疫檢測技術(shù)基本原理 疫與抗原抗體反應(yīng) 脊椎動物機(jī)體具有免疫系統(tǒng)，當(dāng)異源性大分子進(jìn)入體內(nèi)時，能刺激機(jī)體發(fā)生保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)（免疫反應(yīng)），產(chǎn)生特異性的保護(hù)物質(zhì)（免疫球蛋白 即抗體）來識別該異源物質(zhì)（即抗原或免疫原）并與之結(jié)合，從而“鈍化”該物質(zhì)以排除其干擾?？乖c抗體的結(jié)合反應(yīng)是高特異性的，主要依靠抗原與抗體間結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)空間結(jié)構(gòu)的精密“鍥合”和范德 華 力 等維系 ?？贵w抗原結(jié)合反應(yīng)符合質(zhì)量作用定律，因而反應(yīng)不僅可以在體內(nèi)進(jìn)行，也可以在體外進(jìn)行。 分子免疫 抗原的免疫原性與分子的大小密切 相關(guān)。凡具有免疫原性的物質(zhì)，分子量常大于 10000，分子量小于 5000 的一般免疫原性很弱，特別是分子量在 1000 以下的小分子幾乎無免疫原性?？乖镔|(zhì)要求有一定的分子量，同時也要有一定的分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象。分子結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜者抗原性強(qiáng)，如含有芳香族氨基酸和堿性氨基酸的蛋白質(zhì)較含其他氨基酸者抗原性強(qiáng)?？乖肿拥目臻g構(gòu)象，即基團(tuán)之間的相互立體關(guān)系，是決定抗原性重要的因素，但是空間構(gòu)象是最容易受到破壞的因素。 一種抗原物質(zhì)刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，這種抗原只能與相應(yīng)的抗體相結(jié)合發(fā)生反應(yīng)，即抗原的特異性（ 也就是所謂的抗原所引起的免疫應(yīng)答具有極強(qiáng)的針對性?？乖牡姆肿恿浚Y(jié)構(gòu)復(fù)雜性和特異性不決定于整個抗原分子，而決定于抗原分子表面具有特殊立體構(gòu)型和 免疫活性的化學(xué)基團(tuán)，這些基團(tuán)易為機(jī)體的免疫應(yīng)答所針對，是與抗體相結(jié)合的部位，這個區(qū)域或基團(tuán)稱為抗原決定簇（ 又稱抗原表位（ 實(shí)驗(yàn)證明，將某些簡單的化學(xué)基團(tuán)，如羧基（ 磺酸基（ 砷酸基（ 別連接在苯胺或其他芳香胺上，通過偶氮化作用，使之與血清蛋白相連 接，形成的產(chǎn)物稱為偶氮蛋白質(zhì)。這些物質(zhì)的抗原特異性決定于新結(jié)合上去的暴露于表面的簡單化學(xué)基團(tuán)，而不在蛋白質(zhì)本身，這就是半抗原的免疫機(jī)理。 抗原特異性決定于抗原決定簇的性質(zhì)、氨基酸或碳水化合物的種類、序列及空間立體構(gòu)型。空間構(gòu)象與抗原特異性有 密切 關(guān)系，光學(xué)異構(gòu)性對免疫原性也有很大影響。 D 型低于 L 型（氨基酸中，除甘氨酸外，都有不對稱碳原子，都有旋光性）。旋光性 也 影響抗原的特異性。例如，把酒石酸的光學(xué)異構(gòu)物分別和對硝基苯胺縮合，經(jīng)重氮化再連接到蛋白質(zhì)載體上，以研 究其抗原特異性，結(jié)果表明，其免疫原性互不相同。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 引言 3 藥免疫檢測原理 農(nóng)藥的分子量大多小于 1000，這些小分子物質(zhì)盡管具有反應(yīng)原性，可與特異性抗體相結(jié)合形成半抗原抗體復(fù)合物，但是本身通常沒有免疫原性，不能直接刺激動物機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，但當(dāng)它們與蛋白質(zhì)載體結(jié)合后即可獲得免疫原性。此外，小分子物質(zhì)本身也不能被現(xiàn)有的固 相 載體吸附，而必須與載體蛋白偶聯(lián)后，才能通過載體蛋白的作用將農(nóng)藥半抗原包被在固 相 載體上。包被在固 相 載體上的半抗原（定量）和待測液中的半抗原（待測物質(zhì)）競爭地與限量抗體結(jié)合，通過測定半抗原 抗體復(fù)合物的量計算待測物的含量。 藥免疫檢測技術(shù)研究的方法 抗原的分子設(shè)計 農(nóng)藥相對分子質(zhì)量一般小于 1000， 不具備刺激機(jī)體產(chǎn)生針對農(nóng)藥抗原決定 簇 的特異 抗體 ，必須與大分子物質(zhì)連接后才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，這也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的結(jié)構(gòu)對方法的檢出限和選擇性至關(guān)重要，因此，首先需要合成可直接與載體 (一般為蛋白質(zhì) )偶聯(lián)，并能最大程度模擬待測分子結(jié)構(gòu)的半抗原。理想的半抗原，一方面應(yīng)具備待測物的結(jié)構(gòu)特征，特別是立體結(jié)構(gòu)；另一方面與載體連接后應(yīng)保證該特征結(jié)構(gòu)能最大程度地 為與 免疫活 性細(xì)胞識別 ，并與之 結(jié)合，以制備出具有預(yù)期選擇性和親合性的抗體。典型的半抗原結(jié)構(gòu)應(yīng)具備適當(dāng) 的 末端活性基團(tuán)，如 ，同時活性基團(tuán)與載體之間應(yīng)具備一定長度的間隔臂，一般為 3 6 個碳鏈長度 (0.8 間隔臂一般為非極性，且除供偶聯(lián)的活性基團(tuán)外，不應(yīng)有其它高免疫活性的結(jié)構(gòu)，如苯環(huán)、雜環(huán)等，以降低抗體對間隔臂的識別和間隔臂對待測物結(jié)構(gòu)特征的影響 。此外， 間隔臂還應(yīng)遠(yuǎn)離待測物的特征結(jié)構(gòu)部分和官能團(tuán)，有利于高選擇性和高親合性抗體的產(chǎn)生。 研究表明，半抗原的合成應(yīng)該遵循以下幾個 基本原則： (1)間隔臂 (或連接分子 )應(yīng)盡量避免連接在目標(biāo)分子的官能團(tuán)處或靠近官能團(tuán)處，而是最好位于重要的特征性官能團(tuán)的遠(yuǎn)端，否則會減少抗體與目標(biāo)分子的識別和結(jié)合位點(diǎn)。 (2)對于結(jié)構(gòu)類似的一類化合物，間隔臂應(yīng)當(dāng)在它們具有相同結(jié)構(gòu) (或類似結(jié)構(gòu) )的位置連接，以最大限度的使分子的獨(dú)特部位暴露。間隔臂長 度一般以 3 或 0. 58宜。 (3)盡可能避免間隔臂含較強(qiáng)的決定簇 (如芳環(huán)、共軛雙鍵或雜環(huán)等 )，通常以含末端活性基團(tuán)的鏈烷 烴 為宜，以減少所產(chǎn)生的抗體對間隔臂的過度識別而降低對目標(biāo)分子的識別能力。 抗原與載體蛋白的偶聯(lián) 大多數(shù)農(nóng)藥都是小分子化合物，本身沒有免疫原性，它們必須與大分子物質(zhì)連接后才能刺激機(jī)體 產(chǎn)生特異性抗體 。 所以，需要首先合成能直接與載體偶聯(lián)并能最大程度模擬待測分子結(jié)構(gòu)的半抗原。半抗原通常由待測農(nóng)藥衍生物制備或由原料合成，在其結(jié)構(gòu)的末端需有可直接與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的活性基團(tuán)，常用的活性基團(tuán)有 。半抗原與載體蛋白的偶中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 引言 4 聯(lián)即人工抗原的合成。常用的載體蛋白有牛血清白蛋白（ 人血清白蛋白 (兔血清白蛋白 (豬血清白蛋白 ( 鉬 孔血藍(lán)蛋白 (卵清蛋白 (。根據(jù)半抗原 (待測農(nóng)藥改造物 )的結(jié)構(gòu) 特征 ，常用的連接方法主要包括：通過羧基連接的混合酸酐法和碳二亞胺 (；通過羥基連接的琥珀酸酐法；通過醛基連接的戊二醛法；通過酚基連接的重氮化法；通過氨基連接的 應(yīng)和丙烯酸法；通過酮基連接的氨基氧乙酸法等。 一般 認(rèn)為每個分子載體上連接的半抗原分子數(shù)以 10 左右為宜，過高結(jié)合比抗原易導(dǎo)致動物免疫耐受。 藥人工抗原偶聯(lián)比例的測定 鑒定農(nóng)藥人工抗原最常用的方法是紫外光譜掃描法，如果人工抗原的紫外吸收圖譜 不同于原載體蛋白和半抗原的紫外掃描圖譜，則證明人工抗原合成成功。半抗原、 偶聯(lián)物進(jìn)行紫外掃描，根據(jù)半抗原偶聯(lián)物在紫外區(qū)域的吸收約等于游離蛋白和半抗原吸光值的簡單加和的特點(diǎn)，可通過三者在 280吸光值推算其可能的結(jié)合比。本論文即采用該法。計算公式如下： K A B 式中： 偶聯(lián)物中 A、 、 物質(zhì)在 物質(zhì)在 物質(zhì)在其最大吸收波長下的吸光值。 物質(zhì)在其最大吸收波長下的吸光值。 物質(zhì)在 物質(zhì)在 大波長下的吸光值。 物質(zhì)最大吸收波長下的吸光值。 物質(zhì)最大吸收波長下的吸光值。 藥免疫分析的發(fā)展趨勢 20世紀(jì) 90年代以來，一些新方法和新手段的出現(xiàn)，有力地推動了農(nóng)藥免疫分析技術(shù)的快速發(fā)展。如分析農(nóng)藥小分子的結(jié)構(gòu)，深入探討其抗原決定簇的位置，通過化學(xué)方法封閉或突出某些特定的抗原決定簇，就可制備該決定簇的特異性抗體，以增加檢測的特異性，避免交叉反應(yīng)；也有人提出可以考慮用能產(chǎn)生部分交叉反應(yīng)的結(jié)構(gòu)類似物，制成合適的免疫抑制原，對動物進(jìn)行選擇中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 引言 5 性免疫抑制， 然后用相應(yīng)的抗原進(jìn)行免疫，可提高抗原對該物質(zhì)識別的特異性；把免疫分析與其它技術(shù)聯(lián)用，如免疫分析與流動注射系統(tǒng)相結(jié)合形成流動注射免疫技術(shù)，免疫分析與傳感器結(jié)合形成免疫傳感技術(shù)，免疫分析與氣相、液相色譜聯(lián)用等，都充分利用了兩種技術(shù)的優(yōu)勢，既可增加檢測的靈敏度又可降低交叉反應(yīng)；多組分分析物免疫分析的應(yīng)用，為多種農(nóng)藥暴露檢測以及混配農(nóng)藥分析創(chuàng)造了條件 ； 利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行 備具有抗原完整功能的抗體片斷，并在生長繁殖迅速的生物體如大腸桿菌上進(jìn)行足夠量表達(dá)，就可大大縮短特異性抗體制備時間等。 疫傳感器 免疫傳感器（ 將免疫測定法與傳感技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建的一類新型生物傳感器 ， 應(yīng)用于痕量免疫原性物質(zhì)的分析研究。它利用動物體內(nèi)抗原、抗體能發(fā)生特異性吸附反應(yīng)的性質(zhì)，將抗原（或抗體）固定在傳感器基體上，通過傳感技術(shù)使吸附發(fā)生時產(chǎn)生物理、化學(xué)、電學(xué)或光學(xué)上的變化，轉(zhuǎn)變成可檢測的信號來測定環(huán)境中待測分子的濃度。被用于分析的對象從復(fù)雜的病毒、微生物、生物毒素，到簡單的農(nóng)藥分子、工業(yè)有機(jī)污染物、重金屬離子等各種物質(zhì)，成為檢測食品中痕量有害物質(zhì)方法的研究熱點(diǎn)。近年來，根據(jù)免疫化學(xué)原理研 制出的微型生物傳感器在現(xiàn)場監(jiān)測、原位分析、在線分析、微區(qū)分析、動態(tài)跟蹤監(jiān)控等方面顯示出誘人的開發(fā)前景。 組分分析物免疫分析 (多組分分析物免疫分析（ 指在同一份樣品中，同時測定兩種或兩種以上的相關(guān)分析物的免疫分析技術(shù)。這種技術(shù)的應(yīng)用對需要檢測多種物質(zhì)的綜合測定提供了重要信息，有利于環(huán)境、食 品 中 多種農(nóng)藥殘留和職業(yè)中多種農(nóng)藥接觸檢測，特別是對混配農(nóng)藥接觸分析以及對其聯(lián)合作用及體內(nèi)代謝動力學(xué)的探討和研究具有重要意義。 動 注射免疫分析 (1980 年 S 等將流動注射分析 (與特異性強(qiáng)、靈敏度高的免疫分析 (為一體 ， 創(chuàng)立了流動注射免疫分析法 (它是將抗體固定在適當(dāng)載體膜上制備均勻一致的抗體膜帶（可分段使用），將膜帶的一部分安裝于密封但有樣品進(jìn)出口的微型槽內(nèi)，從進(jìn)口處注入待測樣品和酶標(biāo)樣品的混合液，競爭性結(jié)合反應(yīng)在微型槽內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)所 引起的特定物理或化學(xué)參數(shù)的變化由配套的檢測系統(tǒng)檢測出來， 該法分析速度快，自動化程度高， 目前已在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測及農(nóng)殘檢測等方面得到了廣泛應(yīng)用。 疫 術(shù) （ 將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性與 術(shù)的高靈敏度、高自動化、操作簡便等特點(diǎn)結(jié)合起來，形成了免疫 術(shù)，開創(chuàng)了免疫檢測技術(shù)的新時代。免疫 抗原抗體特異性反應(yīng)與 大的擴(kuò)增能力結(jié)合在一起，使免疫分析的靈敏度進(jìn)一步提高，是目前為止最為敏感的檢測方法之一，理論上可以檢測到一個抗原分子的存在。免疫 基本原理與 第一章 引言 6 基本相似，所不同的是用一段可擴(kuò)增的 子代替 的酶來放大檢出信號。 疫親和層析 將純化后的抗體固定到適當(dāng)固相載體上制成免疫吸附劑。利用農(nóng)藥小分子的反應(yīng)原性和抗原抗體結(jié)合的特異性以及一定條件下能可逆解離的原理，以免疫吸附劑為固定相，對復(fù)雜樣品中超微量農(nóng)藥殘留進(jìn)行選擇性吸附，然后在適當(dāng)條件下洗脫，從而選擇性地提取與濃縮超微量農(nóng)藥殘留。所得提取物可直接用 理化分析方法進(jìn)行檢測。大大簡化了樣品前處理過程，提高了提取效率。免疫親和層析是提高農(nóng)藥殘留 分析靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確性和可靠性的一項(xiàng)具有很高實(shí)用價值的配套技術(shù)。雖然固相免疫吸附劑可再生利用，但其制備所需代價較高，使用和保存壽命有一定限度，尚待深入研究解決。 總之，免疫檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、毒素、農(nóng)殘、獸殘，重金屬等的檢測。它以高特異 、靈敏 、 廉價、快速等特點(diǎn)，已在國外環(huán)境和食品安全檢測中占有一定的位置。今后隨著分子生物學(xué)、基因工程及電腦技術(shù)的發(fā)展，可望合成更高親和力和特異性的抗體并使其操作自動化，從而推動免疫分析技術(shù)的進(jìn)步，提高食品安全檢測的有效性和實(shí)用性。 研究的立題依據(jù)及意義 70 年代以來，隨著有機(jī)氯類農(nóng)藥受到禁用或限用，有機(jī)磷農(nóng)藥的高毒性、高殘留，以及抗有機(jī)磷農(nóng)藥昆蟲品種的日益增多，因而氨基甲酸酯類農(nóng)藥的使用量逐年增加，這就使得氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留情況倍受關(guān)注。多菌靈，有效成分為 一個廣譜內(nèi)吸性氨基甲酸脂類殺菌劑，對子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌類中大多數(shù)病原菌都有效，目前正廣泛用于小麥赤霉?。ㄌ匦В?、水稻稻瘟病、水稻紋枯病、谷類黑穗病、棉花菌病及紅薯黑斑病的防治 。 但大量使用造成在空氣、土壤和水中的持久殘留，不僅造成環(huán)境污染，而且對人體