《IDNA的復制》PPT課件

Chapter4DNAreplication,Keynotes,Semi-conservativemechanismReplicons,originsandterminiSemi-discontinuousreplicationRNApriming,BasiccharactersofDNAreplication(基本特征）TheenzymeofDNAreplication（酶學）TheprocessofDNAreplication（過程）Reversetranscription（反轉錄）,DNA復制的基本特征,Template,四種dATP,dGTP,dCTP,dTTP為前體，二價金屬離子Mg2+(或Mn2+)，按照堿基互補配對規(guī)則復制產生子鏈解鏈復制方式為半保留復制（semi-conservativereplication）需要引物（primer）復制方向總是5-3復制子（replicon)復制的方向：一般為雙向半不連續(xù)性：岡崎片斷(Okazakifragment)具有高度的忠實性,圖4-1DNA復制可能的三種方式以及Meselson和Stahl實驗的可能結果,半保留復制,1958年，Meselson和Stahl首次用實驗證實了DNA的半保留復制。用普通培養(yǎng)基（14N）培養(yǎng)15N標記的大腸桿菌。用CsCl密度梯度離心法分析DNA。抽提子一代DNA分子。,圖4-2Meselson和Stahl實驗的實際結果,HerbertTaylor在植物根尖細胞中使用放射自顯影證明，真核細胞DNA的復制方式也是半保留。,復制子（replicon),復制子:基因組中能單獨進行復制的單位。每個起始點到終止點的區(qū)域為一個復制子。起始點（originofreplication,ori):原核生物DNA分子中只有一個，長度200bp左右。大腸桿菌oriC有245bp。真核生物有多個復制起始點。三個特征：a）由多個短的重復序列組成；b)富含AT；c)能夠被特定的復制起始區(qū)結合蛋白識別。終點（ter）：通常不固定。,圖4-3證明DNA復制的方向始終是53的末端終止實驗,圖4-10DNA的半不連續(xù)復制,OkazakifragmentLeadingstrandLaggingstrand,DNA復制所需要酶和蛋白質,DNApolymerase(DNApol)DNA解鏈酶(helicase)：水解ATP獲能解開雙鏈DNA單鏈結合蛋白(single-strandedbindingprotein,SSB),DNA引發(fā)酶(primase)：RNA引物合成DNA拓撲異構酶(topoisomerase)：與超螺旋松馳有關，改變DNA拓撲性質，松馳超螺旋，有利于復制叉的前進，有型和型，原核、真核中均有。DNA連接酶(ligase)端粒酶(telomerase),原核生物DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol),1957年Kornberg首先從大腸桿菌提取DNApol：聚合作用：5335外切酶活性：校對功能53外切酶活性：引物切除、損傷修復主要功能是切除引物，填補岡崎片段產生的空隙及DNA損傷的修復DNApolI具有的聚合酶和5-外切酶活性的配合使用可導致本來一條鏈帶有切口的DNA分子發(fā)生切口平移(nicktranslation)。目前已在E.coli中發(fā)現(xiàn)DNApol、和。,DNApolI催化的缺口平移,DNApol是單一肽鏈的大分子,由polA編碼，分子量為109kD,二級結構以-螺旋為主。用特異的蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶subtilisin或胰蛋白酶trpsin）處理，可把DNApol水解為兩個片段。小片段：323個氨基酸殘基，53外切酶活性大片段或稱Klenow片段：605個氨基酸殘基，DNA聚合酶活性和35外切酶活性,圖4-13DNApol的聚合和校對,finger,thumb,palm,DNApol：53聚合酶活性及35外切核酸酶活性，90kDa，由polB基因編碼。DNApol:由10個亞基組成，分別為、及。是原核生物體內真正起復制作用的酶，主要有核心酶和全酶兩種形式。全酶由核心酶、滑動鉗(slidingclamp)和鉗載復合物(clamp-loadingcomplex)組成。核心酶：由、組成。亞基：由polC(也稱dnaE)基因編碼，53聚合酶活性亞基:由dnaQ基因編碼，35外切酶,校對和編輯為裝配必須PolIII：由核心酶和亞基組成。體內PolIII形成二聚體，分別負責前導鏈和后隨鏈的復制。鉗載復合物：由、及亞基組成，具有ATP酶活性，負責滑動鉗的裝載?；瑒鱼Q：由兩個亞基組成，為環(huán)繞DNA模板而成的環(huán)狀六角星結構。,圖4-14E.coliDNApolIII全酶的結構模型,DNApol和1999年被發(fā)現(xiàn)，屬于易錯的聚合酶，參與DNA的修復合成。DNApol與DNApolII在細菌生長的穩(wěn)定期被誘導表達，一起修復該階段DNA損傷DNApol在細菌進行SOS反應時被誘導合成。由1個UmuC和2個UmuD組成。,真核生物DNA聚合酶,目前發(fā)現(xiàn)超過15種，最重要的是、和五種。、及四種，都有53聚合功能。及、參與核染色體DNA復制；：鏈合成的引發(fā)，和：鏈的延長，具3-外切酶活性，校對功能。PCNA(proliferatingcellnuclearantigen)為的輔助蛋白，三個亞基組成滑動鉗，以提高的進行性。：兩個結構域，N-端為5-脫氧核糖磷酸酶和與單鏈DNA結合的活性；C-端具聚合酶活性。參與DNA損傷的修復，增補DNA鏈上短的空隙。：線粒體DNA復制和損傷修復，具聚合酶、3-外切酶和5-脫氧核糖磷酸酶活性。,端粒與端粒酶(telomerase),Telomere:真核生物線性染色體3-末端的一種特殊結構，由蛋白質和DNA組成。核苷酸重復序列富含G，和端粒結合蛋白組成核蛋白復合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重復序列，長度515kb。作用：保護染色體末端免于化學修飾或核酸酶降解以及不正常的融合和重組；解決染色體復制時末端丟失問題。,Telomerase:由RNA和蛋白質組成的酶。兼有模板和逆轉錄酶兩方面的作用。1995年，F(xiàn)eng等克隆了人類端粒酶RNA基因，長約450個堿基的RNA序列中有一段長11個核苷酸的區(qū)域（5-CUAACCCUAAC-3）與人的端粒序列（TTAGGG）n互補。端粒酶蛋白質的分離：四膜蟲端粒酶兩個多肽成分p80和p95。,圖4-27端粒酶的作用機理,端粒與衰老,實驗：在無端粒酶活性的成纖維細胞中表達端粒酶時，端粒的縮短和細胞的衰老都受到抑制。結論：細胞的衰老是由端粒驅動的。體外培養(yǎng)的細胞端粒的長度隨細胞逐代相傳而縮短，丟失到一定程度便失去對染色體的保護作用。細胞隨之發(fā)生衰老和死亡。,可把端?？闯梢幻骁?，端粒的長度是鐘上的刻度，記載了細胞分裂的次數(shù)，稱為“端粒鐘”，或有絲分裂鐘或“生命的時鐘”，可通過測定端粒的長度預測細胞的壽命。胚胎細胞和生殖細胞端粒的長度并不隨細胞分裂次數(shù)的增加而縮短，具有無限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在，而體細胞則很難檢測到端粒酶的活性，端粒的長度也短得多。,端粒酶與腫瘤,人體內除了生殖細胞和少數(shù)一些體細胞如淋巴細胞等細胞外，絕大多數(shù)體細胞中無法檢測到端粒酶的活性，而在多數(shù)腫瘤細胞中能檢測到端粒酶的活性。體細胞的端粒長度很短，其繼續(xù)縮短導致染色體融合、細胞死亡，而腫瘤端粒酶的激活可以維持端粒的長度，維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖。端粒酶的表達可能是腫瘤形成和發(fā)展的共同途徑。,端粒酶與惡性腫瘤之間有相關性使之在腫瘤的診斷和治療上有望成為新的靶目標?？梢酝ㄟ^各種途徑抑制端粒酶的活性有效抑制大多數(shù)腫瘤的生長，而對正常細胞沒有影響。人端粒酶逆轉錄酶(humantelomerasereversetranscription)：具有腫瘤特異性，因此hTERT啟動子可以用于靶向治療基因的表達。,Figure1Schematicdiagramofadeno-associatedvirus(AAV).(a)Thestructureofthewild-typeAAV.(b)Thegene-deliveryvectorbasedonAAV.Theviralgenomeisreplacedbyanexpressioncassette,whichusuallyconsistsofapromoter,transgeneandpolyA(pA)tail.(c)DiagramofAAV-hTERT-hIFN-.(d)DiagramofthetwoORFrepandcap.CapencodesthreecapsidproteinsVP1,VP2andVP3.Thearrowsmarksitesofthespecificligandsinsertion(numbersaretheaminoacidpositionsN-terminaloftheinsertion).,ChinSciBulletin,2007,52:1590-1599.,Oncogene(2004)23,457-464,DNA的復制的過程,DNA復制過程的三個階段DNA復制的起始階段，包括起始點，復制方向以及引發(fā)體的形成。DNA鏈的延長，包括前導鏈及隨從鏈的形成和切除RNA引物后填補空缺及連接岡崎片段。DNA復制的終止階段。,（一）DNA復制的起始階段復制是從DNA分子上的特定部位開始的，即復制起始點(originofreplication)常用ori或o表示，復制的基本單位為復制子或復制單元(replicon)。在原核細胞中只有一個復制起始點，一個復制子。在真核生物中復制是從許多起始點同時開始的，即有多個復制子。,DNA復制起始點的結構特性大腸桿菌Ori由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復序列，即回文結構(palindrome)。有些生物復制起始點Ori是富含AT的區(qū)段。這些特殊的結構對于在DNA復制起始過程中參與的酶和許多蛋白質分子的識別和結合都是必須的。,圖4-28E.coli的OriC結構,(一)DNA復制的起始E.ColiDNA復制起始包括對其復制起始區(qū)OriC的識別，以及引發(fā)體(primosome)的形成。DNA雙螺旋的解旋由多種酶來完成的DNA解鏈酶：水解ATP獲能解開雙鏈DNA單鏈結合蛋白（SSB蛋白）：保持單鏈結構引發(fā)酶(RNA聚合酶)：合成RNA引物隨從鏈是由引發(fā)體來完成的,圖4-29E.coliDNA復制過程中引發(fā)體的形成,（二）DNA鏈的延長復制的延伸在復制體(replisome)內進行。DNA的復制實際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將四種dNTP聚合成DNA的過程。過程：復制體的形成前導鏈合成后隨鏈合成后隨鏈合成與前導鏈合成之間的協(xié)調。,圖4-30E.coliDNA復制過程中復制體的形成,圖4-31E.coliDNA復制的延伸,（三）DNA復制的終止階段E.coliDNA具有復制終止位點Ter位點，此處可以結合一種特異的蛋白質分子叫做Tus(terminatorutilizationsubstance)，通過阻止DnaB解鏈酶(Helicase)的解鏈活性而終止復制。,圖4-32E.coliDNA復制終止區(qū)的結構,其它環(huán)狀DNA分子的復制,1、復制:首先由J.Carins從大腸桿菌中觀察到,又稱為Carins復制。2、滾環(huán)復制（rollingcirclereplication)：噬菌體(X174和M13)和一些小質粒；真核生物如兩棲卵母細胞的rDNA和哺乳動物的DHFR(二氫葉酸還原酶)基因。3、D環(huán)復制（Dloopreplication)：線粒體和葉綠體DNA和少數(shù)病毒如腺病毒DNA的復制,滾環(huán)復制,D環(huán)復制圖,真核與原核生物DNA復制的特點(差別)染色質和核小體結構對DNA復制的影響復制叉移動的速度遠遠低于原核細胞真核生物是多點復制，具多個復制起始區(qū)，原核生物是單點復制。岡崎片段的長度短于原核細胞復制嚴格限制在細胞周期的S期真核生物在完成全部復制之前，各個起始點上DNA的復制不能再開始；原核生物起始點上可連續(xù)開始新的DNA復制。真核生物線性DNA末端具有端粒結構。,逆轉錄（reversetranscription),逆轉錄：以RNA為模板合成DNA，存在于逆轉錄病毒以及原核生物和真核生物如端粒酶的延長等。逆轉錄酶（reversetranscription)逆轉錄病毒的基因組復制過程乙肝病毒基因組的復制,圖4-40（1）逆轉錄病毒的結構,圖4-40（2）逆轉錄病毒的詳細結構,圖4-41逆轉錄病毒基因組的結構,圖4-42HIV的生活史,圖4-43HIV與宿主細胞的附著,圖4-44逆轉錄病毒基因組逆轉錄的詳細過程,圖4-45逆轉錄病毒基因組的逆轉錄結果,圖4-46原病毒DNA進入細胞核的機理,逆轉錄酶（reversetranscription),1964年，Temin發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。表明：RNA腫瘤病毒的RNA復制過程中要合成DNA。Temin又發(fā)現(xiàn)放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復制，但不能抑制一般RNA病毒的復制。表明：轉錄對于RNA病毒增殖是必需的。,Temin提出前病毒假說：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復制和致癌中的中間物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶。,逆轉錄酶是一種多功能酶：1、RNA指導的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA雜交體上的RNA3、DNA指導的DNA聚合酶活性：合成互補DNA。4、沒有35外切酶活性。,特點：含有Zn2+DNA合成反應要求有模板和引物。需適