實(shí)驗(yàn)五--考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

實(shí)驗(yàn)五 考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理與方法2、熟練分光光度計(jì)的使用和操作方法二、實(shí)驗(yàn)原理 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。 考馬斯亮藍(lán)G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色?？捡R斯亮藍(lán)G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長(zhǎng)為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量。三、實(shí)驗(yàn)器材1、實(shí)驗(yàn)儀器分析天平、722型分光光度計(jì)、5mL移液管、研缽、量筒2、實(shí)驗(yàn)材料和試劑1）綠豆芽2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)原液：稱(chēng)取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100mL，即為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)原液。3）考馬斯亮藍(lán)G-250試劑：稱(chēng)取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取6支試管，按下表加入各試劑。試管號(hào)試劑012345100 g/ml牛血清白蛋白溶液ml00.20.40.60.81.0蒸餾水ml1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)液ml5.05.05.05.05.05.0加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄A595。以各管相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（g）為橫坐標(biāo)、A595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、綠豆芽蛋白質(zhì)樣品的制備 取兩根新鮮綠豆芽的下胚軸，稱(chēng)量并記錄重量后，放入研缽中，研成勻漿，用5ml蒸餾水份三次，把研缽沖洗干凈，將全部液體轉(zhuǎn)入試管中待用。3、樣品測(cè)定試管中加自制蛋白質(zhì)樣品1.0mL ，再加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長(zhǎng)下比色，記錄A595。根據(jù)所測(cè)A595從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 樣品蛋白質(zhì)含量 (g/g 鮮重) =查的蛋白質(zhì)含量 (g/g) 提取液總體積 (ml) / 樣品鮮重 (g)測(cè)定所取提取液體積(ml)六、注意事項(xiàng)（1） 如果測(cè)定要求很?chē)?yán)格，可以在試劑加入后的520min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。比色反應(yīng)需在1h內(nèi)完成。（2） 測(cè)定中，蛋