臨床微生物實驗室細菌鑒定指南匯總

臨床微生物實驗室細菌鑒定指南(續(xù)) 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 實驗診斷中心溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院實驗中心潘欽石潘欽石一細菌的鑒定步驟1 鑒定的概念：將一個未知的菌株按其生物學(xué)特性，經(jīng)過與所有已知菌種進行比較后劃歸到一個已知菌種的分析過程。2 對待鑒定的菌種要明確已經(jīng)獲得純化培養(yǎng)或者該菌種在血平板上生長良好，有單個菌落可以進行生化試驗。（我們這里一般都是預(yù)先純化培養(yǎng)）3 對待鑒定的菌種進行革蘭染色，觀察形態(tài)（G+c，Gb，Gc，G+b），做觸酶，氧化酶實驗，然后按科，屬，種逐步鑒定。要注意對待鑒定的菌種選擇一個合適的鑒定系統(tǒng)，臨床常見細菌的快速簡單的鑒定系統(tǒng)我們都已經(jīng)設(shè)計好，參考鑒定質(zhì)控單。4 按鑒定質(zhì)控單的要求填寫好病人姓名，年齡，性別；標本類型，標本編號，送檢日期等。另外最重要的是要填寫好該菌種的菌落形態(tài)以及有無溶血。5 復(fù)習(xí)革蘭染色，觸酶實驗，氧化酶實驗。革蘭染色：是細菌鑒定過程中最常用最基本最重要的染色方法。首先要將待鑒定的細菌涂片，固定（目的：殺死細菌，改變細菌對染料的通透性）。第一步：以結(jié)晶紫初染（染色液）第二步：以盧戈氏碘液媒染（染色液）第三步：用95%乙醇脫色（染色液）第四步：最后用稀釋復(fù)紅復(fù)染（染色液）觸酶實驗(H2O2實驗)：a.原理：具有過氧化氫酶的細菌能催化雙氧水生成水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現(xiàn)氣泡。b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在潔凈的玻片上涂開，滴加3%過氧化氫數(shù)滴，觀察結(jié)果（立即有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性）。要注意不能在血平板上進行實驗，這樣易出現(xiàn)假陽性；另外陳舊菌落要是進行實驗可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；還有不能在接種針或環(huán)上進行實驗。c.陽性對照用金黃色葡萄球菌，陰性對照用鏈球菌；試劑要避光置4冰箱保存。d.應(yīng)用：絕大多數(shù)含細胞色素的需氧和兼性厭氧細菌觸酶實驗陽性，鏈球菌屬陰性。臨床常見細菌鑒定實驗中我們一般用于區(qū)別葡萄球菌屬（+），微球菌屬（+），鏈球菌屬（）。氧化酶實驗（Kovac實驗）：a. 原理：氧化酶又稱細胞色素酶，是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。酶并不直接與試劑（1%鹽酸四甲基對苯二胺）起反應(yīng)，而是首先使細胞色素c氧化，然后氧化型細胞色素c使對苯二胺氧化，出現(xiàn)深蘭色反應(yīng)。b. 方法（濾紙法，菌落法，試劑紙片法）：一般我們采用濾紙法，取白色潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加試劑一滴，陽性者立即呈粉紅色，繼而出現(xiàn)深蘭色。結(jié)果讀取在10秒鐘時為最佳，60秒內(nèi)讀取可靠。本實驗避免接觸含鐵物質(zhì)（假陽性），也不能在含糖培養(yǎng)基上生長的菌落進行實驗（假陰性）。c. 陽性對照用銅綠假單胞菌，陰性對照用大腸埃希菌。d. 應(yīng)用：奈瑟氏屬的菌種均陽性，也用于區(qū)別假單胞菌屬和腸桿菌，前者陽性，后者陰性。二葡萄球菌屬的鑒定葡萄球菌屬主要的種有金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。1 形態(tài)與染色：葡萄球菌直徑0.51.5m，菌體圓形，呈單個，成雙以及不規(guī)簇狀排列。染色呈紫色，為革蘭陽性球菌。2 與鏈球菌的區(qū)別：觸酶實驗為陽性，而鏈球菌陰性；菌體形態(tài)鏈球菌小于葡萄球菌，呈成雙和鏈狀排列的卵圓形的革蘭陽性球菌。3 與微球菌的區(qū)別：觸酶實驗同為陽性，但微球菌的菌體呈四聯(lián)狀，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化發(fā)酵實驗（操作方法同甘露醇OF試驗）為氧化型；而葡萄球菌為發(fā)酵型。另外呋喃唑酮（即痢特靈50g/片）敏感實驗微球菌為耐藥，而金黃色葡萄球菌為敏感。4 葡萄球菌屬的種間鑒定：菌落色素與溶血毒素：金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃色，檸檬色或者淡黃色，而其他葡萄球菌則在血平板上菌落大多數(shù)為白色，也有部分為檸檬色或深黃色。溶血毒素：金黃色葡萄球菌有溶血毒素，各毒素的區(qū)別是對動物紅細胞的溶血范圍抗原性及溶血時的溫度等。其中以溶血毒素為主。而其他葡萄球菌大多數(shù)不產(chǎn)生溶血毒素，只有表葡有極少能產(chǎn)生溶血毒素。血漿凝固酶實驗：用與區(qū)別金黃色葡萄球菌（陽性），表皮葡萄球菌（陰性），腐生葡萄球菌（陰性）。血漿凝固酶是金葡菌所產(chǎn)生的，有結(jié)合凝固酶和游離凝固酶兩種。血漿凝固酶檢測有兩種方法，為玻片法和試管法，我們一般采用玻片法。a. 操作方法：挑取少許金黃色葡萄球菌菌落在玻片上與血漿乳化，結(jié)合凝固酶能作用于血漿中的纖維蛋白原，從而在金黃色葡萄球菌表面發(fā)生凝集，所以我們?nèi)庋勰芸匆娔w粒。玻片法主要由結(jié)合凝固酶作用產(chǎn)生；游離凝固酶是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的胞外酶，能與血漿中的血漿凝固反應(yīng)因子（類似凝血酶的一種物質(zhì)）作用，形成復(fù)合物再使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白而發(fā)生凝集。試管法主要由游離凝固酶作用產(chǎn)生。b. 注意事項：菌落不能太多，否則會影響結(jié)果觀察；凝固酶陽性要做自凝陰性對照（用生理鹽水代替血漿），只有在陰性對照也不凝集才能認為是真正的陽性，有一部分葡萄球菌有自凝現(xiàn)象。新生霉素敏感實驗：金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌對新生霉素紙片（5g/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌則對之耐藥。抑菌環(huán)直徑16mm即為新生霉素敏感。甘露醇氧化發(fā)酵實驗：a.操作方法：取兩支甘露醇微量生化管，在微量管內(nèi)接種待檢細菌，然后一支加兩滴石臘密封，另外一支則不加，放37孵箱內(nèi)1824h后觀察結(jié)果。b.結(jié)果觀察：微量生化管變黃色為陽性，也就是能利用甘露醇。若兩管都變黃色則說明是發(fā)酵型；其中加石蠟管不變色，沒加石蠟管變黃色則為氧化型；如果兩管都不變色則說明該細菌是不利用甘露醇（產(chǎn)堿型）。c.應(yīng)用：金黃色葡萄球菌在需氧和厭氧的條件下都能利用甘露醇（即兩管都變黃色）；表皮葡萄球菌需氧部分產(chǎn)酸，厭氧條件下不利用甘露醇（即沒加石蠟管有部分會變黃色，加石蠟管不變黃色）；腐生葡萄球菌與表皮葡萄球菌類似。三微球菌屬的種間鑒定微球菌屬主要的種有易變微球菌，藤黃微球菌，玫瑰微球菌。鑒定生化見下表微球菌屬的種間鑒定易變微球菌 藤黃微球菌 玫瑰微球菌色素產(chǎn)生 黃色 黃色 粉紅色需氧葡萄糖產(chǎn)酸 硝酸鹽還原 脲素酶 d d 氧化酶 /（弱）新生霉素敏感 S/R S Rd：不定 S：敏感 R：耐藥四鏈球菌屬1 形態(tài)和染色：鏈球菌的直徑為0.51.0m，呈成雙和鏈狀排列的卵圓形革蘭陽性球菌，菌體小于葡萄球菌，無鞭毛，沒有芽胞，但有些菌株會形成莢膜。肺炎鏈球菌呈矛頭狀，寬端相對，尖端向外。2 根據(jù)鏈球菌在血平板上溶血現(xiàn)象的不同分為三種：甲型（-）溶血，即菌落周圍出現(xiàn)較窄的草綠色溶血環(huán)；乙型（-）溶血，即菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)；丙型（-）溶血，即菌落周圍無溶血環(huán)。3 根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)（C多糖抗原）的不同可分為ABCDEFGHKLMNOPQRST等18個群，對人類有致病者90%屬于A群，偶見其他群鏈球菌致病。4 鏈球菌屬的種間鑒定乙型溶血鏈球菌的鑒定：a 對桿菌肽（0.04U/片）（抑菌圈直徑10mm）敏感：A群鏈球菌（主要為化膿性鏈球菌）。b 對桿菌肽不敏感，膽汁七葉苷實驗陰性，但馬尿酸鈉水解實驗CAMP實驗陽性：B群鏈球菌（主要為無乳鏈球菌）。c 對桿菌肽不敏感，膽汁七葉苷實驗陰性，馬尿酸鈉水解實驗陰性，CAMP實驗陰性：主要為馬鏈球菌類馬鏈球菌獸疫鏈球菌；對三者的區(qū)別實驗要加做海藻糖和山梨醇實驗。d CAMP實驗：將能產(chǎn)生-溶血的金黃色葡萄球菌在血平板上劃一橫線接種，再將待鑒定菌于金黃色葡萄球菌3mm處垂直種一短線，若在有CO2條件下培養(yǎng)56小時，或無CO2條件下培養(yǎng)1824小時，在兩細菌連接處出現(xiàn)一個半月型的加強溶血區(qū)即為CAMP實驗陽性。甲型溶血鏈球菌的鑒定：a 草綠色鏈球菌：對桿菌肽敏感，對奧普托欣（Optochin）不敏感，膽汁溶菌實驗陰性，膽汁七葉苷實驗陰性，在高鹽中不生長。主要有變異鏈球菌，輕型鏈球菌，血鏈球菌，唾液鏈球菌等。b 肺炎鏈球菌：菌體呈矛頭狀，成雙排列，鈍端相對，尖端相背，較葡萄球菌，其他鏈球菌略大；在血平板上菌落細小圓形表面光滑灰白色半透明，開始時菌落呈扁平狀，以后中心塌陷，呈臍窩狀。與草綠色鏈球菌的主要區(qū)別是膽汁溶菌實驗陽性，對奧普托欣（Optochin）敏感。奧普托欣（Optochin）含量為5g/片，抑菌環(huán)18mm為敏感，15mm為不敏感，1518mm應(yīng)重復(fù)實驗。腸球菌（D群鏈球菌）的鑒定：溶血不定，主要是-溶血；對桿菌肽不敏感，但其特異性實驗是膽汁七葉苷實驗陽性；若能在6.5%NaCl的心浸液肉湯中生長即為D群腸球菌，不能生長為D群非腸球菌。鏈球菌屬鑒定的系統(tǒng)生化結(jié)果判斷a 1%美蘭牛乳b 膽汁七葉苷實驗：變黑為陽性。c PH9.6肉湯實驗：變渾濁為能在堿性環(huán)境中生長（陽性）。d 6.5%NaCl心浸液肉湯：由紫變黃為能在高鹽環(huán)境中生長（陽性）。e 精氨酸雙水解酶實驗：變紅色（對照不變色，仍為黃色）為陽性。五奈瑟氏菌屬和布蘭漢菌屬奈瑟氏菌屬主要有腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌；布蘭漢氏菌屬只有卡他布蘭漢氏菌。兩者系需氧革蘭陰性球菌。 奈瑟氏菌的生物學(xué)特性：革蘭陰性球菌，需氧，卵圓形或腎形，無動力，氧化酶及觸酶均陽性。培養(yǎng)時對營養(yǎng)要求高，能在巧克力平板或有豐富營養(yǎng)的血平板上，在510%CO2環(huán)境中生長。鑒定過程：a DNA酶實驗陽性為布蘭漢氏菌，陰性則為奈瑟氏菌。b 能在普通血平板上生長的為其他奈瑟氏菌，在巧克力平板上生長的主要為腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。c 能使麥芽糖氧化分解產(chǎn)酸的是腦膜炎奈瑟氏菌，不利用麥芽糖的是淋病奈瑟氏菌。幾種主要細菌對葡萄糖麥芽糖蔗糖的氧化分解產(chǎn)酸結(jié)果如下：氧化分解產(chǎn)酸菌種 葡萄糖 麥芽糖 蔗糖淋病奈瑟氏菌 腦膜炎奈瑟氏菌 粘液奈瑟氏菌 卡他布蘭漢菌 DNA酶實驗：a 方法：將待鑒定細菌點種于含0.2%DNA的DNA瓊脂平板上，培養(yǎng)后用1mmol/LHCl覆蓋平板，菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)者為陽性。b 原理：某些細菌能產(chǎn)生DNA酶，可使DNA長鏈水解成由幾個單核苷酸組成的寡核苷酸鏈；長鏈DNA可被酸沉淀，而水解后形成后的寡核苷酸鏈則可溶于酸，故在DNA瓊脂平板加鹽酸，可在菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。（腸桿菌科中只有沙雷氏菌和變形桿菌可產(chǎn)生DNA酶，陽性球菌中只有金葡菌能產(chǎn)生DNA酶。）六腸桿菌科腸桿菌科是一大群生物學(xué)性狀相似的革蘭陰性桿菌，其中對人致病性較強的鼠疫耶爾森菌（現(xiàn)已基本沒有流行）和傷寒沙門菌；4類常引起腹瀉和腸道感染的細菌（埃希氏菌志賀氏菌沙門氏菌耶爾森氏菌）和8種常導(dǎo)致院內(nèi)感染的細菌（枸櫞酸桿菌屬克雷伯菌屬腸桿菌屬多源菌屬沙雷菌屬變形桿菌屬普羅威登菌屬和摩根菌屬）。另外還有很多細菌是腸道的正常菌群，但在一定條件下也可致?。l件致病菌）。實驗過程中對于革蘭陰性桿菌首先要做氧化酶實驗，陰性為腸桿菌科細菌；陽性的為非發(fā)酵菌（我們實驗室還沒有簡單的系統(tǒng)鑒定方法，一般要儀器上卡檢測）或弧菌科細菌。1 腸桿菌科的系統(tǒng)生化KIA試驗（克氏雙糖鐵）組成：乳糖葡萄糖=101（斜面高層，其長度最好是都是2CM）結(jié)果判斷：斜面或高層變黃色：陽性；不變色（紅色）：陰性高層中出現(xiàn)裂隙：產(chǎn)氣陽性高層中出現(xiàn)黑色（FeS）：產(chǎn)H2S陽性苯丙氨酸脫羧酶試驗細菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫羧酶使苯丙氨酸氧化脫羧后生成苯丙酮酸，再與10%的FeCl3試劑產(chǎn)成深綠色反應(yīng)。（變形桿菌屬普羅威登菌屬和摩根菌屬為陽性，其他為陰性）枸櫞酸鹽試驗（碳源利用實驗）在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基中細菌能利用的碳源只有枸櫞酸鹽，分解后生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性，pH指示劑溴麝香草酚藍由淡綠色變?yōu)樯钐m色，即為枸櫞酸鹽試驗陽性。（埃希氏菌屬，志賀氏菌屬，愛德華菌屬為陰性，其他為陽性）注意：接種時不能被糖，蛋白胨污染，要單獨接種）甲基紅（MR）試驗細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑由桔黃色變桔紅色為弱陽性；變紅色為陽性。培養(yǎng)基成分：葡萄糖蛋白胨水試劑：甲基紅0.1g，酒精300ml，水200ml主要用于大腸埃希菌（）和產(chǎn)氣腸桿菌（）的鑒別；常與V-P實驗聯(lián)合使用，一般情況下兩者結(jié)果正好相反，但也有例外如奇變兩者同為陽性。MIU（動力靛基質(zhì)尿素）試驗動力：在半固體培養(yǎng)基中穿刺接種細菌培養(yǎng)后，若穿刺線周圍有細菌擴散生長，則為動力（）；清晰則為動力（）。靛基質(zhì)試驗（吲哚試驗）：某些細菌有色氨酸酶，能分解培養(yǎng)基中的色氨酸生成吲哚。吲哚再與試劑對位二氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而呈紅色。尿素試驗：某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基變堿，再使培養(yǎng)基中的指示劑（0.4%酚紅）變紅色即為陽性。硝酸鹽還原試驗NO3NO2（大腸）NO3NH4NO3N2（沙雷氏菌屬）試劑甲：對氨基苯磺酸試劑乙：-萘胺觀察結(jié)果時甲液和乙液要等量加入，立即或10min內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性。若不變色，則要加入鋅粉：變紅色，說明硝還試驗為真陰性仍不變色，說明硝還試驗真陽性，但原先還原產(chǎn)物不是NO2。陰性結(jié)果出現(xiàn)時有三種可能：細菌不能還原硝酸鹽亞硝酸鹽繼續(xù)分解生成氨或氮培養(yǎng)基不適合細菌生長腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。氨基酸脫羧試驗細菌產(chǎn)生脫羧酶分解氨基酸使其脫羧生成胺和CO2，雖然各種細菌所產(chǎn)生的脫羧酶不一定相同，但最后都能生成胺（賴氨酸尸胺，鳥氨酸腐胺，精氨酸精胺）和CO2。然后胺能使培養(yǎng)基變堿性，通過指示劑（溴甲酚紫）由黃變紫即為陽性。對照管（無氨基酸）為黃色。注意：微量管接種好后要加石蠟，使培養(yǎng)基造成厭氧環(huán)境。（生成的胺更穩(wěn)定，還能誘導(dǎo)氨基酸脫羧酶的產(chǎn)生）對照管如果不顯黃色，則結(jié)果不能判斷。應(yīng)用：除傷寒沙門氏菌，雞沙門氏菌外，其他沙門氏菌鳥AA，賴AA均為陽性；除宋氏和鮑氏志賀菌外其他志賀菌也菌為陽性。葡萄糖酸鹽試驗微量管在培養(yǎng)1824h后，加班氏試劑，水浴煮沸10min，由蘭色變黃綠色到磚紅色即為陽性，不變?yōu)殛幮浴? 腸桿菌的鑒定流程根據(jù)苯丙氨酸脫羧酶實驗：（）：變形桿菌屬，普羅威登斯菌屬，摩根氏菌屬（）：埃希氏菌屬，志賀氏菌屬，沙門氏菌屬，枸櫞酸桿菌屬，愛德華菌屬；克雷伯菌屬，腸桿菌屬，沙雷氏菌屬，哈夫尼亞菌屬。苯丙氨酸脫羧酶實驗陰性，加做葡萄糖酸鹽實驗（）：克雷伯菌屬，腸桿菌屬，沙雷氏菌屬，哈夫尼亞菌屬a 動力（）：克雷伯菌屬，屬內(nèi)種的鑒定主要根據(jù)吲哚試驗（肺克吲哚實驗陰性，三個亞種鑒別試驗IMViC：肺炎，臭鼻d，鼻硬結(jié)）b 動力（），DNA酶（）：沙雷氏菌屬動力（），DNA酶（），枸櫞酸鹽（）：腸桿菌屬（主要是陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者賴氨酸陰性，而后中為陽性）動力（），DNA酶（），枸櫞酸鹽（）：哈夫尼亞菌屬（）：加做IMViC（靛基質(zhì)-甲基紅-VP-枸櫞酸鹽）試驗a IMViC（）：大腸埃希菌（H2S）或愛德華菌屬（H2S）。b IMViC（）：枸櫞酸桿菌屬苯丙氨酸脫羧酶實驗陽性，根據(jù)產(chǎn)H2S可分（）：變形桿菌屬屬內(nèi)主要鑒定試驗如下普變 奇變 產(chǎn)粘變 潘尼氏尿素酶 鳥氨酸 靛基質(zhì) 麥芽糖 木 糖 （）：普羅威登氏菌屬，摩根氏菌屬普羅威登氏菌屬：鳥氨酸：；枸櫞酸鹽：（屬內(nèi)鑒定尿素酶及一些碳水化合物的產(chǎn)酸試驗，如甘露醇阿拉伯糖海藻糖等）摩根氏菌屬：鳥氨酸：；枸櫞酸鹽：（只有一個種：摩氏摩根氏菌）志賀氏菌屬和沙門氏菌屬這兩種菌屬在腸道選擇性培養(yǎng)基（SS、麥康凱）形成不發(fā)酵乳糖的透明或半透明的無色菌落，但一些沙門氏能產(chǎn)H2S就會形成中心黑色的菌落，鑒定時在選擇性培養(yǎng)基上挑選可疑菌落進行鑒定。a志賀氏菌屬主要系統(tǒng)生化：KIA：K/A（只有福氏6型能產(chǎn)氣），H2S（）；MIU：+/-；苯丙：；枸櫞酸鹽：。報告結(jié)果時要根據(jù)其血清學(xué)的結(jié)果鑒定到種，即A群（痢疾志賀氏菌）B群（福氏志賀氏菌）C群（鮑氏志賀氏菌）D群（宋氏志賀氏菌）；我國主要以B群和D群為主。b沙門氏菌屬主要系統(tǒng)生化：KIA：K/AG，H2S（+/）；MIU：；苯丙：；枸櫞酸鹽：。傷寒沙門氏菌的抗原結(jié)構(gòu)：菌體抗原（O抗原），鞭毛抗原（H抗原），包膜抗原（主要是Vi抗原）根據(jù)系統(tǒng)生化鑒定到沙門氏菌屬后，在根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)的特點，用血清學(xué)凝集分到種即可報告結(jié)果。血清凝集步驟如下：A-F多價O（）：O2，Ha（）：A群（甲型副傷寒沙門氏菌）O4，Hb（）：B群（乙型副傷寒沙門氏菌）O67，Hc，Vi（）：C群（丙型副傷寒沙門氏菌）O9，Hd，Vi（）：D群（傷