《酶分子的修飾》PPT課件.ppt

第五章酶分子修飾,定義:通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，進(jìn)而改變酶的某些功能和特性的技術(shù)。,酶分子,非必需基團(tuán),必需基團(tuán),活性中心必需基團(tuán),活性中心外必需基團(tuán),結(jié)合基團(tuán),催化基團(tuán),非活性中心,活性中心,一、酶分子修飾的目的,(1)提高酶活力：酶蛋白與大分子修飾劑交聯(lián)后，修飾劑產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力可能有效阻擋抑制劑對(duì)酶的進(jìn)攻，同時(shí)“遮蓋”保護(hù)了酶活性部位，使抑制劑和酶活性部位結(jié)合的難度增加。,(2)增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性：許多修飾劑分子存在多個(gè)活性反應(yīng)基團(tuán)，常?？梢耘c酶形成多點(diǎn)交聯(lián)，使酶分子的天然構(gòu)象不容易伸展打開(kāi)，同時(shí)減小酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動(dòng)，增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。,一、酶分子修飾的目的,(3)降低或消除酶的抗原性：酶分子結(jié)構(gòu)上有一些aa殘基組成的抗原決定簇，進(jìn)入機(jī)體后，就會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生抗體，使酶失活，通過(guò)酶的修飾，有些組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑形成了共價(jià)鍵，破壞酶分子上的抗原決定簇結(jié)構(gòu)，使酶的抗原性降低甚至消失。,(4)探索酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系：通過(guò)酶分子修飾，研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響，探討酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。,二、選擇酶分子修飾劑特性：,(3)被標(biāo)記的殘基在肽中穩(wěn)定，容易通過(guò)降解分離出來(lái)并鑒定。,(4)反應(yīng)程度能用簡(jiǎn)單的技術(shù)測(cè)定,(1)能選擇性地與一個(gè)aa殘基反應(yīng)。,(2)反應(yīng)在保證酶蛋白不變性的條件下進(jìn)行。,修飾劑的要求：相對(duì)分子量較大；生物相容性和水溶性好；表面反應(yīng)活性基團(tuán)較多；修飾后酶活的半衰期較長(zhǎng)；,三、選擇反應(yīng)條件,修飾反應(yīng)總是盡可能在酶穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，盡量少破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，反應(yīng)的最終結(jié)果是要得到酶和修飾劑的高結(jié)合率及高酶活回收率。,pH是最重要的,增加pH提高反應(yīng)速率,降低pH減小反應(yīng)速率,反應(yīng)活性高的修飾劑pH在生理狀態(tài)下,反應(yīng)活性較低的修飾劑需要較高的pH,酶的化學(xué)修飾,酶分子內(nèi)部修飾,金屬離子置換修飾,大分子結(jié)合修飾,酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾,氨基酸置換修飾,肽鏈有限水解修飾,物理修飾,核酶的修飾,核苷酸鏈剪切修飾,核苷酸置換修飾,酶的化學(xué)修飾,酶分子內(nèi)部修飾,金屬離子置換修飾,大分子結(jié)合修飾,酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾,氨基酸置換修飾,肽鏈有限水解修飾,物理修飾,核酶的修飾,核苷酸鏈剪切修飾,核苷酸置換修飾,第一節(jié)金屬離子置換修飾,一、定義：把酶分子中的金屬離子換成另外一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。,用于修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子：如Ca2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Co2+等,二、作用范圍含有金屬離子的酶金屬酶特點(diǎn)：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對(duì)酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會(huì)失活，重新加入原離子則酶復(fù)活。（2）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)不同特性。,三、金屬離子置換修飾的過(guò)程,1、酶的分離純化,2、除去原有的金屬離子,3、加入置換離子,將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過(guò)分離純化，除去雜質(zhì)，獲得一定純度的酶液。,在純化后的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如EDTA等，使酶分子中的金屬離子與EDTA形成螯合物，通過(guò)透析、超濾、分子篩層析等方法，將螯合物從酶液中除去，此時(shí)的酶液呈無(wú)活性狀態(tài)。,加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合后，除去多余的置換離子。,三、金屬離子置換修飾酶的作用,1、闡明金屬離子對(duì)酶催化作用的影響：了解各種金屬離子在酶催化過(guò)程中的作用，從而有利于闡明酶的催化作用機(jī)制。,2、提高酶活力：一般淀粉酶是雜離子型，即分子中大多數(shù)含有Ca2+，有些分子中則含有Zn2+、Mg2+或其他離子，如果將其他雜離子都換成Ca2+，則可以提高酶活力，并顯著提高酶的穩(wěn)定性。,三、金屬離子置換修飾酶的作用,3、提高酶的穩(wěn)定性,4、改變酶的動(dòng)力學(xué)特性：Km、Vm、pH、溫度等。,第二節(jié)大分子結(jié)合修飾,一、定義：利用水溶性的大分子與酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法。,目前應(yīng)用最廣泛的酶分子修飾方法,二.修飾劑：要求：具有較大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。這樣，經(jīng)修飾的酶，其半衰期較長(zhǎng)，活力回收較高。聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。,HOCH2CH2OCH2CH2OHn,(1)PEG分子量為1000一10000的修飾效果較好，用甲氧基PEG效果更好。,(2)溶解度高，溶于水，也溶于有機(jī)溶劑，沒(méi)有抗原性，也沒(méi)有毒性，生物相容性好。,聚乙二醇,三、修飾：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合。,1、修飾劑的活化以PEG為例，PEG的羥基被活化，與酶的N端氨基結(jié)合（Lys殘基的側(cè)鏈氨基）,（1）三氯均嗪法PEG經(jīng)三氯均嗪活化后，用石油醚抽提或減壓蒸餾，制得活化PEG，后者與酶交聯(lián)，制得修飾酶：,（2）琥珀酸酐法常用二溴代琥珀酸酐在溫和的堿性條件下將PEG活化，經(jīng)減壓濃縮制得活化PEG，活化PEG與酶分子上氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而得修飾酶：,（3）重氮法是將PEG末端羥基轉(zhuǎn)化為重氮基團(tuán)，再在弱堿性條件下與酶分子的酚基、咪唑基等反應(yīng)，而生成修飾酶。主要反應(yīng)有以下三種。對(duì)硝基芐基氯活化法。,N羧甲氨基苯甲酐活化法,4氟2硝基重氮物活化法,2、修飾：活化后的大分子修飾劑與經(jīng)分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)，使兩者以共價(jià)鍵結(jié)合。3、分離：通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開(kāi)，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。,右旋糖苷（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷,四、大分子結(jié)合修飾的作用,1、提高酶活力：一分子RNA酶+6.5分子右旋糖苷酶活提高為原來(lái)的2.25倍。一分子胰凝乳蛋白酶+11分子右旋糖苷酶活提高原來(lái)的5.1倍。一分子胰蛋白酶+11分子右旋糖苷酶活提高0.30倍,2、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性,水溶性的大分子與酶分子共價(jià)結(jié)合進(jìn)行酶分子修飾，可在酶分子外圍形成保護(hù)層，起到保護(hù)酶的空間構(gòu)象的作用，增加酶的穩(wěn)定性。,水溶性大分子結(jié)合法修飾SOD可使其在體內(nèi)的穩(wěn)定性提高,半衰期延長(zhǎng)70300倍如：半衰期相對(duì)穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖苷-SOD7h70Ficoll(低分子量)-SOD14h140Ficoll(高分子量)-SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350,3、改變酶的抗原性,通過(guò)大分子結(jié)合修飾，使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低或消除酶的抗原性，可以保持酶的催化功能。如：精氨酸酶經(jīng)PEG結(jié)合修飾后，其抗原性顯著降低。色氨酸酶經(jīng)PEG修飾后可完全消除其抗原性。L-天門冬酰胺酶經(jīng)PEG結(jié)合修飾其抗原性完全消除。,a.抗原：能引起體內(nèi)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)b.抗體：當(dāng)外源蛋白非經(jīng)口進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)后，體內(nèi)血清就可能出現(xiàn)與此外源蛋白特異結(jié)合的物質(zhì)酶對(duì)人體是一種外源蛋白，當(dāng)經(jīng)注射進(jìn)入人體后會(huì)成為抗原，刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗體。當(dāng)這種酶再次進(jìn)入體內(nèi)，抗體就會(huì)與作為抗原的酶特異結(jié)合，而使酶失去催化能力。,抗體與抗原間特異結(jié)合是由于它們之間特定分子結(jié)構(gòu)引起的。用酶分子修飾法使酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生改變，抗體、抗原就不再特異結(jié)合，可能降低或消除其抗原性。利用水溶性大分子對(duì)酶進(jìn)行修飾可降低或消除酶的抗原性。,第三節(jié)酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾,一、定義：采用一定方法使酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能。,側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基、吲哚基。,側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。,根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類：,1.帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：賴氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),組氨酸(Histidine,His,H),2.帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E),3.無(wú)電荷的極性R基氨基酸（共7種）：絲氨酸(Serine,Ser,S),蘇氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q),4.非極性R基氨基酸（共8種）：丙氨酸(Alanine,Ala,A),亮氨酸(Leucine,Leu,L),纈氨酸(Valine,Val,V),異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸(Methionine,Met,M),脯氨酸(Proline,Pro,P),這些基團(tuán)可以組成各種副鍵，對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定起著重要作用。如果這些基團(tuán)發(fā)生改變，就會(huì)引起副鍵的改變，使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起酶的特性和功能的改變。,酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾，可以研究各種基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響.并可以用于研究酶的活性中心的必需基團(tuán)。如果某一基團(tuán)修飾后不引起酶活力的顯著變化，則可以認(rèn)為這個(gè)基團(tuán)屬于非必需基團(tuán)；如果某一基團(tuán)修飾后引起酶活力的顯著變化，則可以認(rèn)為這個(gè)基團(tuán)可能是酶催化的必需基團(tuán)。,一、氨基修飾,來(lái)源：Lys,Arg,His,Gln修飾反應(yīng)：?；c烷基化修飾劑:三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）、2，4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、2，4，6三硝基苯磺酸、亞硝酸等,乙酸酐修飾,2，4，6三硝基苯磺酸修飾,2，4二硝基氟苯修飾(Sanger反應(yīng)),氨基的烷基化。這類試劑包括鹵代乙酸、芳香鹵和芳香磺酸等。,丹磺酰氯(DNS)修飾。,苯異硫氰酸酯(PITC)修飾(即Edman反應(yīng)),二、羧基的化學(xué)修飾修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。可定量測(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目。+水溶性碳化二亞胺,三、巰基的化學(xué)修飾來(lái)源：Cys修飾反應(yīng):烷基化修飾劑：碘乙酸(IAA)碘乙酰胺(IAM)E-SH+R-XE-SR+HXN-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑）ESH,四、咪唑基的化學(xué)修飾來(lái)源：His修飾反應(yīng):酰基化與烷基化?；揎梽?常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）+C2H5OH+CO2烷基化修飾劑：碘乙酸,+ICH2COOH+HI,五、吲哚基的化學(xué)修飾來(lái)源：Trp修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)修飾劑：N-溴代琥珀酰亞胺,各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑,但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋喝魏我环N修飾劑不是絕對(duì)專一的。有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化失活，不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。,六、交聯(lián)修飾用雙功能基團(tuán)試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。,戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。,第四節(jié)氨基酸置換修飾,一、定義：將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。,aa是酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。,二、aa置換修飾酶的作用,2、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性,1、提高酶活力,3、使酶的專一性發(fā)生改變：,酪氨酰-tRNA合成酶：催化Tyr和所對(duì)應(yīng)的tRNA合成酪氨酰-tRNA。該酶的Thr51若被pro置換，酶對(duì)ATP的親和性提高近100倍，酶活力提高25倍。,T4-溶菌酶：Ile3被Cys置換后，Cys-3可與Cys-97形成二硫鍵，置換后的T4-溶菌酶，其活力保持不變，但該酶的穩(wěn)定性卻大大提高。,枯草桿菌蛋白酶:活性中心上的Ser置換成Ile后，酶對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解活性消失，而出現(xiàn)催化硝基苯酯進(jìn)行水解反應(yīng)的活性。,三、氨基酸置換修飾的方法通過(guò)兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：,化學(xué)修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少。定點(diǎn)突變技術(shù)：利用基因操縱技術(shù)。,定點(diǎn)突變技術(shù)應(yīng)用于酶分子修飾的主要過(guò)程：,（1）新酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì),（2）突變基因堿基序列的確定,（3）突變基因的獲得,（4）新酶的獲得,（1）新酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)出欲獲得的新酶RNA的核苷酸序列或aa序列，確定欲置換的核苷酸或aa及其位置。,（2）突變基因堿基序列的確定：核酸類酶，根據(jù)欲獲得的酶RNA的核苷酸排列次序。蛋白類酶，根據(jù)欲獲得的酶蛋白的aa排列次序。同義密碼子,（3）突變基因的獲得：通過(guò)PCR技術(shù)。用DNA合成儀合成12個(gè)堿基被置換了的寡核苷酸，以寡核苷酸為引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或M13質(zhì)粒等定位突變技術(shù)獲得所需要的大量突變基因（寡核苷酸誘導(dǎo)的定位突變）,（4）新酶的獲得：將PCR獲得的大量突變基因進(jìn)行體外重組，插入到適宜的基因載體中，然后通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因槍、顯微注射等技術(shù)，轉(zhuǎn)入適宜的寄主細(xì)胞中，在適宜的條件下進(jìn)行表達(dá)，就可獲得經(jīng)過(guò)修飾的酶。,例一：酪氨酰-tRNA合成酶催化Tyr和所對(duì)應(yīng)的tRNA合成酪氨酰-tRNA。該酶的Thr51若被pro置換，蘇氨酸密碼子（ACU,ACC,ACA,ACG)，脯氨酸密碼子（CCU,CCC,CCA,CCG)，mRNA上只需將密碼子上的第一個(gè)堿基A換成C，對(duì)應(yīng)的基因只需將T換成G。,第五節(jié)肽鏈有限水解修飾,在肽鏈的限定位點(diǎn)進(jìn)行水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的催化特性的方法。,酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。,對(duì)酶進(jìn)行肽鏈有限水解，通常使用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑。,（蛋白酶修飾，切去六肽）胰蛋白酶原有活力的胰蛋白酶（修飾）天冬氨酸酶使酶活提高4-5倍。（羧基端水解10肽）,除了用專一性的蛋白酶或肽酶外（修飾劑），也可采用其他方法使