微生物活菌計數方法ppt課件

.,微生物活菌平板計數方法和技術,微生物肥料和食用菌菌種質檢中心曹鳳明,.,微生物計數方法種類,直接計數法核酸計數法活菌計數法（培養(yǎng)法）MPN（Most-Probable-Number）最大可能數法混菌法平板技術法,.,直接計數法,1.顯微鏡直接計數比濁法3.電子計數器計數法,.,1.顯微鏡直接計數顯微計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液血球計數板：菌體較大的酵母菌或霉菌孢子細菌計數板：一般細菌用途：快速了解發(fā)酵液的菌數。常用于生產線上生產過程控制。缺點：不易區(qū)分顆粒、死菌體和雜菌，計數與真實菌數有很大差異。不能作為正規(guī)計數方法。,.,2.比濁法根據菌懸液的透光量間接地測定細菌的數量。細菌懸浮液的濃度在一定范圍內與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。根據濁度計算出細菌的數量。該方法一般可以估計出細菌的數量級。經常用于一些特殊的微生物的快速計數，如光合細菌和藻類的測數。但是由于該方法僅能估測菌數，不能準確定量，而且由于一些顆粒和添加劑的作用，不能正確反映該樣品的質量，所以在質檢過程中不予采用。,.,3.電子計數器計數法工作原理是測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過一個細胞，當一個細胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄裝置上。該法測定結果較準確，但它只識別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。不適于微生物肥料產品的檢測。,.,核酸計數法,每一種生物都有一套自己獨有的遺傳物質，脫氧核糖核酸和核糖核酸，即DNA和RNA。隨著核酸分析技術的發(fā)展，已經能夠利用遺傳物質對生物進行定性和定量的測定，而且更為靈敏、迅速、專一性強。常用的方法：熒光定量PCR此法操作精細繁瑣，藥品昂貴，而且經常受到死菌體的干擾。暫時不能成為微生物肥料活菌計數的常用方法，,.,活菌計數法（培養(yǎng)法）,MPN（Most-Probable-Number）最大可能數法（主要用于光合細菌和（糞）大腸菌群的測定）混菌法（適用于兼性厭氧微生物的測定）取1.0mL不同稀釋度菌懸液于滅菌平皿內，將冷卻至50左右的1520mL培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內輕輕混勻，培養(yǎng)計數。（食品中乳酸菌總菌數的測定）平板計數法（最常用的方法）,.,平板計數法,使不可見的微生物在人工培養(yǎng)基平板上生長成為可見的菌落（CFU），從而可用肉眼進行觀察、計數。較其他方法直觀準確，是一種經典的檢測活菌數的方法，也是目前國際上通用的方法。制備一定體積的菌懸液，作一系列的倍數稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據培養(yǎng)出的菌落數，計算出樣品中的活菌數。,.,平板計數法示意圖,.,.,平板計數的優(yōu)缺點優(yōu)點：直觀、準確、可靠該方法不僅可以檢測到樣品中的有效活菌數，而且可以檢測到產品的微生物污染情況，即雜菌數。缺點：由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的局限性，所得的結果一般低于實際值。,.,平板計數法,（一）檢測前的準備（二）操作過程（母液制備、系列稀釋、加樣、涂布、培養(yǎng)、菌落識別、計數）（三）計算,.,（一）檢測前的準備,根據菌種的特性選擇方法天平，搖床，酒精燈，培養(yǎng)箱，染色液，顯微鏡，滅菌鍋，烘箱等無菌間或潔凈工作臺消毒吸管、刮刀、培養(yǎng)皿的洗滌、包扎、滅菌制樣和稀釋用三角瓶水制備、滅菌培養(yǎng)基制備和平板制備,.,培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基定義指人工方法配合而成的，專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用的混合營養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基的選擇需要了解目的微生物的基本特性，選擇正確的培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備程序按微生物肥料實驗用培養(yǎng)基技術條件規(guī)定執(zhí)行，NY/T1114-2006培養(yǎng)基標識清晰，培養(yǎng)基名稱，配制日期等。,檢測前的準備,.,平板制備,滅好菌的培養(yǎng)基冷卻至50左右（以不燙手為宜），在無菌狀態(tài)下傾注培養(yǎng)基。傾倒平板前應將培養(yǎng)基搖勻，防止在瓶底有沉淀。但是搖動時要防止產生大量氣泡。通常條件下平板制備好后室溫放置或溫箱放置23天使用，目的：一可以檢查培養(yǎng)基是否滅菌徹底，是否在傾倒過程被微生物污染；二為了使平板表面干濕適宜，防止菌落由于平板上的水滴運動而連片以致無法計數。,檢測前的準備,.,（二）操作過程,2.1母液制備2.2系列稀釋、加樣和涂布2.3培養(yǎng)2.4識別和計數,.,2.1母液（基礎液）的制備,樣品混合均勻：很重要固體樣品：稱取10g左右樣品加入到100mL無菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。液體樣品：量取10.0ml樣品加入到90mL無菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。分散菌體：將三角瓶置于搖床上200r/min振蕩30min，即成母液菌懸液。,.,2.2樣品稀釋、加樣和涂布,準備工作：應將平板上做好標記，包括培養(yǎng)基種類，樣品編號，稀釋度/稀釋倍數.將小瓶無菌水寫好樣品編號、稀釋度/稀釋倍數具體過程見GB20287-2006農用微生物菌劑,.,2.2.1系列稀釋用無菌吸管分別吸取5.0mL上述母液菌懸液加至45mL無菌水（150mL三角瓶）中，按1:10(10倍)進行依次稀釋，分別得到10-1，10-2，10-3，10-4等濃度的菌懸液（每個稀釋度應更換無菌吸管）注：稀釋度：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5相當于稀釋倍數：101，102，103，104，105,.,2.2.2加樣和涂布,每個樣品取3個連續(xù)適宜稀釋度，用0.5mL無菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1mL，加至預先制好的固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將不同稀釋度的菌懸液均勻地涂于平板表面。每一稀釋度每種培養(yǎng)基做3個重復，同時以無菌水作空白對照。,.,.,稀釋、加樣和涂布注意事項,整個程序應在無菌間或超凈臺內進行，操作人員時刻有無菌概念適宜稀釋度：根據標準或企業(yè)提供的信息選擇稀釋度。系列稀釋時不同的稀釋度應更換吸管（移液管），加樣和涂布不同稀釋度時也要更換吸管和刮刀。每個培養(yǎng)皿均要標明培養(yǎng)基種類、樣品編號、稀釋度稀釋和加樣要準確，涂布均勻及時，使用的吸管量程要適宜。無菌水對照，以檢查吸管、刮刀以及稀釋用水滅菌是否徹底、操作過程是否合乎無菌要求。,.,2.3平板的培養(yǎng),將涂布好平板放在適宜的條件下培養(yǎng)如：溫度條件氣體條件培養(yǎng)時間平板倒置培養(yǎng),.,2.4菌落識別和計數,通過菌落識別、涂片染色、鏡檢觀察，確定有效菌。（必要時做生化實驗）選擇性培養(yǎng)基上長出的菌落并非都是有效菌，培養(yǎng)基的選擇性是相對的。一種有效菌只在一種特定培養(yǎng)基上計數，不同培養(yǎng)基上同一種有效菌不能累加。細菌雜菌（包括放線菌）在培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基上計數；霉菌和真菌雜菌在真菌培養(yǎng)基上計數。但也不能重復計數。,.,（三）計算,3.1有效稀釋度的選擇3.2標準差3.3計算公式及示例,.,3.1有效稀釋度的選擇,參見標準GB20287-2006的6.3.2.4示例：（表格）,.,計數原則以出現20300個細菌菌落數的稀釋度的平板為計數標準，絲狀真菌為10150個菌落數。當只有一個稀釋度，其平均菌落數在20300之間時，則以平均菌落數計算。若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在20300之間時，應按兩者菌落總數之比值決定：若其比值小于等于2應計算兩者的平均數；若大于2則以稀釋倍數小的菌落平均數計算。,.,.,3.2標準差,標準差(StandardDeviation)：各數據偏離平均數的距離（離均差）的平均數，它是離差平方和平均后的方根。用表示。標準差體現隨機變量取值與其期望值的偏差。標準NY411-2000固氮菌肥料的7.2.6.2。,.,平板上菌落數對應的標準差要求,.,標準差分析（例子）,.,3.3有效活菌數和雜菌的計算,.,示例,樣品編號：A樣品狀態(tài)：顆粒執(zhí)行標準：GB20287-2006菌種名稱：巨大芽孢桿菌稱樣量：10.10g,.,.,.,.,.,.,有效活