微生物活菌計(jì)數(shù)方法ppt課件

.,微生物活菌平板計(jì)數(shù)方法和技術(shù),微生物肥料和食用菌菌種質(zhì)檢中心曹鳳明,.,微生物計(jì)數(shù)方法種類,直接計(jì)數(shù)法核酸計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)法（培養(yǎng)法）MPN（Most-Probable-Number）最大可能數(shù)法混菌法平板技術(shù)法,.,直接計(jì)數(shù)法,1.顯微鏡直接計(jì)數(shù)比濁法3.電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法,.,1.顯微鏡直接計(jì)數(shù)顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液血球計(jì)數(shù)板：菌體較大的酵母菌或霉菌孢子細(xì)菌計(jì)數(shù)板：一般細(xì)菌用途：快速了解發(fā)酵液的菌數(shù)。常用于生產(chǎn)線上生產(chǎn)過程控制。缺點(diǎn)：不易區(qū)分顆粒、死菌體和雜菌，計(jì)數(shù)與真實(shí)菌數(shù)有很大差異。不能作為正規(guī)計(jì)數(shù)方法。,.,2.比濁法根據(jù)菌懸液的透光量間接地測定細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計(jì)測定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。根據(jù)濁度計(jì)算出細(xì)菌的數(shù)量。該方法一般可以估計(jì)出細(xì)菌的數(shù)量級。經(jīng)常用于一些特殊的微生物的快速計(jì)數(shù)，如光合細(xì)菌和藻類的測數(shù)。但是由于該方法僅能估測菌數(shù)，不能準(zhǔn)確定量，而且由于一些顆粒和添加劑的作用，不能正確反映該樣品的質(zhì)量，所以在質(zhì)檢過程中不予采用。,.,3.電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法工作原理是測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過一個(gè)細(xì)胞，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞通過這個(gè)小孔時(shí)，電阻明顯增加，形成一個(gè)脈沖，自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上。該法測定結(jié)果較準(zhǔn)確，但它只識(shí)別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細(xì)菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。不適于微生物肥料產(chǎn)品的檢測。,.,核酸計(jì)數(shù)法,每一種生物都有一套自己獨(dú)有的遺傳物質(zhì)，脫氧核糖核酸和核糖核酸，即DNA和RNA。隨著核酸分析技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)能夠利用遺傳物質(zhì)對生物進(jìn)行定性和定量的測定，而且更為靈敏、迅速、專一性強(qiáng)。常用的方法：熒光定量PCR此法操作精細(xì)繁瑣，藥品昂貴，而且經(jīng)常受到死菌體的干擾。暫時(shí)不能成為微生物肥料活菌計(jì)數(shù)的常用方法，,.,活菌計(jì)數(shù)法（培養(yǎng)法）,MPN（Most-Probable-Number）最大可能數(shù)法（主要用于光合細(xì)菌和（糞）大腸菌群的測定）混菌法（適用于兼性厭氧微生物的測定）取1.0mL不同稀釋度菌懸液于滅菌平皿內(nèi)，將冷卻至50左右的1520mL培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)輕輕混勻，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（食品中乳酸菌總菌數(shù)的測定）平板計(jì)數(shù)法（最常用的方法）,.,平板計(jì)數(shù)法,使不可見的微生物在人工培養(yǎng)基平板上生長成為可見的菌落（CFU），從而可用肉眼進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)。較其他方法直觀準(zhǔn)確，是一種經(jīng)典的檢測活菌數(shù)的方法，也是目前國際上通用的方法。制備一定體積的菌懸液，作一系列的倍數(shù)稀釋，然后將定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，計(jì)算出樣品中的活菌數(shù)。,.,平板計(jì)數(shù)法示意圖,.,.,平板計(jì)數(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：直觀、準(zhǔn)確、可靠該方法不僅可以檢測到樣品中的有效活菌數(shù)，而且可以檢測到產(chǎn)品的微生物污染情況，即雜菌數(shù)。缺點(diǎn)：由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的局限性，所得的結(jié)果一般低于實(shí)際值。,.,平板計(jì)數(shù)法,（一）檢測前的準(zhǔn)備（二）操作過程（母液制備、系列稀釋、加樣、涂布、培養(yǎng)、菌落識(shí)別、計(jì)數(shù)）（三）計(jì)算,.,（一）檢測前的準(zhǔn)備,根據(jù)菌種的特性選擇方法天平，搖床，酒精燈，培養(yǎng)箱，染色液，顯微鏡，滅菌鍋，烘箱等無菌間或潔凈工作臺(tái)消毒吸管、刮刀、培養(yǎng)皿的洗滌、包扎、滅菌制樣和稀釋用三角瓶水制備、滅菌培養(yǎng)基制備和平板制備,.,培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基定義指人工方法配合而成的，專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用的混合營養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基的選擇需要了解目的微生物的基本特性，選擇正確的培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備程序按微生物肥料實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基技術(shù)條件規(guī)定執(zhí)行，NY/T1114-2006培養(yǎng)基標(biāo)識(shí)清晰，培養(yǎng)基名稱，配制日期等。,檢測前的準(zhǔn)備,.,平板制備,滅好菌的培養(yǎng)基冷卻至50左右（以不燙手為宜），在無菌狀態(tài)下傾注培養(yǎng)基。傾倒平板前應(yīng)將培養(yǎng)基搖勻，防止在瓶底有沉淀。但是搖動(dòng)時(shí)要防止產(chǎn)生大量氣泡。通常條件下平板制備好后室溫放置或溫箱放置23天使用，目的：一可以檢查培養(yǎng)基是否滅菌徹底，是否在傾倒過程被微生物污染；二為了使平板表面干濕適宜，防止菌落由于平板上的水滴運(yùn)動(dòng)而連片以致無法計(jì)數(shù)。,檢測前的準(zhǔn)備,.,（二）操作過程,2.1母液制備2.2系列稀釋、加樣和涂布2.3培養(yǎng)2.4識(shí)別和計(jì)數(shù),.,2.1母液（基礎(chǔ)液）的制備,樣品混合均勻：很重要固體樣品：稱取10g左右樣品加入到100mL無菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。液體樣品：量取10.0ml樣品加入到90mL無菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。分散菌體：將三角瓶置于搖床上200r/min振蕩30min，即成母液菌懸液。,.,2.2樣品稀釋、加樣和涂布,準(zhǔn)備工作：應(yīng)將平板上做好標(biāo)記，包括培養(yǎng)基種類，樣品編號，稀釋度/稀釋倍數(shù).將小瓶無菌水寫好樣品編號、稀釋度/稀釋倍數(shù)具體過程見GB20287-2006農(nóng)用微生物菌劑,.,2.2.1系列稀釋用無菌吸管分別吸取5.0mL上述母液菌懸液加至45mL無菌水（150mL三角瓶）中，按1:10(10倍)進(jìn)行依次稀釋，分別得到10-1，10-2，10-3，10-4等濃度的菌懸液（每個(gè)稀釋度應(yīng)更換無菌吸管）注：稀釋度：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5相當(dāng)于稀釋倍數(shù)：101，102，103，104，105,.,2.2.2加樣和涂布,每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，用0.5mL無菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1mL，加至預(yù)先制好的固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將不同稀釋度的菌懸液均勻地涂于平板表面。每一稀釋度每種培養(yǎng)基做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以無菌水作空白對照。,.,.,稀釋、加樣和涂布注意事項(xiàng),整個(gè)程序應(yīng)在無菌間或超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作人員時(shí)刻有無菌概念適宜稀釋度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)或企業(yè)提供的信息選擇稀釋度。系列稀釋時(shí)不同的稀釋度應(yīng)更換吸管（移液管），加樣和涂布不同稀釋度時(shí)也要更換吸管和刮刀。每個(gè)培養(yǎng)皿均要標(biāo)明培養(yǎng)基種類、樣品編號、稀釋度稀釋和加樣要準(zhǔn)確，涂布均勻及時(shí)，使用的吸管量程要適宜。無菌水對照，以檢查吸管、刮刀以及稀釋用水滅菌是否徹底、操作過程是否合乎無菌要求。,.,2.3平板的培養(yǎng),將涂布好平板放在適宜的條件下培養(yǎng)如：溫度條件氣體條件培養(yǎng)時(shí)間平板倒置培養(yǎng),.,2.4菌落識(shí)別和計(jì)數(shù),通過菌落識(shí)別、涂片染色、鏡檢觀察，確定有效菌。（必要時(shí)做生化實(shí)驗(yàn)）選擇性培養(yǎng)基上長出的菌落并非都是有效菌，培養(yǎng)基的選擇性是相對的。一種有效菌只在一種特定培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)，不同培養(yǎng)基上同一種有效菌不能累加。細(xì)菌雜菌（包括放線菌）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)；霉菌和真菌雜菌在真菌培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)。但也不能重復(fù)計(jì)數(shù)。,.,（三）計(jì)算,3.1有效稀釋度的選擇3.2標(biāo)準(zhǔn)差3.3計(jì)算公式及示例,.,3.1有效稀釋度的選擇,參見標(biāo)準(zhǔn)GB20287-2006的6.3.2.4示例：（表格）,.,計(jì)數(shù)原則以出現(xiàn)20300個(gè)細(xì)菌菌落數(shù)的稀釋度的平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，絲狀真菌為10150個(gè)菌落數(shù)。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在20300之間時(shí)，則以平均菌落數(shù)計(jì)算。若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在20300之間時(shí)，應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值決定：若其比值小于等于2應(yīng)計(jì)算兩者的平均數(shù)；若大于2則以稀釋倍數(shù)小的菌落平均數(shù)計(jì)算。,.,.,3.2標(biāo)準(zhǔn)差,標(biāo)準(zhǔn)差(StandardDeviation)：各數(shù)據(jù)偏離平均數(shù)的距離（離均差）的平均數(shù)，它是離差平方和平均后的方根。用表示。標(biāo)準(zhǔn)差體現(xiàn)隨機(jī)變量取值與其期望值的偏差。標(biāo)準(zhǔn)NY411-2000固氮菌肥料的7.2.6.2。,.,平板上菌落數(shù)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差要求,.,標(biāo)準(zhǔn)差分析（例子）,.,3.3有效活菌數(shù)和雜菌的計(jì)算,.,示例,樣品編號：A樣品狀態(tài)：顆粒執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB20287-2006菌種名稱：巨大芽孢桿菌稱樣量：10.10g,.,.,.,.,.,.,有效活