Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量.doc

1、Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量點(diǎn)擊次數(shù)：91 發(fā)布時(shí)間：2010-7-7 11:20:18一、 目的掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法，熟悉 分光光度計(jì) 的操作。二、原理Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin 試劑）還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100 倍，定量范圍為5100g 蛋白質(zhì)。Folin 試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋

2、白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1實(shí)驗(yàn)材料綠豆芽下胚軸（也可用其它材料如面粉）2儀器（1）722 型（或721 型） 分光光度計(jì) （2）4 000r/min 的 離心機(jī) （3） 分析天平 （4） 容量瓶 （50mL）（5） 量筒 （6） 移液管 （0.5mL、1mL、5mL）3試劑（純度均為分析純）（1）0. 5mol/L NaOH（2） 試劑甲：（A）稱取10g Na2CO3，2g NaOH 和0.25g 酒石酸鉀鈉，溶解后用 蒸餾 水定容至500mL。（B）稱取0.5g CuSO45H2O，溶解后用 蒸餾 水定容至100mL。每次使用前將（A）

3、液50 份與（B）液1 份，即為試劑甲，其有效期為1d，過期失效。（3）試劑乙：在1.5L 容積的磨口回流器中加入100g 鎢酸鈉（Na2WO42H2O）和700mL 蒸餾 水，再加50mL 85 磷酸和100mL 濃鹽酸充分混勻，接上回流 冷凝管 ，以小火回流10h?；亓鹘Y(jié)束后，加入150g 硫酸鋰和50mL 蒸餾 水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15min，驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（倘若仍呈綠色，再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)沸騰15min）。然后稀釋至 1L，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存，使用前大約加水1 倍，使最終濃度相當(dāng)于1mol/L。四、操作步驟1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）配制標(biāo)準(zhǔn)牛 血清

4、白蛋白溶液：在 分析天平 上精確稱取0.0250g 結(jié)晶牛 血清 白蛋白，倒入小 燒杯 內(nèi)，用少量 蒸餾 水溶解后轉(zhuǎn)入100mL 容量瓶 中， 燒杯 內(nèi)的殘液用少量 蒸餾 水沖洗數(shù)次，沖洗液一并倒入 容量瓶 中，用 蒸餾 水定容至100mL，則配成250g/mL 的牛 血清 白蛋白溶液。（2）系列標(biāo)準(zhǔn)牛 血清 白蛋白溶液的配制：取6 支普通 試管 ，按表1 加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛 血清 白蛋白溶液和 蒸餾 水，配成一系列不同濃度的牛 血清 白蛋白溶液。然后各加試劑甲5mL，混合后在室溫下放置10min，再各加0.5 試劑乙，立即混合均勻（這一步速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱）。30min 后，以不含

5、蛋白質(zhì)的1 號(hào) 試管 為對(duì)照，用722 型 分光光度計(jì) 于650nm 波長下測定各 試管 中溶液的光密度并記錄結(jié)果。（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以牛 血清 白蛋白含量（g）為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2樣品的提取及測定（1）準(zhǔn)確稱取綠豆芽下胚軸1g，放入 研缽 中，加 蒸餾 水2mL，研磨勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)入 離心管 ，并用 6mL 蒸餾 水分次將 研缽 中的殘?jiān)慈?離心管 ，離心4 000r/min、20min。將上清液轉(zhuǎn)入50mL 容量瓶 中，用 蒸餾 水定容到刻度，作為待測液備用。（2）取普通 試管 2 支，各加入待測溶液1mL，分別加入試劑甲5mL，混勻后放置10min，再各加試劑乙0.5mL，迅速混勻，室溫放置30min，于650nm 波長下測定光密度，并記錄結(jié)果。五、結(jié)果計(jì)算計(jì)算出兩重復(fù)樣品光密度的平均值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量X（g），再按下列公式計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的百分含量。六、附注（1）進(jìn)行測定時(shí)，加Folin 試劑要特別小心，因?yàn)镕olin 試劑僅在酸性pH 條件下穩(wěn)定，但此實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)只是在pH10 的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加試劑乙（Folin 試劑）時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會(huì)使顯色程度減弱。（2）本法也可用于游離酪氨酸和色氨酸含量測定。2除 Folin-酚試劑顯色法以外，紫外吸收法也可以進(jìn)行蛋白質(zhì)