實驗 溶菌酶的粗提取、分離純化及酶活力、純度及分子量測定

1、1,實驗1-3 溶菌酶的提取分離及鑒定（酶活力、純度及分子量測定）,2,實驗內(nèi)容,1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測定 3. 溶菌酶純度鑒定與分子量測定,3,背景知識,溶菌酶（lysozyme）：胞壁質(zhì)酶（muramidase）或n-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（n-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。 生物學(xué)效應(yīng)：主要通過破壞細(xì)胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之間的-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。該酶活性可被一些金屬離子cu2+，fe2+，

2、zn2+以及n-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被mg2+，ca2+、nacl所激活,4,5,溶菌酶理化性質(zhì)：相對分子質(zhì)量14700 da，由129個氨基酸殘基構(gòu)，pi:10.8，最適溫度為50，最適ph為67左右。280nm的消光系數(shù)為13.0,6,背景知識： 酶的提取、分離純化 初步純化（rough fractionation） （提?。喊衙笍纳锝M織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。 高度純化（fine fractionation） （精純化）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。 純化方案評價：酶活力、蛋白濃度、純度,7,粗純化（ 提取）目標(biāo)： a. 將目

3、的酶最大限度地溶解出來。 b. 保持生物活性。 注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活， 一般采用低溫下（010）操作。,提取原則 a. 相似相溶。 b. 遠(yuǎn)離等電點的ph值，溶解度增加。,8,離心分離 （一）基本原理 1. 離心力 fc = m ac m r 2 m r （2 n/60）2 n為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （r/min ）； fc通常以相對離心力rcf（relative centrifugal force）表示，即離心力f的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字g）表示。,rcf = m r （2 n/60）2 /mg= 1.12 10-5 n2 r 此公式描述

4、了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用r平均代替 r平均=1/2（r大+r?。ヽm,9,通常： 低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min。 高速離心（超速），常以相對離心力（rcf）表 示，如：65000g。 兩者可換算或查測算圖。,10,離心機(jī)的種類,11,離心的形式,角式及水平（外擺）式：水平式一般為低速。 角式由低速到超速均有。,12,角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子）,角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。,13,離心管,材質(zhì)：玻璃，塑料 強(qiáng)度：和離心速度相配 大小：和轉(zhuǎn)子配套 高速超速管要加蓋,14,離心機(jī)操作,平衡、定溫、定速、定時。,15,實驗一、 溶菌酶的

5、粗提取略,16,酶精純化常用技術(shù),膜分離技術(shù) 柱層析技術(shù) 蛋白質(zhì)結(jié)晶,17,principles of operation for chromatography techniques,gel filtration,ion exchange,hydrophobic interaction,affinity,reversed phase,18,實驗二、溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測定,目的： 1. 掌握離子交換層析原理及層析操作所需的必須原件。 2. 掌握層析柱填裝方法及層析填料的保存 3. 掌握比色法測定溶菌酶的濃度與酶活,19,原理： 根據(jù)溶菌酶 pi 10.8，ph 8.0 pbs 中

6、攜帶？電，與陰/陽離子層析填料可結(jié)合，通過吸附后，提高ph或離子強(qiáng)度將溶菌酶與其他蛋白進(jìn)行分離達(dá)到純化目的。 溶菌酶對革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的酶解作用導(dǎo)致細(xì)菌完整性破壞，od600值會下降，通過單位時間內(nèi)（每分鐘）od600值的下降評價酶活性。 溶菌酶的活力單位（u）：在室溫，ph8.0的條件下，od600每分鐘降低0.001為1個活力單位。 280nm的消光系數(shù)為13.0，根據(jù) a=ecl 可粗略測定溶菌酶濃度，用于酶比活的評價。,20,離子交換層析 （ion exchange chromatography，iec）,21,2.離子交換填料： 離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。,纖維素 瓊

7、脂糖 葡聚糖 載體 電荷基團(tuán),och2coo-,na+,反離子,1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離 純化方法。,22,離子交換劑,-帶有電荷基團(tuán)的不溶性載體,-o-ch2ch2n-h,ch2ch3,ch2ch3,cl-,載體,diethylaminoethyl (deae),23,兩種離子交換劑,陰離子交換劑： 常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基 陽離子交換劑： 常用羧甲基 cm ch2coo 磺丙基 sp c3h6so3,deae c2h4n+(c2h5)2h qae c2h4n+(c2h5)2ch2ch(oh)ch3,24,化學(xué)原料合成 ： sephadex sepharos

8、e 載體 天然材料制成： cellulose 如：deae-sepharose， cm-sepharose,25,實驗設(shè)計原理,利用不同的蛋白質(zhì)分子在溶液中所帶電荷不同，因而與離子交換劑有不同吸附力而分離。,ph8.0,pi 8.0 蛋白質(zhì)帶正電,pi 8.0 蛋白質(zhì)帶負(fù)電,溶菌酶pi:10.8,26,2. 陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的過程,平衡,吸附,去吸附,分離結(jié)束,再生,+,低鹽,高鹽,利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)洗脫下來,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,cl-,27,3.

9、操作 平衡 上樣 沖洗 洗脫 再生 1）上樣：上樣體積不十分嚴(yán)格。 2）洗脫: 增加溶液的離子強(qiáng)度 梯度洗脫法 （連續(xù)、不連續(xù)）改變?nèi)芤旱膒h值 3）再生：0.5-1mol/l nacl溶液處理。 4.應(yīng)用 制備純化生物大分子,28,梯度洗脫方式,29,圖4-39 梯度溶液的制備方法和洗脫曲線 （a）線性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）編程梯度,30,層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)備: 層析柱、蠕動泵（恒流泵）、檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。,31,層析設(shè)備,層析裝置： 梯度混和器 蠕動泵 層析柱 監(jiān)測儀 記錄儀 收集器,32,記錄儀,現(xiàn)代化層析設(shè)備akta,層析柱xk bp

10、g,34,實驗2.1 層析柱的填裝,1.觀摩 2.實驗步驟 1）測定酶濃度（s-2） c(mg/ml)=a280/13 2）若填料載量為20mg/ml，計算擬純化100mg 蛋白需要的填料量和量取量。,35,3）裝柱要點： a. 用純水將乙醇保存液置換 b. 柱頭及柱底適配器確保無氣泡，可用注射器推注趕氣泡，并確保連接管路密閉無泄漏。 c. 填料傾倒入柱管內(nèi)前先加入少量水覆蓋柱底 d. 柱拆卸后填料務(wù)必回收，并保存于20%乙醇中。,二、酶的活力單位及酶活測定： 1. 酶活單位：1961年國際生化協(xié)會酶學(xué)委員會統(tǒng)一規(guī)定，酶的國際單位（iu）規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件（溫度25）下，每分鐘內(nèi)催化1微摩

11、爾（mol）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量（或1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成1微摩爾產(chǎn)物的酶量）稱為1標(biāo)準(zhǔn)單位。,37,2.酶的比活力： 每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。 對固體酶：用活力單位/mg酶蛋白、或活力單位/mg酶蛋白氮來表示； 對液體酶：用活力單位/ml酶液來表示。 很明顯，比活力越大，酶的活力越大。,分光光度法：產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑生成有色物質(zhì) 或產(chǎn)物有紫外吸收的能力可采用此法。 測壓法：產(chǎn)物中有氣體，測氣壓增加量。 滴定法：產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。 熒光法：產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑 反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物可用此法。 旋光法：產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。,除了以上方法外，還可根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)

12、采用其它方法。,3.具體測定方法,4. 回收率和純化倍數(shù) 回收率 100,提純后酶總活力,提純前酶總活力,純化倍數(shù),每次比活力,第一次比活力,40,實驗2.2溶菌酶的活性測定,實驗材料： 1. 枯草芽孢桿菌懸液 2. s1，s2 3. pbs等 4. 分光光度計、比色皿、計時器、離心機(jī)等,41,實驗步驟： 1. 取6ml 菌懸液，3500rpm*5min，棄上清，沉淀 6ml pbs重懸。 2. 測定od600并記錄（吸光度0.51.0，若讀數(shù)過高可適當(dāng)稀釋） 3. 測定樣品準(zhǔn)備（酶液務(wù)必在儀器等條件準(zhǔn)備好，臨測定前加入）,42,實驗步驟： 4. 酶活性測定，以管（pbs）為對照，每隔30s

13、測定2,3,4管的od600并記錄 5. 酶活力及比活性計算： u=(odn-od2)/0.001*t(min)*0.2 c(mg/ml)=a280/13 6. 純化回收率及純化倍數(shù)計算,回收率 100,us2*v2,us1*v1,純化倍數(shù),s2比活力,s1比活力,43,7. 完成下表,44,實驗3溶菌酶的純度鑒定與分子量測定,實驗?zāi)康? 1、通過實驗的學(xué)習(xí)與操作，在實驗過程更好的理解sds-聚丙烯酰胺凝膠（page）測定蛋白質(zhì)純度與分子量的原理與依據(jù)； 2、掌握電泳原理以及sds-page垂直板電泳分析蛋白質(zhì)技術(shù)； 3、熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，sds-page分子量

14、測定圖譜的繪制與計算； 4、了解在電泳中分子量標(biāo)準(zhǔn)物的使用。,45,sds聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, sds- page）簡稱sds page。 用于蛋白純度及蛋白質(zhì)亞基相對分子量（relative molecular mass, mr）測定。,1.原理,46,1.原理,sds是一種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。 sds破壞蛋白質(zhì)氫鍵、

15、疏水鍵，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)sds復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。 因此，蛋白質(zhì)sds復(fù)合物(sds-denatured protein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。,47,sds-page separates proteins by mw,48,蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logmw=k-bx mw：分子量；x：遷移率；k、b均為常數(shù) 將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)其相對遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上

16、求得分子量。,49,50,2. 分離效應(yīng) page根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為： 連續(xù)電泳（continuous electrophoresis） 采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng) 不連續(xù)電泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系 電荷效應(yīng) 不連續(xù)page 分子篩效應(yīng) 濃縮效應(yīng),連續(xù)page,不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。 濃縮效應(yīng)：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。 電荷效應(yīng) : 分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。

17、分子篩效應(yīng) ：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。,52,2. 實驗步驟：（sds-page） 1）母液配制 2）制膠準(zhǔn)備: 玻璃板清洗、干燥 制膠架的準(zhǔn)備：嚴(yán)格按說明書組裝制膠架 注意：輕拿輕放文明操作，避免玻璃板破損制膠架松動及其他設(shè)施偏離工作要求。,53,2. 實驗步驟：（sds-page） 3）制膠: 分離膠、濃縮膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇15%的分離膠，如表配制,54,55,3、按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5 cm左右，之后加少許蒸餾水，靜置30分鐘。凝膠配制過程要迅速，催化劑temed要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法

18、注膠。注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。 4、倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5 mm處，迅速插入樣梳，靜置10分鐘。樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。 5、電泳液緩沖（*10）配制：30g tris, 150g gly, 10g sds+800ml dh2o, 定容至1000ml,56,5、樣品處理：取30ul樣品（s1，s2），加入30ul 上樣緩沖液，100水浴30min， 拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液，使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，否則會影響加樣效果。 6、加樣3個，空出第一個孔，從第二個開始按已編排好的順序依次加入相應(yīng)體積的樣品和蛋白marker。其中蛋清（s1）和marker加樣量為2 l，s1、s2、