RNA沉默信號在細胞間和系統(tǒng)內的傳輸

1、精品文檔RNA沉默信號在細胞間和系統(tǒng)內的傳輸大多真核生物中，雙鏈RNA被加工成小RNA，這些小RNA可以有效的調節(jié)基因的表達。這種基因沉默被認為是RNA沉默或者是RNA干擾，在植物和線蟲中，它們與一種移動信號有關，這種移動信號可以在細胞與細胞之間移動，也可以長距離的傳播。一個特有的序列，它有關于系統(tǒng)RNA沉默的特性表明核酸是這種信號復合體的組成部分。最近做的工作已經(jīng)弄清楚了，移動RNA的種類，與它們產(chǎn)生相關的基因，還有這種信號的傳播。這些觀點談論了系統(tǒng)RNAi的進步，目前面臨的挑戰(zhàn)和這個快速發(fā)展的領域所存在的問題。 多細胞生物的抗病性和對逆境的反應依賴局部和系統(tǒng)的多種信號分子的傳導完成的，這些

2、信號分子包括激素，轉錄因子和其它的大分子物質。直到近幾十年，RNA被認為不參與這些信號傳播途徑因為人們懷疑它會被細胞內的核酸酶所降解。人們發(fā)現(xiàn)了一些特例，移動RNA與沒有外殼的類病毒或時RNA病毒有關，但是這只能說明一點，就是病原體的RNA能說明內源基因是如何被調控的。 然而，移動基因假說遵循了這個發(fā)現(xiàn)，轉基因引發(fā)一個有效的沉默信號在植物體內從一個細胞傳到另一個細胞并進行遠距離傳導。這個信號不能直接被檢測到，但是由于這種影響是依賴于核酸序列的，就好像是轉基因和它的靶標一樣的關系，那似乎將會涉及到RNA。在秀麗隱桿線蟲中，人們發(fā)現(xiàn)，注入雙鏈RNA后會引起局部和系統(tǒng)的RNA沉默，這也說明移動RNA

3、的調節(jié)功能是很強的。運用遺傳學的，分子生物學的相關分析揭示了在植物，真菌，動物體內，RNA的沉默途徑。dsRNA被Dicer酶或者是Dicer-like酶加工成小的雙鏈RNA（20-30nt）。這些sRNA再與AGO蛋白結合并將他們按照堿基互補配對的原則與核酸結合。如果目標分子是RNA，那么它會通過RNA裂解，翻譯抑制，或者是mRNA受到干擾導致轉錄后基因沉默。另外，在植物和酵母菌中，AGO-sRNA復合體可以直接修飾DNA或者組氨酸在轉錄控制基因沉默的過程中。 原則上，一個移動的RNA可以是長雙鏈RNA的合成前體物，這個前體物是關于在重要的RNA沉默途徑中的sRNA，或者是，雙鏈的和單鏈的s

4、RNA。在一些生物中，包括植物，酵母菌，昆蟲，會有一些額外的RNA，因為在一些途徑中，sRNA會產(chǎn)生次級sRNA產(chǎn)物，其中包括依賴RNA的RNA聚合酶（RDRs）。在植物中，一個長的次級dsRNA產(chǎn)物被分解成另一些次級sRNA產(chǎn)物，然而在秀麗隱桿線蟲中，這些次級sRNA直接產(chǎn)生不需要Dicer酶的參與。這種RDRs具有放大RNA沉默效應的功能并且任何一個次級RNA都可以成為移動的RNA。在擬南芥和其它植物中，有多種AGO，DCL和RDR，有一種設想是它們有專門的RNA沉默途徑。目前，在植物體內至少有4種不同類型的RNA沉默路徑，包括不同類型的sRNA，這些sRNA涉及到miRNA和siRNA。

5、這些路徑包括miRNA，異染色相關的siRNA，反式作用的siRNA和病毒的siRNA。miRNA途徑是利用DCL1將一個具有發(fā)夾結構的RNA裂解成有21nt的miRNA，這些miRNA在與AGO1結合，再轉移到目標mRNA上，使之沉默。異染色體相關的siRNA途徑是形成24nt的siRNA，這個siRNA是植物特有的POL IV基因的轉錄產(chǎn)物，POL IV是由RDR2組成的雙鏈并且由DCL3切割處理的。這些hc-siRNA與AGO4，AGO6或者AGO9 recruitchromatin modifiers and target transcripts generated by the pl

6、ant-specific POL V to direct DNA methylation at cytosine residues。tasiRNA途徑是目的miRNA在RDR6和DCL4的聯(lián)合作用下裂解成21siRNA。最后，植物擁有一個沉默途徑來抑制入侵的病毒核酸。雙鏈病毒RNA被DCL4和DCL2切成21-22nt的siRNA，這些siRNA可以降解病毒的RNA 但是，信號的傳遞對于這些途徑中的任何一個都不是特殊的，每一個miRNA，siRNA和tasiRNA途徑與移動RNA沉默相關。這兒，我們討論近期關于在植物上做的工作已經(jīng)鑒定出了RNA與沉默信號有關，并且我們在植物中比較這個過程也在努

7、力朝著理解移動RNA如何在秀麗隱桿線蟲體內作用的方向去發(fā)展。RNA沉默信號的局部傳導在植物體和秀麗隱桿線蟲，沉默信號首先移動到鄰近的細胞中。例如，沉默信號在生物體內傳播就導致各種細胞中的目的基因被沉默。在植物體內，信號在整個系統(tǒng)中的運動涉及到維管束系統(tǒng)，包括韌皮部和木質部，一旦信號到達目的細胞，它便可以運動到相鄰的細胞。首先，我們把局部運動看做是信號在相鄰的細胞之間傳播。接下來，我們描述信號的系統(tǒng)傳播。分子在植物體內的運輸既可以通過相鄰細胞間的胞間連絲進行運輸也可以通過穿過細胞膜，細胞壁，細胞間隙等方式進行運輸。沉默信號很可能是通過共質體途徑進行傳導的。在葉片中，信號不進入氣孔保衛(wèi)細胞，由于它

8、與葉肉細胞的是分離開的，這與我們的假設是符合的。能通過胞間連絲的最大分子是27K道爾頓，但是胞間連絲可以調節(jié)通道的大小并且有選擇性的讓一些更大的分子通過，比如KNOTTED1轉錄因子，病毒的核糖核蛋白。病毒編碼蛋白質可以改變胞間連絲對分子大小的限制，大概有細胞蛋白acting允許大分子通過。對擬南芥進行基因篩選來鑒定與沉默信號有關的蛋白，包括對打開胞間連絲起作用的蛋白。這些篩選出的基因中的一個沉默轉基因在篩管伴胞細胞中利用篩管特有的SUC2基因中的啟動子進行表達。The targeted genes gave chlorotic or photobleached phenotypes when

9、 silenced so that the spread of the signal was apparent from the appearance of cells adjacent to the phloem (Figure 1)所有的例子中，細胞中的沉默都發(fā)生在葉脈周圍。這條線路上的突變型在沉默表型上有的被削弱有的被曾強并且這些突變型的這些基因已經(jīng)定位和鑒定出來了?；蚝Y選的結論表明沉默信號的產(chǎn)物和傳遞涉及的不只是先前鑒定的那幾種途徑。在hc-siRNA途徑中，與NRPD1和RDR2先關的突變體影響移動沉默，然而，途徑中其他成分如AGO4和DCL3則沒有這種作用。但是，這種基因篩選有它

10、的局限，它缺少空間信息。這個突變的基因可以影響篩管伴胞細胞，沉默信號在伴胞細胞中產(chǎn)生的，或者影響受體細胞或者二者都影響。為了解決這個問題，Dunoyer特地的讓DCL4在dcl4的突變背景下在篩管伴胞細胞中表達。在這些植物中移動的沉默信號被生成，表明DCL4對細胞產(chǎn)生沉默信號是必須的，并且推斷DCL4的產(chǎn)物21nt的siRNA與沉默信號有關。P19病毒的表達在細胞中抑制沉默阻止移動的沉默表型并且增強這個推論。P19限制21nt siRNA并且能阻止它們補給到RNA沉默途徑中。但是，伴胞細胞特有的表達AGO1可以補充ago1突變體在轉基因沉默途徑中損失的沉默信號，表明AGO1在細胞中是接收沉默信

11、號的。關于這些不同基因數(shù)據(jù)的解釋是，21nt的雙倍sRNA在細胞中產(chǎn)生，它們能形成信號并且能移動到受體細胞，在那與AGO1復合體親和，為了檢驗這個假設，Dunoyer用轟擊標記sRNA并且發(fā)現(xiàn)21和24nt的sRNA在細胞中的移動是雙鏈的，沒有單鏈的形式。相反的，用顯微注射技術傳遞sRNA沒能解釋21和25nt的dsNA在細胞中的移動。微注射技術已經(jīng)廣泛的運用于分析病毒的移動蛋白對胞間連絲的通透性的影響，但是那是屬于人工的由于高壓對亞細胞結構的傷害。我們對這個沖突數(shù)據(jù)進行了比較謹慎的解釋，雙鏈21ntsiRNA是移動沉默的一種信號，但還需要更進一步的分析。并且，沒有實驗排除了移動RNA信號以多

12、種形式存在的可能，而21-ntRNA二倍體只是其中的一個。另外，hc-siRNA和tasiRNA途徑中的成分，通過基因分析，移動沉默中也涉及到REX1和HPR1.這些蛋白與細胞內RNA轉運復合體如動物中的THO/TREX復合體相關。在信號的細胞與細胞之間的傳輸過程中，TEX1和HPR1可能輸出和處理從細胞核到細胞質的信號。這些蛋白可以在接收沉默信號的細胞中運輸導入RNA。到目前為止，基因篩選還沒有揭示影響RNA沉默信號在共質體途徑中運動的與胞間連絲和骨架特性相關的蛋白。這種不足可能是因為共質體途徑中，多種內源分子包括RNA，都是生長發(fā)育必須的并且由于這些突變體可能沒有生活力所以很難被檢測到。例

13、如，在葉片的發(fā)育過程中，有證據(jù)表明tasiRNA在葉片的近軸端產(chǎn)生向遠軸端傳播來調節(jié)葉片的發(fā)育基因AUXIN RESPONSE FACTOR 3。類似地，miRNA對根中柱細胞間的轉錄因子的表達有影響，雖然不知道這個移動因子是miRNA還是它的前體物。在擬南芥花粉中，sRNA和sRNA的前體物可能會在其營養(yǎng)細胞和精細胞之間移動。但是，在精細胞壁中不大可能有胞間連絲并且這個過程很可能是非原質體的而不是共質體途徑。非原質體運動經(jīng)常假設來解釋母系表達siRNA是如何從發(fā)育種子的胚乳轉運到與之分離的胚芽中去的，對于這個還缺乏直接的證據(jù)。RNA運動到精細胞中的證據(jù)是基于人工miRNA在花粉前體和花粉營養(yǎng)

14、細胞而不是精細胞中的特異性表達。關于這些數(shù)據(jù)的解釋關鍵是amiRNA啟動子在花粉細胞中不活躍。它同樣需要這些，花粉前體中產(chǎn)生的amiRNA在精細胞分化前被降解。要完全的弄清楚需要用不同的方法進行試驗。RNA沉默信號的系統(tǒng)運動沉默信號在植物不同的器官間運動，首先需要裝載到維管束系統(tǒng)中，經(jīng)過運輸，然后在受體細胞和組織中被卸載。沉默信號的這種長距離或者系統(tǒng)的運動的發(fā)生需要一些天，并且通常會從光合作用源端通過一個整體的過程向下運動，這跟韌皮部的特性一樣。由于這個原因，韌皮部而不是木質部通常被認為是沉默信號運動的通道，明顯的，木質部運輸水和離子，里面不含RNA。系統(tǒng)信號，也有局部信號，可能含有多種核酸形

15、式，包括sRNA和sRNA前體。鑒定系統(tǒng)RNA沉默信號包括直接對韌皮部中的液體取樣和檢測嫁接植物中的和幼枝中的RNA。上面描述的兩種處理都支持了sRNA是RNA沉默信號的組成部分。對瓜類和甘藍進行直接取樣處理也支持了這個檢測，關于18-25nt siRNA和miRNA，包括這些與營養(yǎng)動態(tài)平衡相關的。在韌皮部發(fā)現(xiàn)的sRNA表明他們是以單鏈形式存在的，但miRNA和他的互補miRNA序列都存在。在無維管束的細胞中，雙鏈中的一條作為miRNA被裝載到AGO上，因此，雙鏈象征著韌皮部的sRNA可能與AGO沒有聯(lián)系。維管束液體中是個無RNA酶的環(huán)境，因此sRNA能以穩(wěn)定的形式存在或者它們能與蛋白質結合而

16、不是AGO。南瓜維管束中的一種蛋白CmPSRP1特異性的與25nt的單鏈RNA綁定。在微注射實驗中，它能促進RNA以單鏈而不是雙鏈的形式在細胞間移動。但是沒有基因的證據(jù)支持這種蛋白的功能和微注射實驗，如上面所說的，更傾向于細胞到細胞的運動而不是遠距離運輸，因此關于這種蛋白還需要更進一步的分析。嫁接對直接取樣是一種非常有用的補充，因為它支持了沉默信號的來源從遺傳的角度與受體組織不同并且核酸序列數(shù)據(jù)可用來鑒定已經(jīng)通過嫁接組織的RNA。例如，Pant在幼枝中超表達miR399并且嫁接到野生型根上，他們發(fā)現(xiàn)在根中miR399的轉錄豐度是增加的。Dunoyer類似的用缺少內源siRNA的擬南芥，這種內源

17、siRNA是反向重復序列轉錄產(chǎn)物。根中的這條途徑包含非常少得IR71siRNA在這個區(qū)域除非它們被嫁接到富含這種siRNA的野生植株的根部。這些分析都比簡單的直接取樣方法更先進，因為它們從遺傳學角度顯示RNA已經(jīng)從幼枝移動到根部并且它們堅持了sRNA是移動的這個觀點。但是，上面的描述沒有一種已經(jīng)確證移動RNA的分子形式。對韌皮部的液體取樣與移動RNA的功能分析沒有聯(lián)系并且嫁接實驗同樣堅持sRNA和它們的前體是移動的這一觀點。用更復雜的分析植株，將經(jīng)歷了RNA沉默并用GFP標記的根嫁接到同樣用GFP標記的沒有經(jīng)歷沉默的幼枝上。在這些試驗中，幼枝GFP標記的都被沉默了，不管根中原始組織是否含有dc

18、l1，dcl2，dcl3，dcl4突變體并且作者對于這個實驗總結是過程中DCL不需要。它們推斷長RNA屬于移動RNA類型。由于擬南芥中的DCL功能繁多，因而研究是相當復雜的，而且sRNA仍然很可能屬于移動RNA類型。一個更有說服力的嫁接分析，在擬南芥dcl2，3，4三個突變體中發(fā)現(xiàn)22-24nt sRNA缺失型并且用子代來監(jiān)測沉默信號從幼枝到根部的運動。這個實驗清楚地說明24ntRNA來自轉基因和內源的基因位點，它們由于缺少DCL3，如果將它們嫁接到dcl2,3,4突變體幼枝上，那么在受體dcl2,3,4中它們是缺失的，但是，如果將突變體的根嫁接到野生型的幼枝上，它們就是非缺失的。類似的，將野

19、生型的根嫁接到野生型的幼枝上，24nt sRNA相比將野生型根嫁接到dcl2,3,4突變型的幼枝上更多些。結論是24nt sRNA進行系統(tǒng)運動并且根部大比例的24-nt sRNA來自幼枝。更進一步得出結論是，至少從一個GFP轉基因和從一些被選擇的內源基因位點，24 nt而不是21 nt的sRNA選擇通過系統(tǒng)途徑進行移動。但是，24 nt siRNA和系統(tǒng)性運動的關系并不簡單。在擬南芥中，只有35%的sRNA位點產(chǎn)生的sRNA與移動相聯(lián)系并且其他的特異性位點因子是必不可少的。另外，對于21 nt RNA 的選擇性不是像本文所說的與系統(tǒng)沉默相關的移動21 nt miRNA和siRNA那樣總是實用。

20、一種21 nt tasiRNA也在非自主的起作用，而且它的范圍比一些miRNA和轉基因衍生物siRNA大得多。因此，sRNA的大小不是決定局部和系統(tǒng)運動的唯一條件。還有其他的因素，例如，有可能與sRNA轉錄的基因位點和長RNA前體有關。局部和系統(tǒng)運動存在獨立的機制嗎？原則上，局部和系統(tǒng)運動可能存在獨立的機制如RNA從任何單獨的位點僅能在細胞間或者韌皮部范圍內移動。21 nt sRNA和24 nt sRNA分別的與局部和系統(tǒng)運動相聯(lián)系支持了這一觀點。病毒抑制蛋白的分析也支持了獨立機制：阻塞21和24 nt sRNA途徑就阻止了局部和系統(tǒng)沉默然而這些專門影響24-nt sRNA途徑的只阻塞了系統(tǒng)沉默。為什么系統(tǒng)運動與局部運動有區(qū)別呢？一個不是很重要的解釋是，一個微弱的sRNA信號在一些細胞中被削弱并且不能夠傳出這些細胞。這種情況下，病毒的抑制導致殘留的sRNA水平很低從而阻塞系統(tǒng)沉默而不阻塞局部沉默，然而這個抑制如果導致sRNA完全消失就會同時阻塞系統(tǒng)和局部的運輸。在局部運動過程中，這種量的影響可以被認為是沉默信號是從SUC2啟動子結構傳播的。大多數(shù)擁有這種結構的轉基因途徑表現(xiàn)出的沉默信號傳播超出了葉脈。但是，在突變體途徑中，轉基因的啟動子被抑制，目標基因在葉片大