生物化學(xué)合工大第四章核酸化學(xué).ppt

1、第四章核酸化學(xué),Nucleic Acid chemistry,第一節(jié) 概述 第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成 第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu) 第四節(jié) 核酸的性質(zhì) 第五節(jié) 核酸的研究方法,本章內(nèi)容,第一節(jié)概 述,核酸（nucleic acidNA）是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲存與傳遞。 核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。,1868 F. Miescher從膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出了一 種含磷酸的有機(jī)物，當(dāng)時稱為核素（nuclein）,后稱為核酸（nucleic acid）。 1944 Avery 等通過肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證明DNA是遺傳物質(zhì)。 1952 Hershe

2、y, Chase-噬菌體標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。 1953 Watson和Crick提出DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。 1958 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則。 1973 Boyer，Cohen-DNA Cloning(克?。?1976 DNA Sequencing(序列分析）。 1990 Human Genome Project（人類基因組計(jì)劃）。,一、核酸的研究歷史,光滑型細(xì)胞（有毒）,粗糙型細(xì)胞（無毒）,破碎細(xì)胞,DNAase降解后的DNA,粗糙型細(xì)胞接受光滑型DNA,只有粗糙型,大多數(shù)仍為粗糙型,少數(shù)光滑型細(xì)胞被轉(zhuǎn)化,S,S,R,R,R,+,DNA,1944年Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),肺炎球菌（p

3、neumococcus）,1928年細(xì)菌學(xué)家Griffith 細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn),噬菌體感染實(shí)驗(yàn),1952年美國Hershey 噬菌體感染實(shí)驗(yàn),真核生物 原核生物 細(xì)胞核（98%） 擬核 線粒體mDNA （少量） 質(zhì)粒DNA（plasmid） 葉綠體ctDNA （少量）等 病毒DNA 細(xì)胞質(zhì)（90%） 細(xì)胞質(zhì) 核仁（少量） 病毒RNA,二、核酸的種類和分布,DNA 脫氧核糖核酸,RNA 核糖核酸,注：生物細(xì)胞都含有DNA 和 RNA； 病毒中只含 DNA 或 只含 RNA。,第二節(jié)核酸的化學(xué)組成,核酸是由幾十個甚至幾千萬個核苷酸聚合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。,基本元素：C、H、O、N、P

4、； 其中P 的含量比較穩(wěn)定，占9%-10%，通過測定P 的含量來推算核酸的含量（定磷法）。,一、戊糖,組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為-D-核糖。,二、堿基,1. 嘌呤（Purine）,2. 嘧啶（Pyrimidine）,核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。,二氫尿嘧啶 （DHU）,修飾堿基的簡寫符號,( 為1時可以不寫 ),三、核苷（nucleoside）,核苷：戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵 核苷中戊糖與堿基的連接方式：,修飾核苷/稀有核苷,修飾核苷包括三種情況:,（1）由修飾

5、堿基和糖組成的核苷,（2）由非修飾堿基和2-O-甲基核糖組成的核苷,（3）由堿基與糖連接方式特殊的核苷,（1）,（2）,二氫尿嘧啶核苷,(Am),（3）,(),取代基用下列小寫英文字母表示 :,例：,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸： 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸,H,五、游離核苷酸及其衍生物的形式,1. 繼續(xù)磷酸化,2.環(huán)化磷酸化,cAMP,cGMP,3.輔酶 NAD、NADP、FAD、HSCoA,FAD,NAD、NADP,HSCoA,4. GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白 生物合成和多糖生物合成的活性糖 基供體。,第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu),一、DNA的結(jié)構(gòu) 一級結(jié)構(gòu): DN

6、A核苷酸鏈中脫氧核苷 酸的組成和排列順序。 二級結(jié)構(gòu)：DNA的兩條多聚鏈間通過 氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 三級結(jié)構(gòu)：DNA雙鏈進(jìn)一步折疊卷曲 形成的構(gòu)象。,（一）DNA的一級結(jié)構(gòu),由dAMP、dGMP、 dCMP、 dTMP核苷酸單體通 過3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。,結(jié)構(gòu)式,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羥基端（常用3 -OH表示） 核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個核苷酸鏈時，必須注明它的方向是53或是35。,DNA的一級結(jié)構(gòu)也可指DNA分子中堿基的順序。 DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形 式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種 核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中

7、。,（二）DNA的二級結(jié)構(gòu),Watson 和 Crick 于1953年提出了DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，說明了DNA 的二級結(jié)構(gòu)。（即B型DNA）,（1）Chargaff定則 （1950s,E. Chargaff發(fā)現(xiàn)）,DNA堿基組成符合： A=T；G=C； A+G=T+C。 不對稱比率：A+T/G+C； 物種不同，DNA堿基組成不同； 物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，該比 率越相近似。 .具有種的特異性，沒有器官和組織的特異性，年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境的改變不影響DNA的堿基組成。,1提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù),（2）x-光衍射分析,2DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（double-helical str

8、ucture）,1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（1）,螺旋中的兩條鏈反向平行，即其中一條鏈的方向?yàn)?3，而另一條鏈的方向?yàn)?5，兩條鏈共同圍繞一個假想的中心軸呈右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（2）,疏水的堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，親水的磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基平面與螺旋軸垂直，脫氧核糖平面與中心軸平行。 由于幾何形狀的限制，堿基對只能由嘌呤和嘧啶配對，即A與T，G與C。這種配對關(guān)系，稱為堿基互補(bǔ)。A和T之間形成兩個氫鍵， G與C之間形成三個氫鍵。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（3）,由于堿基對排列的方向性，使得堿基對占據(jù)的空間

9、是不對稱的，因此，在雙螺旋的表面形成大小兩個凹槽，分別稱為大溝和小溝，二者交替出現(xiàn)。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（4）,雙螺旋橫截面的直徑約為2 nm，相鄰兩個堿基平面之間的距離（軸距）為0.34 nm，每10個核苷酸形成一個螺旋，其螺距（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）的高度）為3.4 nm。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（5）,兩條鏈借堿基之間的氫鍵和堿基堆積力（即堿基之間的范德華力）牢固的連接起來，維持DNA雙螺旋的三維結(jié)構(gòu)。 兩條鏈?zhǔn)菈A基互補(bǔ)關(guān)系。,3. DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素, 氫鍵 堿基堆積力 磷酸基上負(fù)電荷被胞內(nèi)組蛋白或正離子中和 堿基處于疏水環(huán)境中,4. DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義,該模型揭示了D

10、NA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價(jià)值的是確認(rèn)了堿基配對原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。該模型的提出是上個世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。,DNA雙螺旋構(gòu)象的類型,（三）DNA的三級結(jié)構(gòu)-超螺旋,1）超螺旋是指雙螺旋進(jìn) 一步扭曲或再螺旋的構(gòu) 象。 2）正超螺旋（變緊，過 旋）和負(fù)超螺旋（變松， 欠旋）。 3）人類46條染色體的 DNA總長可達(dá)1.7m，經(jīng)過 螺旋化壓縮，實(shí)際總長只 有200nm。,負(fù)超螺旋,核小體盤繞及染色質(zhì)示意圖,DNA的存在形式-核小體,真核生物中DNA雙螺旋沿著組蛋白八

11、聚體核心的短軸繞1.75圈，形成左手超螺旋，稱核小體。 染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體。 串珠狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步卷曲形成螺線管，后者再進(jìn)一步卷曲形成超螺旋管，形成染色單體。,基因和基因組,基因即一段有功能的DNA片段，生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。 一個細(xì)胞或生物體所含的全套基因稱基因組。,二、RNA的分子結(jié)構(gòu),（一） RNA的分類及特點(diǎn) （二） RNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),（一）RNA的特點(diǎn)及分類,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1. 堿基組成：A、G、C、U （AU/GC）； 2. 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解； 3. 多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）； 4. 分子較小。 分類： 1. 信使

12、RNA（ mRNA） 2. 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA （ tRNA） 3. 核糖體RNA （r RNA）,Messenger RNA,約占總RNA的3%-5%，含量最少，種類最多。 成熟mRNA不含內(nèi)含子，hnRNA含有。 mRNA從DNA轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序。,Ribosome RNA,約占全部RNA的80%，含量最多。 與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，后者是合成蛋白質(zhì)的場所。,Transfer RNA,約占總RNA的10-15%，分子最小。 它在蛋白質(zhì)生物合成中起翻譯mRNA信息，并將相應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體，參與蛋白質(zhì)體的合成。 已知每一個氨基酸至少有一個相應(yīng)的tRN

13、A。,（二）RNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),tRNA 的結(jié)構(gòu),二級結(jié)構(gòu)特征： 單鏈 三葉草葉形 四臂四環(huán),三級結(jié)構(gòu) 特征： 在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上 進(jìn)一步折疊扭曲形成倒 L型,酵母tRNA Ala 的二級結(jié)構(gòu),DHU環(huán),2） rRNA的分子結(jié)構(gòu),特征： 單鏈，螺旋化程度較tRNA低 與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能,5SRNA的二級結(jié)構(gòu),3）mRNA的分子結(jié)構(gòu),在轉(zhuǎn)錄一章講授,第四節(jié) 核酸的性質(zhì),一、一般物理性質(zhì) 二、核酸的水解 三、兩性解離 四、紫外吸收性質(zhì) 五、穩(wěn)定性 六、變性 七、復(fù)性與雜交,一、一般物理性質(zhì),1. DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末狀固 體，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇來

14、沉淀DNA ； DNA溶液黏度大于RNA 。 2. DNA難溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于 12 mol/L的NaCl溶液，RNA則相反，可據(jù)此 分離二者。 3. 加熱條件下， D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色 D2脫氧核糖酸二苯胺 藍(lán)紫色,二、核酸的水解,核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。 DNA和RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解。 在細(xì)胞內(nèi)核酸分子受DNA酶作用。,三、兩性解離,核酸含酸性的磷酸基團(tuán)，又含弱堿性的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離； 核酸相當(dāng)于多元酸，pH大于4時，呈陰離子狀態(tài)； 等電點(diǎn),四、紫外吸

15、收,在核酸分子中嘌呤堿和嘧啶堿都含有共軛雙鍵體系，在260 nm有吸收； 可以作為區(qū)別蛋白質(zhì)和對核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)，進(jìn)行核酸純度鑒定，也可作為核酸變性和復(fù)性的指標(biāo)。,DNA的紫外吸收光譜,天然DNA 變性DNA 核苷酸總吸收值,1 2 3,根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度,純DNA：A260/A280=1.8 純RNA：A260/A280=2.0,（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低）,純的核酸樣品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量,若260nm光吸收值為1相當(dāng)于50g/ml雙螺旋DNA,或相當(dāng)于40g/ml單鏈DNA或RNA,或相當(dāng)于20

16、g/ml寡核苷酸。,五、DNA的穩(wěn)定性,1.DNA的溶液呈粘稠狀，但實(shí)際上DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)僵直而有剛性，易斷成 碎片，這也是目前難以獲得完整大分 子DNA的原因。 2.溶液狀態(tài)的DNA易受DNA酶作用而降 解，抽干水分的DNA性質(zhì)十分穩(wěn)定。,六、DNA的變性,1. 概念 2. 變性條件 3. 變性的特征,1. 概念,是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。,2.DNA的變性的條件,能夠引起核酸變性的因素有： 1）溫度升高； 2）酸堿度改變、 pH（11.3或5.0）； 3）有機(jī)溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等； 4）低離子強(qiáng)度。,3.DNA變性的特征,變性核酸將失去其部分

17、或全部的生物活性。 變性改變了DNA的二級結(jié)構(gòu)。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。 DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。 DNA解鏈溫度 紫外吸收值明顯增加，即增色效應(yīng)。 粘度降低，沉降系數(shù)增加。,DNA解鏈溫度（熔點(diǎn)，Tm ）,當(dāng)50% 的DNA變性時的溫度稱為該DNA的解鏈溫度，即增色效應(yīng)達(dá)到一半時的溫度；一般DNA的Tm值在70-85C之間。 均一DNA（如病毒）的Tm值范圍較小。 分子中G和C的含量越高，越不易變性，Tm值越高?？赏ㄟ^經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 Tm值隨溶液鹽濃度增加而增大， Tm值

18、較低，易變性，不易保存。,溶解曲線與Tm。,。,影響Tm值的因素, DNA的均一性, DNA中G-C對的含量,經(jīng)驗(yàn)式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44, 鹽離子強(qiáng)度,增色效應(yīng)與減色效應(yīng),天然DNA分子在熱變性條件下，雙螺 旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，在紫外光260nm 波長處的吸收度明顯增加，此現(xiàn)象稱為 增色效應(yīng)。 變性DNA分子復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時 其紫外吸收降低的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。,七、DNA的復(fù)性,概念 復(fù)性的條件 3. 影響復(fù)性的因素 4. 復(fù)性動力學(xué) 5. 分子雜交,1. 概念,1.變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分 開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)， 其物理性質(zhì)和生物活性隨

19、之恢復(fù)，這一過 程稱為復(fù)性； 2.對于熱變性的DNA，在緩慢冷卻的條件 下可重新結(jié)合恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為退 火。 3.DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)， 但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。,DNA的復(fù)性圖示,2.DNA的復(fù)性條件,1.將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫 時，DNA不可能復(fù)性。即淬火。 2.將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復(fù) 性。退火溫度Tm25 3.分子量越大復(fù)性越難。濃度越大， 復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性需要 一定的鹽濃度，也與它本身的組成和 結(jié)構(gòu)有關(guān)。,復(fù)性 也稱退火,3. 影響復(fù)性的因素, 樣品的性質(zhì), DNA的濃度, DNA片段的大小, 溫度, 離子強(qiáng)度,4.復(fù)性動力

20、學(xué),DNA的復(fù)性過程是一種雙分子反應(yīng),S：single strand DNA,D：double strand DNA,5.分子雜交,1.在變性的DNA溶液中加入外源DNA單鏈分子或 RNA單鏈分子（與原DNA具有同源性），去掉變 性條件后復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。 2.這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。 3.利用核酸雜交可檢測特定的核苷酸片段或研 究同源性等。,分子雜交,探針：用于雜交的異源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，經(jīng)放射性標(biāo)記的一條鏈。,核酸的變性、復(fù)性和雜交,分子雜交的種類,Southern Blot：DNA-DNA雜交 Northern Blot：DNA-RNA雜交 Western Blot：抗原-抗體進(jìn)行雜交 原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯出熒光,Southern印跡法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,瓊脂糖電泳,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,與放射性標(biāo)記DNA探針雜交,放射自顯影,帶有DNA片段的凝膠,凝膠,濾膜,用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA,吸附有DNA片段的膜,第五節(jié) 核酸的研究方法,一、核酸的分離、提取通則,為了得到完整的大分子核酸，一般要注意3點(diǎn) ： 1保持低溫（04）。 2防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌。 3防止核酸酶的作用。,抑制DNase：,可加檸檬酸鈉、EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑 十二烷基硫酸鈉（S