第四章電泳技術(shù)

1、第四章 電泳技術(shù),1 電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程。 2 電泳技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好 3 電泳方法分類 按電場(chǎng)分：常壓（500V，適用小分子） 支持體分：自由電泳、區(qū)帶電泳 儀器裝置分：水平式、垂直式、懸架式 4 電泳條件：水溶液（緩沖液）、支持物（區(qū)帶電泳）、電場(chǎng)（電泳儀、電泳槽）,一 電泳的基本原理,電泳分離： 移動(dòng)方向：帶電性質(zhì)決定 泳動(dòng)度：帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的移動(dòng)速度。 v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt 影響的因素： 1顆粒本身：帶電、大小、形狀 2 外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度E、pH、離子強(qiáng)度I、電滲、緩沖液粘度及溫度等。,二 紙電泳

2、,以濾紙為支持體的電泳技術(shù) 操作要點(diǎn)： 1 選擇緩沖液 對(duì)顯色劑和紫外光吸收等觀察區(qū)帶的方法無(wú)影響 A 分離蛋白質(zhì)，pI 5，選pH8.6的緩沖液（巴比妥緩沖液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4) B 分離氨基酸：鄰苯二甲酸氫鈉、磷酸醋酸，pH5.9 C 分離核苷酸巴比妥醋酸pH2.5，檸檬酸pH23 D 分離糖類：HAC-NaAC, pH35,2 濾紙的選擇與處理 層析用濾紙，紙寬23cm/樣品組分，長(zhǎng)短影響電場(chǎng)強(qiáng)度。 3 點(diǎn)樣 點(diǎn)圓點(diǎn)（量少）、點(diǎn)條狀（一般），點(diǎn)中間（未知樣品）、點(diǎn)一邊（已知樣品） 干法、濕法 4 電泳 電橋水平、加蓋、電壓穩(wěn)定、注意時(shí)間 5 顯色及分析 蛋白：溴酚

3、蘭、氨黑10B、偶氮胭脂紅B Aa：茚三酮、靛紅 核酸：紫外光下觀察 一般洗脫定量,三 薄膜電泳,支持體：薄膜 優(yōu)點(diǎn)：分辨力較高、簡(jiǎn)便、快速、區(qū)帶清晰、易于定量、便于保存 廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和同工酶等的分離分析 操作 1 薄膜的處理與放置 2 點(diǎn)樣 平衡 3 電泳：E 1025V/cm，0.52h 4 顯色,四 薄層電泳,將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層進(jìn)行電泳。 常用支持物：淀粉、瓊脂、纖維素粉、硅膠等 操作： 1 緩沖液選擇 離子強(qiáng)度較高的緩沖液 2 支持物處理 精制品 3 薄層板制作 4加樣：挖溝、混合樣品、填埋 5 電泳 6分析：印染法,五 凝膠電泳,支持物：多孔凝膠 聚丙烯酰胺凝膠

4、、瓊脂糖凝膠等 具有電泳和分子篩的雙重作用，分辨力高 最常用聚丙烯酰胺凝膠，原因： 機(jī)械強(qiáng)度好，透明有彈性，穩(wěn)定，無(wú)吸附作用和電滲作用，可制成不同孔徑的凝膠。 分類：垂直管型盤狀電泳、垂直板型電泳； 連續(xù)、不連續(xù)、梯度、SDS凝膠電泳,1 聚丙烯酰胺凝膠的制備 丙稀酰胺（單體）N,N-甲叉雙丙稀酰胺（交聯(lián)劑）（催化劑） 聚合 催化劑： （1）過(guò)硫酸銨四甲基乙二胺（TEMED） （2）核黃素（VitB2）光 改變單體濃度可改變凝膠孔徑 交聯(lián)劑對(duì)孔徑有影響：5最小 根據(jù)要分離物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量選擇合適的單體濃度。,2 不連續(xù)電泳中樣品壓縮成層的原理 不連續(xù)電泳含兩層或三層不同孔徑的凝膠，用不同pH

5、值的緩沖液： 樣品膠：大孔徑，pH6.76.8Tris-HCl緩沖液 濃縮膠：與樣品膠相同 分離膠：小孔徑，pH8.88.9 Tris-HCl緩沖液,樣品壓縮成層原理： 電極緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸 HCl (解離） Cl ， Cl 泳動(dòng)速度最快（快離子） CH2(NH2)COOH (樣品膠、濃縮膠pH6.76.8） CH2(NH2)COO（0.11.0）泳動(dòng)速度最慢（慢離子） 蛋白質(zhì)（P）泳動(dòng)速度介于快慢離子之間 電泳時(shí)， Cl 超過(guò)P走在最前面，其后形成一個(gè)離子濃度較低的低電導(dǎo)區(qū)較高電位梯度P和慢離子加速移動(dòng)P壓縮成層 樣品進(jìn)入分離膠后，pH為9.5（電泳過(guò)程實(shí)測(cè)）， CH2(N

6、H2)COO增加，泳動(dòng)速度增大，很快超過(guò)P， P在均一的電位梯度和pH條件下分離,SDS-凝膠電泳原理,聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS，P電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無(wú)關(guān)。 加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使P二硫鍵還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到P分子上，形成P-SDS，帶上相同密度負(fù)電荷，形狀為長(zhǎng)橢圓形，短軸一定，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度正比于P分子量。 分離測(cè)定： 測(cè)分子量（與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較） 鑒定樣品純度（條帶數(shù)目） 測(cè)定樣品P含量：掃描定量（比色）,凝膠電泳的操作要點(diǎn),1 凝膠制備 2 電極緩沖液 3 樣品處理及加樣 4 電泳 5 染色與固定 6 脫色 7 分析,煙曲霉菌中抗真

7、菌活性肽類物質(zhì)的分離與純化,六 等電點(diǎn)聚焦電泳,電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通已直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)載體即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。P進(jìn)入時(shí)，不同的P移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的P得以分離。 優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測(cè)定P或多肽的等電點(diǎn)。 缺點(diǎn)：需無(wú)鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的P。,1 穩(wěn)定的pH梯度的形成 2 兩性電解質(zhì)載體 要求： 由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備（有不同pH范圍的商品兩性電解質(zhì)載體） 3 支持pH梯度的介質(zhì) 密度梯度溶液（用于自由電泳） 凝膠（如聚丙烯酰胺凝膠） 4 操作要點(diǎn) pH梯度支持介質(zhì)的制備 聚焦電泳 檢測(cè) 兩性電解質(zhì)載體的除去,電泳技術(shù)思考題,1名詞解釋 電泳、電泳分離技術(shù)、泳動(dòng)度、電滲、區(qū)帶電泳、相對(duì)遷移率、不連續(xù)凝膠電泳 2 影