WesternBlot一般實驗流程

1、Western Blot 實驗方法材料、試劑及裝置材料：PVDF膜（0.45um） 稱裝轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)置用于浸泡的圓皿 用于結(jié)合抗體和洗滌的帶分割槽的小皿 用于結(jié)合一抗的帶份割槽的小盒 用于顯影的小玻璃板試劑：樣品特異性一抗 -actin特異性一抗 HRP二抗蛋白膠試劑盒 預染蛋白marker 轉(zhuǎn)膜緩沖液 封閉液 TBST 顯影試劑盒（根據(jù)二抗的類型選擇）裝置：Bio-Rad蛋白電泳系統(tǒng) Bio-Rad 轉(zhuǎn)膜系統(tǒng) Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)/其他 搖床 試劑配置（按照takara 實驗室常規(guī)試劑配置方法表所示）1，10X轉(zhuǎn)膜500mlGlycine（甘氨酸）14.5gTris29gSDS1.85g3

2、00ml dH2O 超聲溶解，定容400ml加入100ml甲醇，混勻后4度放置，使用時用含20%甲醇的水溶液稀釋10倍使用2，5X TBST500ml100mM Tris-HCl（pH 8.0）400mlNaCl22gTween 201.25ml用100mM Tris-HCl（pH 8.0）定容500ml，4度保存用時用蒸餾水稀釋5倍PS100mM Tris-HCl（pH 8.0）500mlTris-base（Mw=121.14）6.06g400ml蒸餾水超聲溶解，1M HCl 調(diào)pH 8.0定容500ml3，封閉液100mlBD 脫脂奶粉5g1x TBST100ml磁力攪拌器加熱攪拌（溫度不

3、宜過高），溶解后可過濾，以除去不溶性的奶粉顆粒），4度保存流程1，電泳可參考電泳條件：100mA，50min為節(jié)省膜材料，操作時可以僅將目的條帶切出而不必整個膠都做轉(zhuǎn)膜a) 10%的AP溶液應該現(xiàn)用現(xiàn)配，配置好的AP溶液可以在4度冰箱儲存2周左右b) 可考慮購買使用較為方便的蛋白膠試劑盒c) 可考慮購買預染的marker，以便觀察電泳效果并估計目標條帶的位置2，轉(zhuǎn)膜PVDF（0.45um孔徑）濕法轉(zhuǎn)膜可參考條件設置：200mA，56min；蛋白大小為40kDa和60kDa左右（實際操作時需要根據(jù)目的條帶的大小調(diào)整電流和轉(zhuǎn)膜時間，轉(zhuǎn)膜時間過短則膜上沒有相應的蛋白，轉(zhuǎn)膜時間過長則蛋白遷移出膜）a)

4、 PVDF膜剪裁（以適合蛋白膠的情況），切角（以便標記方向），在甲醇中浸泡洗滌以除去表面雜質(zhì)b) 可在電泳期間準備轉(zhuǎn)膜需要的板子、濾紙（三層）、海綿，并將這些材料和膜一同在轉(zhuǎn)膜液中浸泡c) 電泳后的膠條在轉(zhuǎn)膜液中浸泡約20mind) 轉(zhuǎn)膜裝置的組裝：在轉(zhuǎn)膜液中按順序放置材料：黑色面的板（代表負極） 海綿（組裝前充分擠壓海綿排出氣泡） 三層濾紙（注意排出氣泡） 蛋白膠（注意膠面的正反及上樣的順序） PVDF膜（輕輕的壓上，注意不產(chǎn)生氣泡） 三層濾紙（排出氣泡） 海綿（排出氣泡） 白色面的板（代表正極），將裝置封好，按照黑色對黑色、白色對紅色的方式將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜的槽中，立即蓋上蓋子，裝置至于冰

5、上開始轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間應嚴格控制（裝置封好后可在轉(zhuǎn)膜液中平衡30min再放入槽中開始轉(zhuǎn)膜）e) 可尋找或者購買適合夾取膜的小鑷子表1：目的蛋白、膠濃度與轉(zhuǎn)膜時間之間的關(guān)系3，封閉封閉液：TBST溶液（TBS+0.01%的tween20）+5%的脫脂奶粉（BD）a) 將轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)置卸下，取出膜，至于小平皿中（可考慮購置專用于western的帶分隔槽的塑料平皿，注意考慮膜的大小和寬度），倒入封閉液，以完全浸沒膜為準，在搖床上封閉1h（轉(zhuǎn)速大概60rpm，不能太快，也不能過慢）b) 使用后的封閉液可以回收4，洗滌TBST洗滌封閉后的膜a) 將封閉液轉(zhuǎn)出，并倒入TBST，以完全浸沒膜為準，至于搖床上洗滌，5

6、-6min，重復3次5，一抗孵育使用專用的帶分隔的小槽盒（可考慮購買），每個小槽內(nèi)加入不同類型的一抗（內(nèi)參（-actin）以及目的蛋白的特異性一抗）a) 以封閉液稀釋一抗，按照一抗說明說提供的稀釋范圍（如果結(jié)合效果不好，應該通過更多實驗摸索適合當前實驗條件的一抗稀釋比）在小管等容器中稀釋一抗，稀釋好的一抗加入小槽（能夠浸沒小槽底部的最小體積為5ml，可酌情添加）b) 將膜至于所需要的、稀釋后的一抗中，蛋白面朝上（轉(zhuǎn)膜時與蛋白膠接觸的一面為蛋白面），4度過夜孵育（可選擇4度過夜孵育、37度1h孵育或者室溫2h孵育，但一般建議4度過夜，效果較好，且能夠降低一天內(nèi)的實驗強度）6，洗滌TBST洗滌結(jié)合了一抗之后的膜，5-10min，洗滌4次（有抗體參與的過程，洗膜時候應該適當延長清洗時間和清洗次數(shù)）7，二抗孵育a) 使用封閉液按照二抗的說明進行稀釋，倒入容器中，室溫結(jié)合1h（搖床上？）8，洗滌TBST洗滌結(jié)合了二抗之后的膜，5-10min，洗滌4次（有抗體參與的過程，洗膜時候應該適當延長清洗時間和清洗次數(shù)）9，顯影顯影前，膜浸泡在TBST溶液中，不能干掉使用試劑盒配置顯影液，現(xiàn)用現(xiàn)配a) 開儀器，設置顯影所需要的程序和參數(shù)b) 將小玻璃板（洗干凈）至于儀器的樣品臺上c) 取出膜，在濾紙上輕輕洗掉多余的液體（膜不能干掉），輕輕放在小玻璃板上（注意不弄出氣泡）d) 在膜表面