干化學(xué)技術(shù)與應(yīng)用

1、干化學(xué)技術(shù)與應(yīng)用所謂“干化學(xué)”是與傳統(tǒng)的“濕化學(xué)”（即溶液化學(xué)）相對比較而言的。它是以被檢測樣品中的液體作為反應(yīng)媒介，待測物直接與固化于載體上的干粉試劑反應(yīng)的一種方式。它與傳統(tǒng)濕化學(xué)的最大區(qū)別就在于參與化學(xué)反應(yīng)的媒介不同。隨著生物化學(xué)中酶的分離、提純、存儲等技術(shù)的發(fā)展，傳感器、光度計和電極技術(shù)的進步，以及計算機應(yīng)用的普及，干化學(xué)技術(shù)在近20年里得到了長足的進步，相對于“濕化學(xué)”，“干化學(xué)”具有如下優(yōu)點：干化學(xué)試劑載體的結(jié)構(gòu)干化學(xué)試劑載體的結(jié)構(gòu)分為二層結(jié)構(gòu)，三層結(jié)構(gòu)，和多層膜。最簡單的二層結(jié)構(gòu) 用于生化分析的試劑載體最簡單的是二層結(jié)構(gòu)，在支持層塑料基片上有一試劑層纖維素片，在纖維素片中預(yù)固相了全

2、部試劑。常見的是尿生化分析試劑條：尿液中的待測成分與預(yù)固相在纖維素片上的試劑直接反應(yīng)，通過反射光度計測定其顏色的改變，從而計算待測成份的濃度。這種機構(gòu)只能對待測成分進行定性或半定量測定，這樣就限制了它在其它須準確定量的標(biāo)本的應(yīng)用。稍加改進的三層結(jié)構(gòu)在試劑層上加一多孔膠膜過濾層，其作用是將樣品中的雜質(zhì)過濾掉，并起保護試劑層作用。常見的是微量法測定葡萄糖的試劑條。三層試劑載體的測定光路是通過透明的塑料基片，而不經(jīng)過最上面的過濾層，這樣消除了樣品中干擾成分的影響，保證了待測成分測定的穩(wěn)定性和準確性。 比較完善的多層膜 當(dāng)代臨床檢驗中的干化學(xué)法，最具代表性的就是多層膜法，即干化學(xué)的多層膜試劑載體。它集

3、現(xiàn)代化學(xué)、光學(xué)、酶工程學(xué)、化學(xué)計量學(xué)和計算機技術(shù)于一體。 多層膜分為三種類型： 比色/速率法干片、離子法干片和免疫速率法干片1.1介紹比色/速率法干片 比色/速率法干片主要用于常規(guī)生化項目的測定，干片模式圖(圖1)顯示了一個臨床化學(xué)比色/速率法干片模式簡圖。在這個試劑片中，多種反應(yīng)試劑被固化在一張透明聚酯膜上，上面覆以多孔的擴散層，然后被夾在一個塑料結(jié)構(gòu)中。如圖所示，共有4個功能層：擴散層、試劑層、指示劑層和支持層。每個試劑片的層數(shù)視所采用的分析方法而定，干片的大小大致與一枚郵票相同，顯色劑層呈現(xiàn)的顏色深淺與待測物濃度成正比。 擴散層：擴散層的概念最早是由柯達研究實驗室Edwin Przyby

4、lowic博士提出的，是由TiO2,BaSO4和醋酸纖維素構(gòu)成的100-300微米的多空聚合物，聚合物的孔徑在1.530微米之間。擴散層的孔徑和厚度將取決于特定分析的需要。擴散層的中空體積占40%90%，這種毛細網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能使樣品溶液快速、均勻地分布到下層。當(dāng)一滴樣品約10微升加在試劑片上后，毛細作用將樣品迅速吸入多空擴散層，但樣品在一瞬間被下面的凝膠層所排斥，因為凝膠層在接受血清組份之前，必須先生成水合物。 擴散層不僅可阻留細胞，結(jié)晶和其他小顆粒，它也可以根據(jù)需要讓大分子，如蛋白質(zhì)等滯留。當(dāng)待檢樣品通過擴散層后，可以消除溶液中影響檢測反應(yīng)干擾物質(zhì)。擴散層中的TiO2和 BaSO4.一方面可用來

5、掩蓋待檢樣品中的有色物質(zhì)，使反射光度計的測定結(jié)果不受影響，同時這些反光化合物也給干片底層的顯色層提供反射背景。在一些特定試劑片中，擴散層中還含有選擇性阻留某種成份或啟動某種反應(yīng)的物質(zhì)，以提高分析的特異性。 試劑層：在化學(xué)試劑層中，根據(jù)實際測定的需要，可由數(shù)層至數(shù)十個功能試劑層組成。反應(yīng)區(qū)的功能是將待測物通過物理、化學(xué)或生物酶學(xué)等反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可與顯色劑結(jié)合的化合物。試劑層中按照反應(yīng)的順序涂布了不同的化學(xué)試劑，使反應(yīng)按照預(yù)先的設(shè)定依次進行。針對不同檢測項目的個性化設(shè)計為化學(xué)反應(yīng)提供了最理想的物理和化學(xué)反應(yīng)環(huán)境這就是為什么干化學(xué)技術(shù)能夠確保更準確的試驗結(jié)果。尿酸干片是使用清除劑層的一個示例。清除劑層含

6、有抗壞血酸氧化酶，用于將抗壞血酸（維生素 C）（一種內(nèi)源性干擾物）轉(zhuǎn)化，對試劑層中所發(fā)生反應(yīng)不產(chǎn)生干擾。 指示劑層：反應(yīng)底物進入指示劑層，在這里發(fā)生顯色反應(yīng)。此層包含染料或相似的指示劑，使反應(yīng)產(chǎn)物到達指示劑層后生成了有色化合物，其顏色變化與分析物濃度成比例，被反射光檢測。支持層：此層是透明塑料制成，起到支持其它層的作用，且允許光線百分之百透射，以便對有色復(fù)合物進行測量。 顏色變化通過反射光檢測，由于光線不通過已經(jīng)被阻留在擴散層上的潛在干擾物，從而避免了對檢測結(jié)果的干擾。因為多層的設(shè)計，不同的項目加入了特殊的試劑層增強反應(yīng)的特異性，干化學(xué)具有優(yōu)異的抗干擾能力。結(jié)合非結(jié)合膽紅素 (BuBc) 干片

7、是使用屏蔽層的一個示例。屏蔽層可有效阻隔可能的干擾成分（例如，血紅蛋白）以防其進入擴散層，從而防止它們影響測量結(jié)果。1.2直接選擇性電極離子檢測干片 離子（鈉，鉀，氯）檢測是干化學(xué)檢測項目中的傳統(tǒng)優(yōu)勢項目，采用離子法干片。其設(shè)計采用直接電勢法，樣本無需稀釋。離子干片是由紙橋?qū)蓚€離子選擇性電極相連，通過電壓表來測量患者樣本和已知參比液之間的電勢差，從而計算出鈉，鉀，氯的離子濃度。1.3免疫速率法干片免疫速率法干片主要用于進行藥物濃度和蛋白質(zhì)檢測，分為競爭法和非競爭性干片兩類。I.競爭法（例如地高辛） 讀數(shù)時采用了多點速率法來檢測分析物濃度。分析物與酶標(biāo)抗原競爭有限數(shù)量的抗體結(jié)合位點。加入含底物

8、的免疫洗液，一方面洗去未結(jié)合物質(zhì)，另一方面抗原抗體復(fù)合物與無色底物反應(yīng)顯色以670nm波長加入免疫洗液并孵育2.5min后讀數(shù)；通過速率的變化采計算分析物濃度，發(fā)射光密度與分析物濃度成反比。II.非競爭法（CRP） 讀數(shù)時采用定點速率法。待測物與固相抗體、酶標(biāo)抗體形成夾心“三明治”。加入含底物的免疫洗液后洗去讀數(shù)視窗區(qū)域未結(jié)合物質(zhì)，抗原抗體結(jié)合物與底物反應(yīng)顯色，孵育2.5分鐘時讀數(shù)670nm發(fā)射光密度與待測物濃度成正比。1反射光度法的原理干化學(xué)分析法的理論基礎(chǔ)反射光度法依據(jù)反射介質(zhì)不同，有多種理論。光線進入介質(zhì)后出現(xiàn)下列效應(yīng)：在照射表面產(chǎn)生反射（和折射）內(nèi)部吸收在內(nèi)部或照射表面產(chǎn)生散射 這些效

9、應(yīng)的總和決定了光再離開介質(zhì)的比率和方向。反射光密度與分析物濃度不呈線性關(guān)系的原因是檢測到的光信號包含了反射光和散射光。光通過各層干片時，干片內(nèi)部各個層和表面會產(chǎn)生散射和反射。 檢測比色/速率和免疫速率法干片時采用的是反射分光光度法。強生干化學(xué)技術(shù)反射光理論是Williams,Clapper等提出的。在儀器內(nèi)部光源發(fā)出一束光透過透明支持層，在試劑層光被有色化合物部分吸收后，在擴散層提供的反射面被反射，反射光經(jīng)濾光裝置后回到光度檢測器被讀數(shù)。光密度由此被轉(zhuǎn)化為電壓讀數(shù)，并計算成分析物濃度。 干化學(xué)技術(shù)中入射光（IO）100%進入干片。有色物質(zhì)吸收一定比例光后反射。反射法檢測反射光（IR），反射比為

10、R= Ir/Io 反射光密度（DR）公式為DR=log10 反射法中，分析物濃度與DR不成比例關(guān)系。 C不等于Ao（截距）+A1（斜率）*DR 雖然不呈線性關(guān)系，但是結(jié)果仍然可以預(yù)測。嚴密的研究建立了患者標(biāo)本濃度與反射光密度間的數(shù)學(xué)關(guān)系。通過一個函數(shù)就可完成二者間轉(zhuǎn)換。函數(shù)關(guān)系是使用前通過定標(biāo)盤載入檢測系統(tǒng)，通過函數(shù)實現(xiàn)每種測試項目的轉(zhuǎn)換。通用定標(biāo)模式 這是用來把儀器檢測光密度與分析物濃度建立關(guān)聯(lián)的通用公式。A0、A1、A2是未知的，需經(jīng)定標(biāo)程序計算得出。g(DR)是將檢測光密度與分析物濃度關(guān)系線性化的轉(zhuǎn)化函數(shù)。K在每項測試中是已知常數(shù)。 將DR轉(zhuǎn)換成g(DR)，轉(zhuǎn)換函數(shù)是出廠時由大量該儀器反

11、復(fù)研究得出的，確保了g(DR)與濃度呈線性關(guān)系。許多分析項目用了二條曲線來完成分析物濃度的轉(zhuǎn)換。 “DR”曲線及“函數(shù)轉(zhuǎn)換”曲線，二者在通過原點的直線上相交幾點可以看到二者呈鏡像關(guān)系。將它們疊加后，結(jié)果將全部落在直線上。正是引入“函數(shù)轉(zhuǎn)換”的目的。當(dāng)然，此圖8只是為了便于理解而畫的比較規(guī)律，實際更為復(fù)雜。 函數(shù)轉(zhuǎn)換曲線與定標(biāo)曲線是相對應(yīng)的，當(dāng)DR為1.0時則轉(zhuǎn)化為g(DR)校正讀數(shù)為1.3，當(dāng)DR為0.6時，校正讀數(shù)應(yīng)為0.4。g(DR)與通用定標(biāo)模式每個定標(biāo)品的g(DR)值都定義在通用定標(biāo)模式中，方程式A（圖9）已知值和未知值定標(biāo)中的已知值有： C：三個是標(biāo)品的已知濃度，是通過定標(biāo)盤載入儀器

12、的 DR：從干片測得 K：每種項目固定不變由定標(biāo)載入雖未知但可計算出，是定標(biāo)參數(shù)： A0=截距 A1=斜率 A2=曲率 通過廠家的設(shè)置和用戶端的定標(biāo)操作，每個標(biāo)本的結(jié)果就可以通過光信號值計算得到。 反射光的反射背景是擴散層，光線不通過已經(jīng)被阻留在擴散層上的潛在干擾物，從而避免了對檢測結(jié)果的干擾。這是擴散層承擔(dān)排除干擾的基礎(chǔ)。 由試劑片的結(jié)構(gòu)和反射光檢測技術(shù)可見涂層技術(shù)相對于溶液化學(xué)分析技術(shù)具有很多優(yōu)點：在試劑片中化學(xué)反應(yīng)可以在個別物理分層中進行，如圖所示，前一反應(yīng)的產(chǎn)物可以繼續(xù)進入另一層進行其他化學(xué)反應(yīng)，從而引導(dǎo)一個反應(yīng)序列，因此在多層復(fù)合薄膜中的各層可以給出一種特定的環(huán)境用以完成某種特定的反應(yīng)。這一點溶液化學(xué)分析是無法完成的，例如乳糜血的樣品，在進行溶液方式生化分析時，就需要先脫脂，然后進行分析，而利用多層復(fù)合膜技術(shù)，即可在一個薄膜上一次完成全部反應(yīng)，明顯提高了分析的特異性。同時由于沒有溶液對待檢樣品的稀釋作用，所以本方法也可大大提高了檢測的靈敏度。這種能夠?qū)嵤讉€連續(xù)的物理和或化學(xué)反應(yīng)而無需操作者介入的方法，就像計算機領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的芯片技術(shù)，可以使繁雜的實驗室儀器設(shè)備和各種器皿聯(lián)合完成的工作固化在一個多層復(fù)合薄膜上，極大的簡化了操作和提高重復(fù)性及穩(wěn)定性。因此，在短短的十幾年時間里，干化學(xué)技術(shù)即在世界各臨床化學(xué)實驗室廣為應(yīng)用。 經(jīng)過2