抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)

1、抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程概述：抗腫瘤藥物是指能夠直接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞生長或增殖的一類藥物，作用機(jī)制包括抑制腫瘤細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)的合成、干擾大分子物質(zhì)代謝、干擾微管系統(tǒng)、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶等。 本操作規(guī)程包括與抗腫瘤藥物申請臨床試驗(yàn)和申請上市有關(guān)的非臨床有效性和安全性研究的內(nèi)容，其中著力強(qiáng)調(diào)非臨床有效性和安全性之間的關(guān)聯(lián)性，以及非臨床研究和臨床試驗(yàn)之間的關(guān)聯(lián)性。旨在一方面為抗腫瘤藥物的非臨床研究提供技術(shù)參考；另一方面，通過技術(shù)要求引導(dǎo)科學(xué)有序的研發(fā)過程，使國內(nèi)此類藥物的研發(fā)更趨規(guī)范和合理。 本操作規(guī)程僅代表目前對抗腫瘤藥物非臨床研究的一般性認(rèn)識。具體藥物的非臨床研究應(yīng)在本指導(dǎo)原則的基礎(chǔ)上，根

2、據(jù)藥物的自身特點(diǎn)制訂研究方案。研究目的：建立一套包括抗腫瘤藥物體內(nèi)作用的藥效學(xué)研究和評價體系及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程以及抗腫瘤藥物安全性和作用新機(jī)制的研究。 有效性研究抗腫瘤藥物有效性研究的目的主要在于探索受試物的作用機(jī)制、作用強(qiáng)度、抗瘤譜等，為之后的安全性評價以及臨床試驗(yàn)中適應(yīng)癥、給藥方案的選擇提參考信息。 安全性評價安全性評價的目的主要包括：（1）估算 I 期臨床試驗(yàn)的起始劑量；（2）預(yù)測藥物的毒性靶器官或靶組織；（3）預(yù)測藥物毒性的性質(zhì)、程度和可逆性；（4）為臨床試驗(yàn)方案的制訂提供參考。研究計劃：(a)小鼠急性毒性測試 按照急性毒性測試的常規(guī)方法，選用昆明種小鼠，通過腹腔注射方式給藥，測定體

3、外抗腫瘤活性突出的化合物的半數(shù)致死量（LD50），參考給藥小鼠體重變化情況，評價化合物的急性毒性，并確定小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性測試的給藥劑量。(b)小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性測試 根據(jù)動物體內(nèi)抗腫瘤活性測試的標(biāo)準(zhǔn)方法，選用昆明種小鼠，皮下接種肉瘤S180或肺癌H22瘤株，選擇體外活性突出且急性毒性較低的化合物，設(shè)定合適的劑量通過腹腔注射方式給藥，以臨床常用抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺作為陽性對照藥物，測定腫瘤生長抑制作為體內(nèi)活性評價指標(biāo)。(c)專利保護(hù)范圍內(nèi)的化合物的繼續(xù)合成申請保護(hù)范圍較大的專利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范圍，發(fā)現(xiàn)活性更強(qiáng)的化合物，并申請新的發(fā)明專利。并可針對具體化合物申請從

4、屬專利，延長高活性化合物的保護(hù)期限。（d）體外抗腫瘤活性的廣泛篩選 采用MTT法或臺盼藍(lán)染色法，測定化合物對多種人腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制活性，確定化合物在不同瘤株間抗腫瘤活性的選擇性，為裸鼠模型實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。（e）抗腫瘤作用機(jī)理的深入研究 根據(jù)抗腫瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)活性化合物作用機(jī)理特征，選用微管蛋白聚合等實(shí)驗(yàn)從分子水平確認(rèn)化合物的作用機(jī)理；利用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞探討化合物對內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響及誘導(dǎo)凋亡的途經(jīng)，從細(xì)胞水平上闡明化合物的作用機(jī)理。 根據(jù)抗腫瘤新藥審批辦法的要求，采用裸小鼠皮下接種模型和/或原位移植瘤模型，以相對腫瘤增值率和生存時間為指標(biāo)，確定化合物的抗腫瘤活性。（g）

5、動物體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)實(shí)驗(yàn) 選擇在人癌裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)中活性良好的化合物，開展動物體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，考查化合物的吸收、分布、代謝、排泄性質(zhì)。（h）動物亞急性，長毒實(shí)驗(yàn) 根據(jù)抗腫瘤新藥審批辦法的要求，測定動物亞急性、長毒性質(zhì)，進(jìn)行藥物安全性評價?；痉椒ǎ盒“资蟮墓辔阜?以左手捉持小白鼠，使腹部朝上，右手持灌胃器。灌胃器先從小白鼠口角插入口腔內(nèi)，然后沿著上顎壁輕輕插入食管，稍感有阻力時（大約灌胃管插入1/2，相當(dāng)于食管過膈肌的部位），即可推進(jìn)注射器，進(jìn)行灌胃（圖1）。若注射器推進(jìn)困難，應(yīng)重插。若灌胃器誤插入氣管給藥，可致小白鼠死亡。注藥后輕輕抽出灌胃管。此法1次給藥量為0.01-0.03

6、ml/g。 圖1.小白鼠的捉持及其灌胃法小白鼠皮下注射法 通常在其背部皮下注射。將其皮膚拉起，注射針刺入皮下，把針尖輕輕左右擺動，易擺動表示已刺入皮下，然后注射藥液。拔針時，以手指捏住針刺部位，以防止藥液外漏（圖2）。該法對小白鼠的1次注射藥量為0.01-0.03ml/g。圖2.小白鼠的皮下注射法小白鼠靜脈注射法 一般采用尾靜脈注射法。事先將小白鼠或大白鼠置于固定的筒內(nèi)或鐵絲罩內(nèi)，或扣于燒杯內(nèi)，使其尾巴露出（圖3）。將尾置于45-50的溫水中浸泡或用75%的酒精棉球擦之，以使血管擴(kuò)張。然后，選擇尾巴左、右兩側(cè)靜脈進(jìn)行注射。注射時若出現(xiàn)隆起的白色皮丘，說明藥物未注入血管。這時，注射器應(yīng)向尾根部位

7、移動，重新注射。該法對小白鼠的1次注射量為0.005-0.01ml/g。圖3小白鼠尾靜脈注射法小白鼠腹腔注射法以左手捉持小白鼠，讓其腹部向上，右手將注射器針頭刺入皮膚，刺入部位距離下腹部腹白線稍向左或右的位置（圖4）。向前推進(jìn)注射器3-5mm,，接著使注射針與腹部皮膚面呈45刺入小白鼠的腹肌，繼續(xù)向前刺入，針頭通過腹肌進(jìn)入腹腔后阻力消失，這時即可慢慢注入藥液。對小白鼠的1次注射量為0.01-0.02ml/g。圖4.小鼠腹腔注射法實(shí)驗(yàn)動物的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)用較大動物如兔、貓、犬等可用特制的號碼牌固定于耳上。白色家兔和小鼠、大鼠,可用黃色苦味酸（3%-5%）涂于毛上標(biāo)號。其編號方法無統(tǒng)一規(guī)定，以下方法可供

8、參考。如給小鼠標(biāo)記1-10號，可將小鼠背部分前肢、腰部、后肢，按左、中、右分為九個區(qū),從右到左標(biāo)記1-9號，第10號不標(biāo)記（圖5a）。如給小鼠標(biāo)記1-20號，則（圖b）。1號右前肢 11號腰部及右前肢2號左前肢 12號腰部及左前肢3號左后肢 13號腰部及左后肢4號右后肢 14號腰部及右后肢5號頭部 15號腰部及頭部6號頭部及右前肢 16號腰、頭部及右前肢7號頭部及左前肢 17號腰、頭部及左前肢8號頭部及左后肢 18號腰、頭部及左后肢9號頭部及右后肢 19號腰、頭部及右后肢10號腰部（背中間 20號尾根部圖5.小鼠、大鼠皮毛標(biāo)記編號法(a) 小鼠急性毒性測試目的：測定LD50了解受試物的毒性強(qiáng)度

9、、性質(zhì)和可能的靶器官，為進(jìn)一步進(jìn)行毒性試驗(yàn)的劑量和毒性觀察指標(biāo)的選擇提供依據(jù)，并根據(jù)LD50進(jìn)行毒性分級。結(jié)果判定：如LD50小于人的可能攝入量的100倍，則放棄該受試物。如LD50大于或等于100倍者，則可考慮進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗(yàn)。 如動物未出現(xiàn)死亡的劑量大于或等于10g/kg BW（涵蓋人體推薦量的100倍），則可進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗(yàn)。 對人的可能攝入量較大和其它一些特殊原料，按最大耐受量法給予最大劑量動物未出現(xiàn)死亡，也可進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗(yàn)。范圍：本方法規(guī)定了急性毒性試驗(yàn)的基本技術(shù)要求。術(shù)語和定義：下列術(shù)語和定義適用于本方法。半數(shù)致死量（LD50）是經(jīng)口給予受試物后，預(yù)期能夠引起動

10、物死亡率為50%的單一受試物劑量，該劑量為經(jīng)過統(tǒng)計得出的估計值。其單位是每公斤體重所攝入受試物質(zhì)的毫克數(shù)、克數(shù)或毫升數(shù)，即mg/kg BW、g/kg BW 、mL/kg BW。最大耐受劑量法(MTD)：用最大使用濃度和最大灌胃容量給予20只動物后，連續(xù)觀察7-14天，未見任何動物死亡，則MTD大于*g/kg BW。原理經(jīng)口一次性給予或24h內(nèi)多次給予受試物后，在短時間內(nèi)觀察動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，包括致死的和非致死的指標(biāo)參數(shù)，致死劑量通常用半數(shù)致死劑量LD50來表示。實(shí)驗(yàn)動物一般均分別用兩種性別的成年小鼠或大鼠。小鼠體重為18-22g，大鼠體重為180-220g。如對受試物的毒性已有所了解，還應(yīng)

11、選擇對其敏感的動物進(jìn)行試驗(yàn)，如對黃曲霉素選擇雛鴨。動物購買后適應(yīng)環(huán)境3-5天。操作步驟受試物的處理：受試物應(yīng)溶解或懸浮于適宜的介質(zhì)中。一般采用水或食用植物油作溶劑，可以考慮用羧甲基纖維素、明膠、淀粉等配成混懸液；不能配制成混懸液時，可配制成其它形式（如糊狀物等）。必要時可采用二甲基亞砜。但不能采用具有明顯毒性的有機(jī)化學(xué)溶劑。如采用有毒性的溶劑應(yīng)單設(shè)溶劑對照組觀察。受試物的給予途徑：經(jīng)口。試驗(yàn)前空腹：動物應(yīng)隔夜空腹（一般禁食16h左右，不限制飲水）。容量：各劑量組的灌胃容量相同（ml/kg BW），小鼠常用容量為20 mL/kg BW；大鼠常用容量為10ml/kg BW。 方式：一般一次性給予受

12、試物。也可一日內(nèi)多次給予（每次間隔4-6h，24內(nèi)不超過3次，盡可能達(dá)到最大劑量，合并作為一次劑量計算）。常用的急性毒性試驗(yàn)設(shè)計方法霍恩氏（Horn）法預(yù)試驗(yàn)：可根據(jù)受試物的性質(zhì)和已知資料，選用下述方法：一般多采用0.1、1和10g/kg BW的劑量，各以2-3只動物預(yù)試。根據(jù)24內(nèi)死亡情況，估計LD50的可能范圍，確定正式試驗(yàn)的劑量。也可簡單地采用一個劑量，如215mg/kg BW，用5只動物預(yù)試。觀察24h內(nèi)動物的中毒表現(xiàn)。如癥狀嚴(yán)重，估計多數(shù)動物可能死亡，即可采用低于215mg/kg BW的劑量系列，反之癥狀較輕，則可采用高于此劑量的劑量系列。如有相應(yīng)的文獻(xiàn)資料時可不進(jìn)行預(yù)試。動物數(shù)：一

13、般每組用5只。常用劑量系列： 1.002.1510t t=0,1, 2, 34.64因?yàn)閯┝块g距較1.00/3.1610t t=0,1, 2, 3為小，所以結(jié)果較為精確。一般試驗(yàn)時，可根據(jù)上述劑量系列設(shè)計)個組，即較原來的方法在最低劑量組以下或最高劑量組以上各增設(shè)一組，這樣在查表時容易得出結(jié)果。 正式試驗(yàn)：將動物在實(shí)驗(yàn)動物房飼養(yǎng)觀察3-5天，使其適應(yīng)環(huán)境，證明其確系健康動物后，進(jìn)行隨機(jī)分組。給予受試物后一般觀察7或14天，若給予后的第4天繼續(xù)有死亡時，需觀察14天，必要時延長到28天。記錄死亡數(shù)，查表求得LD50，并記錄死亡時間及中毒表現(xiàn)等。 該方法的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是簡單易行，節(jié)省動物；缺點(diǎn)是所

14、得LD50的可信限范圍較大，不夠精確。但經(jīng)多年來的實(shí)際應(yīng)用與驗(yàn)證，同一受試物與寇氏法所得結(jié)果極為相近。因此對其測定的結(jié)果應(yīng)認(rèn)為是可信與有效的。 最大耐受量試驗(yàn)：適宜條件：有關(guān)資料顯示毒性極小的或未顯示毒性的受試物，給予動物最大使用濃度和最大灌胃容量的受試物時，仍不出現(xiàn)死亡。 動物：至少雌、雄各10只。劑量：受試物最大使用濃度和灌胃容量（一個劑量組）。方法：動物購買后觀察3-5天，給予最大使用濃度和最大灌胃容量的受試物（一日內(nèi)1次或多次給予，一日內(nèi)最多不超過3次），連續(xù)觀察7-14天，動物不出現(xiàn)死亡，則認(rèn)為受試物對某種動物的經(jīng)口急性毒性劑量大于某一數(shù)值（g/kg BW）。最大灌胃容量小鼠為20

15、mL/kg BW，大鼠為20 mL/kg BW。(b) 小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性測試體內(nèi)試驗(yàn)用于確認(rèn)受試物對特定類型腫瘤細(xì)胞的殺傷或抑制作用，探索受試物產(chǎn)生藥效作用的給藥劑量、途徑、頻率、周期等。 體內(nèi)試驗(yàn)通常采用動物腫瘤移植模型和人癌移植模型。 由于動物腫瘤移植模型與臨床療效之間的相關(guān)性不強(qiáng)，僅可用于侯選化合物的初步篩選。通常情況下，以人癌移植模型試驗(yàn)結(jié)果來評價抗腫瘤藥物的有效性。1、 模型建立細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物臨床前體內(nèi)試驗(yàn)一般至少應(yīng)選用 6 種人癌移植瘤模型，其中應(yīng)包括 II期臨床試驗(yàn)中擬篩選的腫瘤組織類型。模型的建立和使用應(yīng)注意： 移植瘤復(fù)蘇后一般應(yīng)傳 2-3 代后再用于體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)；為了

16、保持移植瘤的生物學(xué)特性和遺傳特性，復(fù)蘇后移植瘤體內(nèi)傳代應(yīng)少于15-20 代。2、 試驗(yàn)設(shè)計腫瘤移植部位主要在皮下，也包括腹腔、腎囊下和原位等。通常待移植腫瘤生長至100-300mm3后將動物隨機(jī)分組給藥。 一般包括高、中、低 3個劑量的治療組、陽性對照組和陰性對照組。治療組受試物劑量的選擇應(yīng)能夠體現(xiàn)出藥物的量效關(guān)系， 高劑量不宜超過受試物的最大耐受劑量。 應(yīng)根據(jù)受試物的藥動學(xué)特點(diǎn)和毒性反應(yīng)等確定給藥頻率和周期；給藥途徑應(yīng)盡量與推薦臨床用藥的途徑相同。陽性對照藥一般應(yīng)滿足以下條件：（1）與受試物作用機(jī)制相同或相近；（2）對移植腫瘤敏感；（3）臨床廣泛應(yīng)用且療效確切。陽性對照藥的給藥方案應(yīng)能夠體現(xiàn)

17、出藥物的最佳治療作用，其劑量一般不宜超過最大耐受劑量。陰性對照組給予相應(yīng)的溶劑。 3、檢測指標(biāo) 推薦使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察受試物的抗腫瘤效應(yīng)。腫瘤直徑的測量次數(shù)根據(jù)移植瘤的生長情況而定，一般為每周 2-3次。在試驗(yàn)中還應(yīng)該觀測與藥物安全性有關(guān)的指標(biāo)，如動物體重增長和死亡率，將治療組的這些數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)治療對照組進(jìn)行比較，對于判斷藥物的安全性和開發(fā)前景具有重要的意義。 試驗(yàn)中應(yīng)記錄檢測指標(biāo)的變化與給藥時間的關(guān)系，以便了解藥物的作用特點(diǎn)，減少單次記錄試驗(yàn)結(jié)果可能引起的誤差。體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果中還應(yīng)同時附有相應(yīng)的照片。4、評價標(biāo)準(zhǔn) 對于體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的評價應(yīng)綜合考慮受試物的作用機(jī)制、模型的臨床相關(guān)性

18、、 每一種模型的具體試驗(yàn)結(jié)果以及受試物與陽性對照藥物試驗(yàn)結(jié)果的比較。 針對每一種人癌移植瘤模型， 推薦采用相對腫瘤增殖率T/C （%）作為試驗(yàn)評價指標(biāo)，評價標(biāo)準(zhǔn)通常為：T/C（%）40 %為無效；T/C（%） 40%，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理 P 0.05 為有效。在體內(nèi)有效性試驗(yàn)采用的全部人癌移植模型中，一般至少應(yīng)有1/3 達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)，才提示藥物有必要進(jìn)入臨床試驗(yàn)。在評價時還應(yīng)關(guān)注受試物與陽性對照藥試驗(yàn)結(jié)果的比較。在毒性相當(dāng)（在有效性研究中主要表現(xiàn)為動物體重下降相當(dāng)）的情況下，對受試物治療組和陽性對照藥組腫瘤增殖率的比較也是評價受試物是否有必要進(jìn)入臨床試驗(yàn)的指標(biāo)之一。附：相對腫瘤增殖率T/C（%）

19、：針對每一種人癌移植瘤模型的抗腫瘤活性評價指標(biāo)。計算公式如下：T/C % = TRTV / CRTV*100%。（TRTV：治療組RTV ；CRTV：陰性對照組RTV）。 腫瘤體積(tumor volume,TV)的計算公式為：V = 1/2ab2 或/6abc。其中a、b、c分別表示長寬高。由于此兩公式的相關(guān)性極好，可采用任一公式。根據(jù)測量的結(jié)果計算出相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV） ，計算公式為： RTV = Vt / V0。其中V0為分籠給藥時(即d0)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。鼠S180移植瘤的抑制作用實(shí)驗(yàn)1 材料與方法1.1 材

20、料1.1.1 實(shí)驗(yàn)用藥物1.1.2 動物及瘤株肉瘤S180；實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠18-22 g。1.1.3 儀器設(shè)備灌胃器、手術(shù)器械、天平、離心機(jī)1.2 方法1.2.1 腫瘤模型建立小鼠S180細(xì)胞接種于昆明種小鼠腹腔后，取腹水傳代保存。取腹水傳代第7日荷瘤小鼠，脫頸椎處死小鼠，消毒腹部皮膚，無菌注射器吸取乳白色腹水，用生理鹽水調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為1107 /mL，用酒精棉球消毒昆明種小鼠右側(cè)腋下皮膚，于皮下接種上述瘤細(xì)胞懸液（0.2 mL/只），常規(guī)飼養(yǎng)。1.2.2 藥物對小鼠S180的抑制作用昆明種小鼠50只，腋下接瘤，次日將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為模型組、環(huán)磷酰胺（CTX）組、藥

21、物高、中、低劑量組。干后,稱取瘤重，計算抑瘤率：小鼠接瘤后第二日開始按表1所示劑量和方式給藥，CTX組于接瘤后第2日給藥，隔天一次，藥物組每日給藥一次，連續(xù)10天，給藥體積為0.2 ml/20g體重。末次給藥24小時后，脫頸椎處死小鼠，剝?nèi)×鼋M織,去除血污、脂肪等非腫瘤組織，用濾紙吸抑瘤率%=（1給藥組平均瘤重/ 對照組平均瘤重）100 %表1 荷瘤小鼠給藥劑量和方式組別劑量（mg/kg B.W.）給藥方式模型CTX20腹腔注射藥物高灌胃中灌胃低灌胃1.2.3 對荷瘤小鼠免疫器官的影響動物接種S180瘤株為第0天，第1天開始灌胃，連續(xù)灌胃10天 ，第11天處死動物，準(zhǔn)確稱量動物體重、胸腺重量、

22、脾臟重量，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，臟器指數(shù)= 臟器重量/體重。表2 藥物對免疫指數(shù)的影響(s)組別劑量(mg/kg B.W.)動物數(shù)（n）胸腺指數(shù)（110-3）脾指數(shù)（110-3）空白對照10CTX20 i.p.10藥物1010101.2.4腫瘤組織學(xué)觀察取部分瘤組織用10中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，經(jīng)蘇木精伊紅染色，光鏡觀察。 實(shí)驗(yàn)步驟固定液、染色液的配置固定液： (1)10%中性福爾馬林（pH7.0） 甲醛 100 ml NaH2PO4H2O 4 g Na2HPO4 13 g 蒸餾水 900 ml(2) Harris蘇木素: 配方： 蘇木素 1 g 無水乙醇 10 ml 蒸餾水 200

23、ml 鉀明礬 20 g HgO 0.5 g 先將蘇木素溶于無水乙醇中，備用。把明礬放入蒸餾水，加熱溶解，再加入備用的蘇木素，煮沸 2 分鐘，先加入少量的氧化汞，防止氧化過程中蘇木素外溢，玻棒攪拌，然后，邊攪拌邊加入氧化汞。加完后，立即移至冰水中，加速其冷卻，靜置一夜后，過濾。用前以 5% 的比例加入冰醋酸。 (3)伊紅（醇溶性） 配方： 伊紅 （醇溶性） 2.5-5g 75%酒精 1000 ml 加幾滴冰醋酸至半透明狀。 伊紅有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，應(yīng)該在脫水前進(jìn)行染色，如果是醇溶的，應(yīng)使用與溶解伊紅等濃度的酒精開始脫水。(4)鹽酸酒精分化液： 濃鹽酸0.51 ml 75%酒精99

24、 ml(5) 蛋白甘油： 蛋白甘油是粘貼蠟片用的粘片劑。配方如下：取一新鮮雞蛋的蛋白，充分?jǐn)嚢璩裳┗钆菽?，然后濾去泡沫，加入等量甘油，攪拌均勻，再加入一小粒麝香草酚防腐。實(shí)驗(yàn)用具：解剖器一套、單面刀片、切片刀、切片機(jī)、載玻片、蓋玻片、標(biāo)本瓶、燒杯、量筒、漏斗、染色缸、樹膠瓶、酒精燈、毛筆、繪圖紙、濾紙、熔蠟箱（或恒溫箱）、展片臺（或燙板）、小木塊、蠟帶盒、烤片盒、切片托盤。病理標(biāo)本的采集和制作(l)取材脫頸椎處死小鼠，剝?nèi)×鼋M織,去除血污、脂肪等非腫瘤組織。(2)固定與修塊迅速將胰腺放入4%中性甲醛(用PH 7.0一7.2的磷酸緩沖液配制)中固定48小時，組織塊的直徑應(yīng)小于7mm。(3)脫水

25、與透明在以下過程，要求經(jīng)?；蝿咏M織塊，以保證組織塊可以充分地與乙醇或二甲苯接觸，在每一步驟之后，要充分濾干組織塊，一般用筒紙吸干組織塊上的液體，以免影響其他液體的濃度，但要防止組織塊干燥。全過程約需要4.5h（270min）。175%乙醇 50min285%乙醇 50min395%乙醇 （I） 30min495%乙醇 （II） 30min5100%乙醇（I） 30min6100%乙醇（II） 30min 7 1/2 二甲苯（乙醇與二甲苯等體積） 20min8二甲苯（I） 20min9二甲苯（II） 10min（可依據(jù)透明效果而定） 透明效果的判斷：如組織塊顏色加深透明，二甲苯溶液顏色透明，即表

26、明脫水效果很好；如脫水不好，二甲苯溶液顏色會變混濁。使用過的酒精或二甲苯倒入燒杯里以便回收。(4)浸蠟、包埋與修蠟塊1浸蠟：可在脫水與透明進(jìn)行時，將60恒溫箱打開，使大燒杯內(nèi)的石蠟充分溶解，待脫水與透明結(jié)束后，可將脫水籃整個或包裹在紗布內(nèi)的組織塊轉(zhuǎn)入充分溶解的石蠟里，于60恒溫箱放置120分鐘。 2包埋：包埋有多種器具，比較簡潔廉價的方法是采用紙盒?？稍诮灥耐瑫r將紙盒做好，包埋時將60的石蠟倒入紙盒內(nèi)，然后用小鑷子將各組織塊按一定的順序排列好，使切面朝下。我們建議，不同組別的同一組織包埋于一個蠟塊中，以保證切片和染色條件一致，且以便讀片和比較。為防止倒入紙盒內(nèi)的石蠟底部立刻凝固，可將紙盒置于

27、一玻璃板上（或大培養(yǎng)皿內(nèi)），然后將玻璃板置于80-90左右熱水上，包埋時蠟盒底部要放平，做蠟塊的蠟要反復(fù)凍融較好。組織包埋方法可參見表2。3修蠟塊：待紙盒內(nèi)蠟?zāi)毯?若需要使蠟塊迅速凝固，可將包埋好的蠟塊置于4冰水混和物中)。將蠟塊取出，用刀片將其修成梯形，通常蠟塊大小視組織多少而定，為保證切片順利，組織塊與蠟塊邊緣之間的距離不得小于2mm。修剪下來的殘蠟應(yīng)回收，以便再用。(5)切片在載玻片上擦少量甘油蛋白?？傻伟氲胃视偷鞍子谳d玻片上，用手指充分抹勻，呈半干狀為佳。切片厚約48m，通常厚約6m，細(xì)胞小而密的組織如胸腺，可以切45m，而細(xì)胞疏的組織，如下丘腦可切10m。將切片在55左右水浴中展開

28、，展開程度以帶黃顏色的組織完全攤平為準(zhǔn)。用涂有甘油蛋白的載玻片從水浴中撈取切片，斜放在木架上，立即放入37烘箱中過夜，一般時間越長效果越好，以切片緊貼于載玻片上呈半透明狀為佳。每個組織塊撈片2張。過夜后，將載玻片置于玻片架上，進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。(6)脫蠟、染色與脫水取出玻片架后，應(yīng)將玻片架傾斜，以使載玻片上的試劑流盡，然后用筒紙將玻片架和載玻片下緣的試劑吸干，以免影響其他試劑的濃度。全過程約需要50min。1脫蠟到水（1）二甲苯（I） 15分鐘（2）二甲苯（II） 15分鐘（3）100%乙醇 2分鐘（4）95%乙醇（I） 1分鐘（5）95%乙醇（II） 1分鐘（6）蒸餾水浸洗 1分鐘2染色（7）

29、蘇木精 30秒鐘（8）自來水沖洗1分鐘，但應(yīng)注意不能用水直接沖在玻片上，以免沖走切片。（顯微鏡下觀察效果）（9）伊紅（著色即可） 10秒鐘（10）蒸餾水浸洗 1分鐘3脫水（10）95%乙醇（I）1分鐘（11）95%乙醇（II） 1分鐘（12）100%乙醇 2分鐘（13）二甲苯（I） 2分鐘（14）二甲苯（II） 35分鐘(7)封片將載玻片從玻片架上取下，滴加12滴中性樹膠，用眼科鑷夾住蓋玻片的一角，輕輕蓋上蓋玻片，讓中性樹膠沿著蓋玻片充分展開，之后傾斜載玻片，用筒紙將多余的中性樹膠吸干，同時注意避免有氣泡的產(chǎn)生，平放載玻片，室溫下長期保存。1.2.5 數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個平行組或重復(fù)3次，結(jié)

30、果以s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件對各組數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)間差異顯著性水平進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。注意事項(xiàng)關(guān)于腹水傳代，觀察到第一代的種鼠肚子較大后（一般約8-9天左右），可以傳代，傳代時取1ml注射器，用2ml注射器的針頭，種鼠腹部消毒后直接將針頭插入抽取 腹水即可，注意不要把針頭插得很深，盡量淺一點(diǎn)，還可以把老鼠拎起來，利用重力，讓腹水集中在某處便于抽取，一般抽個0.5ml就可以了，不用離心，直接 用PBS 3-6倍稀釋后，接種到新的老鼠腹腔，腹水顏色為白色或者略有發(fā)黃都是正常的，但是血性腹水說明不好，需要注意調(diào)整，第二代以后，盡量6-7天的時候傳代，不要等的時間太久，否則腹水容易血性。三代后可

31、用于試驗(yàn)。關(guān)于接種進(jìn)行試驗(yàn)，這個時候抽取的腹水需要量比較多，一般需要處死種鼠后，小心地用消毒眼科剪刀鑷子剝開腹部皮膚，注意不要弄破肌肉，然后，用鑷子拎起腹部的肌肉，用剪刀剪開一個小口，然后用玻璃滴管或者去掉針頭的注射器吸取腹水。稀釋后，接種到小鼠的 腋下。關(guān)于稀釋量，最好摸索一下，開始的時候可以適當(dāng)?shù)挠嫈?shù)，污染。但是要用臺盼蘭染色后計活細(xì)胞數(shù)。接種部位在小鼠腋下，但是不要 深入到腋窩里面，會給以后的操作帶來麻煩。接種時的進(jìn)針處離接種處遠(yuǎn)一點(diǎn)，讓針頭在皮下多走一段，不容易細(xì)胞接種量控制在1106 /只時，小鼠腹水出現(xiàn)情況一般如下：56 d出現(xiàn)腹水，79 d抽取傳代最好，1012 d出現(xiàn)血性腹水，

32、1415 d小鼠開始死亡。如果動物固定不佳, 注射腫瘤細(xì)胞時針頭在皮下來回游動, 結(jié)果是腫瘤長成后不能成為一個球形或半球形, 而是成為有幾個小瘤體組成的長條或者不規(guī)則形狀。關(guān)于觀測指標(biāo)，主要是按時稱體重，試驗(yàn)結(jié)束后剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。因?yàn)槌隽鲆呀?jīng)是接種后的第6天左右了，第10天就結(jié)束時間，瘤體積的數(shù)據(jù)意義就不大。按照SFDA的規(guī)定，平均瘤重小于1g，或者 單個瘤重小于200mg，認(rèn)為腫瘤生長不良，試驗(yàn)作廢。（d）體外實(shí)驗(yàn)法：用培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行。體外試驗(yàn)主要用于對候選化合物進(jìn)行篩選， 初步了解受試物的作用機(jī)制、敏感腫瘤類型和作用強(qiáng)度， 為隨后進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)提供參考。在體外培養(yǎng)的不同人腫瘤細(xì)胞系中

33、加入不同濃度的待測藥物， 采用磺酰羅丹明染色法（SRB法） 、四氮唑鹽還原法、集落形成法等方法進(jìn)行檢測，計算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50） ，并與標(biāo)準(zhǔn)治療藥物進(jìn)行比較，可以初步預(yù)測抗腫瘤藥物的抗瘤譜和作用強(qiáng)度。應(yīng)根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)理確定體外試驗(yàn)采用的研究方法。 例如，以線粒體為作用靶點(diǎn)的藥物不宜采用四氮唑鹽還原法。試驗(yàn)中，在選擇腫瘤細(xì)胞系時應(yīng)考慮到細(xì)胞的生長和增殖速率，一般至少應(yīng)選用 12 種人癌細(xì)胞系。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)的時間一般為4872 小時，貼壁細(xì)胞需先貼壁 24 小時后再給藥。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照組，陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥，陰性對照為溶媒對照。試驗(yàn)至少應(yīng)重復(fù)一次。1、噻唑藍(lán)

34、（MTT）法 在培養(yǎng)的活細(xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶可將黃色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的藍(lán)紫色的甲替，將甲替用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，利用酶標(biāo)儀（試驗(yàn)波長570nm，參比波長450nm）測定光密度值，按照公式 實(shí)驗(yàn)組光密度值腫瘤細(xì)胞生長抑制率（%）=（1 ）100% 對照組光密度值計算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。用系列濃度的藥物可制作腫瘤細(xì)胞生長抑制率的量效曲線。2、染料排斥法 本方法是根據(jù)活細(xì)胞具有排斥某些染料的功能，而死細(xì)胞因胞膜破壞而易于被染料著色的原理，在培養(yǎng)的對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液中加入伊紅、臺盼藍(lán)、或苯胺黑等染料，在室溫下放置5分鐘后，在15分鐘用血球計數(shù)板計數(shù)200

35、個細(xì)胞。根據(jù)公式未染細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞率（%）= 100% 細(xì)胞總數(shù)3、生長曲線法 本方法是根據(jù)腫瘤的Gompertzian生長曲線而設(shè)計。培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在初期為指數(shù)增殖期，隨著細(xì)胞密度的增加，因代謝產(chǎn)物的積聚和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，增殖趨于減緩乃至停止，進(jìn)入所謂的平臺期。在培養(yǎng)后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞計數(shù)，然后取細(xì)胞對數(shù)對培養(yǎng)時間作圖可獲細(xì)胞生長曲線。1）將生長曲線外延至Y軸可獲得截距No，用公式計算藥物對增殖細(xì)胞的殺傷力（No是對照組的的截距）2）用Nt代表接種后t小時的細(xì)胞數(shù)， 用公式TD = 0.301t / logNt - LogNo 計算藥物對細(xì)胞增增時間

36、（TD）的影響。3）取平臺期每毫升的細(xì)胞均數(shù)，比較細(xì)胞生長的飽合密度（Ns）。4、集落形成法 本方法利用分裂6代以上的克隆原單細(xì)胞子細(xì)胞可形成集落成簇（每簇細(xì)胞數(shù)50）的能力，比較藥物對單個腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。本方法有貼壁法和半固體培養(yǎng)法兩種。1）貼壁法 需要選用貼壁生長的細(xì)胞， 按500細(xì)胞/ml的濃度接種到35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)基，用瑞氏-姬姆薩染色后，在20解剖顯微鏡下計數(shù)含有50i個細(xì)胞的細(xì)胞集落。2）半固體軟瓊脂培養(yǎng)法 取對數(shù)生長的細(xì)胞，用含小牛血清的培養(yǎng)液稀釋成1000細(xì)胞/ml的懸液；溶化5%的瓊脂液，并按1：9的比例與含小牛血清的新鮮培養(yǎng)液混合，倒入35mm培養(yǎng)皿

37、（1ml/皿），室溫下待瓊脂凝固，取0.94ml的細(xì)胞懸液，加0.04ml的5%瓊脂, 加到已制備的瓊脂平皿中，室溫下凝固。移入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在16解剖顯微鏡下計數(shù)直徑大于75m的細(xì)胞集落。以集落形成抑制百分率對對數(shù)劑量作圖，可得“S”型曲線，從曲線上求取半數(shù)抑制濃度IC50；以集落的存活分?jǐn)?shù)與劑量作圖，可獲得克隆原細(xì)胞存活曲線，方程為S=1-(1-e-D/Do)n，S為存活分?jǐn)?shù)， D 為劑量， Do為存活分?jǐn)?shù)每下降1/e時所需的藥物劑量， n為外推值。Do越小， 藥物的殺傷力越大，N越大殺死細(xì)胞的藥物劑量越大。5、硫化若丹明B法（SRB）法 硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉紅色，

38、溶于水，可與生物大分子的堿性氨基酸結(jié)合，這種結(jié)合物在波長515nm時的讀數(shù)與細(xì)胞表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，可用于細(xì)胞的定量。測試的細(xì)胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB， 室溫下靜置， 然后去除未結(jié)合的SRB， 用非緩沖tris堿液溶解結(jié)合的SRB，在自動化分光光度平板讀數(shù)儀（515nm波長）測定OD值?？筛鶕?jù)下述公式計算: T - T0 生長率（%）= 100% C - T0C、T和To分別為對照組細(xì)胞，為給藥組細(xì)胞，另外的對照平板加藥時的細(xì)胞的OD值。 T - T0殺傷率(%) = 100% T T - T050%生長抑制所需的藥物濃度(GI50) = 100% C - T0 T - T0

39、殺死50%細(xì)胞所需的藥物濃度(LC50)= 100% T0（e）抗腫瘤作用機(jī)理的深入研究（一）藥物作用周期特異性研究進(jìn)行藥物作用細(xì)胞周期性實(shí)驗(yàn)必須首先制備同步化的細(xì)胞，常用的體外培養(yǎng)細(xì)胞同步化的方法有機(jī)械振蕩法、雙胸苷同步法、含羞草氨酸俘獲法和離心洗脫法。1、機(jī)械振蕩法 機(jī)械振蕩法分離同步化細(xì)胞是基于單層貼壁生長的細(xì)胞在進(jìn)入有絲分裂期時, 胞形變圓，松散地附在支持物上，利用搖晃或拍擊培養(yǎng)瓶可以剝離出這些細(xì)胞，利用此方法可以得到較純的M 期細(xì)胞。雙胸苷同步法的原理是先以高濃度的TdR處理細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的轉(zhuǎn)變，DNA復(fù)制受阻，S期細(xì)胞停滯在S 期，其它期細(xì)

40、胞積聚在G1/S邊界；撤TdR，讓原處于S期的細(xì)胞完全越過S期，再給予TdR，讓越過S期的細(xì)胞進(jìn)入G1/S邊界，然后撤去TdR，讓細(xì)胞重新生長，同時進(jìn)入S期。因此，本方法可以得到較純的S期細(xì)胞。2、含羞草氨酸俘獲法 含羞草氨酸可將細(xì)胞集結(jié)于G1/S邊界，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。在撤除含羞草氨酸后，細(xì)胞可同步進(jìn)入S 期。3、離心洗脫法 離心洗脫法的原理是進(jìn)入細(xì)胞周期的的體積呈線性增加。G1期細(xì)胞體積最小，離出口最近而被最先洗出。G2/M細(xì)胞體積最大離進(jìn)氣口最近而被后洗出。在上述同步化處理尚需配合以同步化程度的檢測，檢查的方法有兩種：流式細(xì)胞光度技術(shù)和放射性同位素技術(shù)。前者通過測定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來定量細(xì)

41、胞的DNA量； 后者則利用測定摻入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脫氧尿苷（BrdU）的量來獲知處于S 期的細(xì)胞量。（二）藥物抗微管作用 利用微管蛋白在37聚合，在冰浴上解聚的特點(diǎn)，測定微管蛋白或微管液的OD值，分別獲得S型的聚合曲線和倒S型的解聚曲線， 比較藥物對曲線的影響， 用下式計算抑制率。 實(shí)驗(yàn)組光密度值抑制率（%）=（1 - ）100% 對照組光密度值（三）藥物與DNA結(jié)合能力檢查 吸收光譜移動法 原理是DNA與藥物形成復(fù)合物后吸收光譜發(fā)生改變，吸收峰產(chǎn)生位移，位移波長隨DNA/ 藥物復(fù)合物的量增加而增加。利用紫外分光光度計進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，可觀察到這些改變。熒光光譜移

42、動法 原理是在激發(fā)光的激發(fā)下，DNA-藥物復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜發(fā)生改變，譜峰向短波方向移動，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，同時激發(fā)光譜說發(fā)生改變。用熒光分光光度計測定激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可觀察到這些變化。（四）藥物造成的DNA損傷彗星（Comet）微凝膠單細(xì)胞電泳法 正常的DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)， 在pH12.0時則完全解鏈。DNA受損后鏈斷裂, 成為一個松散的結(jié)構(gòu), 在電場的作用下,松散的DNA離開細(xì)胞核向正極移動, 形成彗星似的拖尾,變換不同pH緩沖液可檢測斷裂的是雙鏈還是單鏈。堿洗脫法 收集細(xì)胞于濾膜上，用細(xì)胞溶解液裂解細(xì)胞并洗去RNA和蛋白質(zhì)，暴露DNA，用洗脫液進(jìn)行洗脫，若DNA發(fā)生鏈斷裂，則易于經(jīng)濾膜

43、洗出。（五）藥物對DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是調(diào)節(jié)DNA空間結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化的關(guān)鍵性核酶，分成拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I可以造成DNA的單鏈斷裂，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II，可造成雙鏈斷裂，進(jìn)而干擾DNA的復(fù)制、重組和基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)的原理是用從腫瘤細(xì)胞核提取的拓?fù)洚悩?gòu)酶II處理PBR322DNA，后者是一種質(zhì)粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口狀和線性DNA三種形式，瓊脂糖電泳上顯示出三條帶，在拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下超螺旋DNA解旋、斷裂，電泳時超螺旋帶減弱或消失，相應(yīng)的缺口環(huán)狀或線性DNA增加。如果藥物對拓?fù)洚悩?gòu)酶具有抑制作用，則可見超螺旋帶保留。此方法亦可改進(jìn)為觀察藥物對拓?fù)洚悩?gòu)酶功能

44、的促進(jìn)和抑制作用。方法是選定不能使一定量DNA完全斷裂量的拓?fù)洚悩?gòu)酶處理PBR322DNA后電泳可見超螺旋帶，同時加入不同濃度的藥物，如果藥物抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶，則超螺旋帶增強(qiáng)，若藥物增強(qiáng)拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，則見螺旋帶減弱或消失。（六）藥物對細(xì)胞核酸代謝的影響 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素標(biāo)記前體物如3H-TdR，3H-UR可分別摻入到細(xì)胞DNA 和RNA中去， 用液閃法測定其同位素活性則可知細(xì)胞DNA和RNA 的合成情況。（七）藥物對腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過程，細(xì)胞凋亡時表現(xiàn)為細(xì)胞體縮小，染色質(zhì)濃縮成大小不等的塊狀，并裂解為小片段。DNA斷裂長

45、度為核小體核苷酸長度(180200堿基對)的整倍數(shù)，提取后普通的瓊脂糖電泳表現(xiàn)為特殊的云梯狀，凋亡小體形成。檢查細(xì)胞凋亡的方法有：1、熒光顯微鏡的形態(tài)學(xué)檢查 該方法是利用凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，DNA廣泛裂解的特征和熒光化合物可嵌入DNA分子或以靜電相互作用與DNA分子結(jié)合的原理，建立DNA的熒光探針。常用的方法是用Hoechst33342和PI聯(lián)合染色，然后在熒光顯微下用紫外光激發(fā)。凋亡的細(xì)胞對Hoechst33342具有高攝取比，加之染色質(zhì)的高度濃縮，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光；正常細(xì)胞呈微弱熒光，壞死細(xì)胞則呈紅色熒光（被PI染色）。2、流式細(xì)胞光度術(shù) 該方法的原理是用DNA結(jié)合性的熒光染料標(biāo)記DNA， 因

46、為細(xì)胞發(fā)生凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解、斷裂DNA，斷裂生成的小分子量DNA溢出細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)DNA總量降低，利用流式細(xì)胞光度術(shù)可以檢測出DNA的這種結(jié)構(gòu)和量的變化。3、瓊脂糖電泳分析法 利用該方法可檢測出呈云梯狀的寡聚核小體。（g）動物體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)實(shí)驗(yàn)了解受試物在體內(nèi)的吸收、分布和排泄速度以及蓄積性，尋找可能的靶器官：為選擇慢性毒性試驗(yàn)的合適動物種、系提供依據(jù)：了解代謝產(chǎn)物的形成情況。范圍本方法規(guī)定了代謝試驗(yàn)的基本技術(shù)要求。本方法適用于評價我國創(chuàng)新的化學(xué)物質(zhì)，或需要進(jìn)行三個階段毒性試驗(yàn)包括已知化學(xué)物質(zhì)或與已知化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相同的衍生物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化途徑及轉(zhuǎn)歸。 原理受試物在體內(nèi)可發(fā)

47、生一系列復(fù)雜的生化變化。受試物經(jīng)胃腸道吸收后通過血液轉(zhuǎn)運(yùn)到全身各組織器官，再經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化，由各種途徑排出體學(xué)結(jié)構(gòu)，測試其毒性并推測受試物在體內(nèi)的具體代謝途徑。通過本實(shí)驗(yàn)的觀察，對受試物在體外。因此，受試物原形物在逐漸被代謝降解，而其代謝產(chǎn)物不斷生成。測定灌胃后不同時間內(nèi)受試物原形物或其代謝物在血液、組織或排泄物中的含量，以了解該受試物在動物體內(nèi)的毒代動力學(xué)特征，包括吸收、分布、消除的特點(diǎn)，組織蓄積及可能作用的靶器官等，根據(jù)數(shù)學(xué)模型，求出各項(xiàng)毒代動力學(xué)參數(shù)。同時采用分離純化方法確定主要代謝產(chǎn)物的化內(nèi)的過程可作出正確評價，為闡明該受試物的毒作用性質(zhì)與程度提供科學(xué)依據(jù)。 儀器與試劑根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，配

48、備高效薄層色譜、高效液相色譜、氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用及紫外光、熒光檢測等儀器設(shè)備。 放射性測量儀器：液體閃爍計數(shù)儀及閃爍液。實(shí)驗(yàn)室常用儀器與試劑。試驗(yàn)動物原則上應(yīng)盡量使用與人具有相同代謝途徑的動物種系。一般選用兩種性別、體重為22-28g成年小鼠或170-220g大鼠。試驗(yàn)開始時動物體重的差異應(yīng)不超過平均體重的20%。劑量及分組選用低于最大未觀察到有害作用劑量，需要時可用高、低二種劑量。可單次或多次給予受試物。如采用標(biāo)記化合物，除確定化學(xué)劑量外，放射性劑量一般小鼠為10-20Ci/只（0.4-0.8MBq/只）、大鼠100-250Ci/kg（4-9MBq/只）。 操作步驟受試物配制：一般用蒸餾水作

49、溶劑，如受試物不溶于水，可用食用油、醫(yī)用淀粉、羧甲基纖維素配成乳濁液或懸濁液。受試物應(yīng)于灌胃前新鮮配制，除非有資料表明以溶液（或懸濁液、乳濁液等）保存具有穩(wěn)定性。給受試物途徑：以灌胃為主，灌胃前動物禁食16-18h，自由飲水。進(jìn)行毒代動力學(xué)分析時，最好同時采用灌胃和靜脈注射。試驗(yàn)項(xiàng)目：進(jìn)行代謝試驗(yàn)前，需建立測定生物樣品中受試物含量的微量化學(xué)分析方法或標(biāo)記受試物的同位素示蹤方法。a.血漿中受試物含量或放射性水平的測定：于動物灌胃后6-10個不同的時相采血，每個時相的動物數(shù)不應(yīng)少于3只。結(jié)果以每mL血漿中受試物含量或放射性強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，在半對數(shù)紙上作藥-時曲線。如以化學(xué)分析方法測定受

50、試物含量，用已編制的藥代動力學(xué)計算機(jī)程序進(jìn)行曲線擬合，按房室模型求出毒代動力學(xué)方程及各項(xiàng)代謝動力學(xué)參數(shù)。如用同位素示蹤法測定血漿總放射性水平，作代謝動力學(xué)分析時應(yīng)謹(jǐn)慎。b.胃腸道吸收：于灌胃后不同時間處死動物，取出胃腸道及其內(nèi)容物（包括糞）作成勻漿，測定受試物含量或放射性水平，以灌胃后即刻處死動物的胃腸道回收量為100%，分別觀察不同時相的各組動物中受試物或放射性自胃腸道消失的情況。以上述不同時相回收量的百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，在半對數(shù)紙上作圖，求得受試物或放射性在胃腸道的消失速率。為確定受試物在胃腸道的消失速率是否能反映在體內(nèi)的吸收情況，需進(jìn)行離體胃腸道溫孵試驗(yàn)，即將受試物注入離體胃腸

51、道后結(jié)扎兩端，于37 Krebs液中振蕩溫孵1h，測定受試物的回收率，以觀察受試物在胃腸道內(nèi)有無受到破壞，由此估計受試物在胃腸道的吸收速率。c.主要器官和組織中的分布：于灌胃后取-.!個不同時相處死動物，對肝、腎、腦等器官和組織進(jìn)行受試物含量或放射性測定，以找出受試物含量最高的組織和時間。d.排泄尿、糞排泄：給動物灌胃受試物后放入有機(jī)玻璃代射籠內(nèi)，于3-7天內(nèi)按規(guī)定時間收集尿和糞。如發(fā)現(xiàn)尿糞互混，則把標(biāo)本棄去再另收集。作代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析時應(yīng)把收尿容器放在冰浴中并注意避光。膽汁排泄：輕度乙醚麻醉下給動物施行膽道插管，待動物清醒后以受試物灌胃，收集不同時間的膽汁（不少于24h）。從不同時間收集的尿

52、、糞、膽汁標(biāo)本中的受試物含量或放射性強(qiáng)度，分別計算其累積排出量（占灌胃劑量的百分?jǐn)?shù)）。e.生物轉(zhuǎn)化：按受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和文獻(xiàn)資料，估計可能產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。給動物以受試物后，收集尿、膽汁等標(biāo)本，或在體外代謝條件下采用肝微粒體、酶活性系統(tǒng)和受試物于37振蕩培養(yǎng)，以提取、純化后進(jìn)行代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定。分析手段包括薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜、紅外光譜等。要有預(yù)測的代謝物純品作標(biāo)準(zhǔn)。如采用標(biāo)記化合物，樣品經(jīng)薄層色譜分離后用放射性薄層掃描儀或分段刮下硅膠測定放射性，由Rf值判定并測量受試物的量及可能的代謝產(chǎn)物，再作進(jìn)一步分析。從代謝物的分離與鑒定，對受試物在體內(nèi)的可能代謝途徑作出推斷。同位素實(shí)驗(yàn)中的

53、注意事項(xiàng)：同位素方法是毒物代謝實(shí)驗(yàn)中不可缺少的手段之一，常列為首選的實(shí)驗(yàn)方法，它具有靈敏度高、樣品制備較簡單、不易受生物材料中雜質(zhì)的干擾，可以示蹤觀察受試物進(jìn)入體內(nèi)后的歸宿等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合化學(xué)分析法如薄層色譜、液相色譜法，可把原形物和代謝物分開以初步確定代謝物的可能存在形式。用放射自顯影法可定位觀察受試物和代謝產(chǎn)物在整體動物或某些組織中的分布定位。a.標(biāo)記化合物要求標(biāo)記核素：由實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⑹茉囄锓肿咏Y(jié)構(gòu)、半衰期、經(jīng)費(fèi)等因素而定。標(biāo)記位置：應(yīng)標(biāo)記在受試物結(jié)構(gòu)中具有生物活性的基團(tuán)上，即定位標(biāo)記。如生物活性基團(tuán)不清楚，由可采用均勻標(biāo)記或全標(biāo)記。標(biāo)記位置在化學(xué)結(jié)構(gòu)上應(yīng)是穩(wěn)定的。按不同研究目的，可單標(biāo)記、雙標(biāo)記或多標(biāo)記。放射化學(xué)純度：標(biāo)記物應(yīng)保證高度的放化純度（至少90%以上），必要時用薄層色譜法進(jìn)行純化。放射性比度：隨受試物毒性大小而定。毒性大的受試物，要求高放射性比度的標(biāo)記物。用非標(biāo)記受試物稀釋配制成實(shí)驗(yàn)所要求的化學(xué)劑量。b.放射性樣品的測量：代謝試驗(yàn)常用的標(biāo)記放射性核素大都屬軟射線，測量食品主要為液體閃爍計數(shù)儀。樣品制備：酸消化法。組織0.1g、血漿0.1mL、糞混勻液0.1mL（糞加水制成勻漿液，或糞紅外燈烘干后研磨成粉，稱0.1g）兩份，加高氯酸0.2mL，過氧化