實(shí)驗(yàn)十二-水中細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌檢測(cè)ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)十二 水中細(xì)菌 總數(shù)與大腸菌群的測(cè)定,一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法 2、掌握大腸桿菌的鑒定和計(jì)數(shù)方法 3、鞏固無(wú)菌操作技術(shù),1.細(xì)菌總數(shù)測(cè)定原理,用營(yíng)養(yǎng)瓊脂傾注平板，測(cè)定被檢物在單位重量或體積（g或ml）內(nèi)所含有的活細(xì)菌數(shù)量，以判明被檢物被細(xì)菌污染的程度,二 實(shí)驗(yàn)原理,2 大腸桿菌鑒定原理,大腸菌群：一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否染腸道致病菌的可能。 樣品中大腸菌群系以100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最大可能數(shù)（MPN)表示,細(xì) 菌 學(xué) 檢 驗(yàn) 程 序 樣品 細(xì)菌總

2、數(shù) 大腸菌群 水樣稀釋或不稀釋 水樣稀釋或不稀釋 第一步- 初步發(fā)酵試驗(yàn) 傾注平板培養(yǎng) （乳糖發(fā)酵） 37 24小時(shí) 37 24小時(shí) 菌落計(jì)數(shù) 第二步- 平板分離培養(yǎng) （取平均數(shù)報(bào)告） （轉(zhuǎn)種鑒別培養(yǎng)基） 37 24小時(shí) 革蘭染色鏡檢 第三步- 乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 報(bào)告結(jié)果,三、實(shí)驗(yàn)器材 1、恒溫培養(yǎng)箱（361 ）、恒溫水浴鍋（461 ） 、天平、滅菌培養(yǎng)皿、試管。 2、培養(yǎng)基及試劑： 乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,1.以1ml無(wú)菌吸管吸取樣品1ml加入9ml 無(wú)菌生理鹽水， 使樣品（自來(lái)水、飲用水、飲料等）成 1：10 、1：100 、1：1000 等幾個(gè)稀釋度

3、；樣品（下水道水、牛奶）稀釋度要適當(dāng)高。 2.分別在無(wú)菌平皿內(nèi)加入1：100、1：10、原樣的樣品各1ml，每個(gè)稀釋度均做一個(gè)平板。 注意 ：先加濃度低的樣品，再加濃度高的樣品 3.將冷卻45的營(yíng)養(yǎng)瓊脂傾注于平皿中，搖勻，置37 培養(yǎng)24小時(shí),四、實(shí)驗(yàn)步驟-細(xì)菌總數(shù)測(cè)定,平皿分4部分點(diǎn)數(shù)（見(jiàn)圖） 求同一稀釋度的平均菌落數(shù) 如： A1數(shù) + A2數(shù) + A3 3,4、菌落計(jì)數(shù),1）平板菌落數(shù)的選擇 2）稀釋度的選擇 3）菌落數(shù)的報(bào)告 菌落數(shù)100 按實(shí)有數(shù)報(bào)告 菌落數(shù)100 采用兩位有效數(shù)，后面數(shù)值 四舍五入（也可用10的指數(shù)表示） 無(wú)法計(jì)數(shù) 無(wú)法計(jì)數(shù)報(bào)告 （ 注明水樣的稀釋倍數(shù),5. 菌落計(jì)數(shù)

4、的報(bào)告,稀釋度的選擇： 1. 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之 2. 若有兩個(gè)稀釋度其生長(zhǎng)之菌落數(shù)均在30-300，則應(yīng)視二者之比如何來(lái)決定，若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告平均數(shù)。 若其比值大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)字。 3. 若所有平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之,4. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。 5. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，其中一 部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌 落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。 6. 若所有稀釋度的菌落數(shù)均不可計(jì)

5、數(shù)，則以最高稀釋倍數(shù)無(wú)法計(jì)數(shù) 報(bào)告之,稀釋度選擇及細(xì)菌總數(shù)報(bào)告方法 稀釋液及菌落數(shù) 10-1 10-2 10-3 1 1,365 164 20 16，400 16，000或1.6104 2 2,760 295 46 1.6 37，750 38，000或3.8 104 3 2,890 271 60 2.2 27，100 27，000或2.7104 4 不可計(jì) 4，650 513 513，000 510，000或5.1 105 5 27 11 5 270 270或2.7 102 6 不可計(jì) 305 12 30，500 31，000或3.1 104 7 不可計(jì) 不可計(jì) 不可計(jì) 10-3無(wú)法計(jì)數(shù),稀釋

6、 倍數(shù),平均,菌落,數(shù),例 次,兩稀釋度,菌落數(shù)之比,細(xì)菌總數(shù),個(gè)/g或個(gè)/ml,報(bào)告方式,個(gè)/g或個(gè)/ml,菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告: 菌落數(shù) 報(bào)告結(jié)果 1、 30300 之間 平均菌落數(shù) X 稀釋倍數(shù) 2、 求比值 2 取較小稀釋倍數(shù) 在30300之間 300 最高稀釋度平均菌落數(shù) X 最高稀釋倍數(shù) 4、 300 30 6、 無(wú)法計(jì)數(shù) 報(bào)告無(wú)法計(jì)數(shù),取最接近的 X 稀釋倍數(shù),若有兩個(gè)稀釋度,五、大腸菌群的檢測(cè) 檢品 膽鹽乳糖發(fā)酵管 伊紅美蘭平板 大腸桿菌菌落純培養(yǎng) 乳糖復(fù)發(fā)酵管（-） 乳糖復(fù)發(fā)酵管（,1、檢樣稀釋 以無(wú)菌操作將檢樣1mL放于含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，經(jīng)充分振搖

7、或研磨做成1：10的均勻稀釋液。 用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，注入含有9mL生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1：100的稀釋液。 另取1ml滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液。 根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度，接種3管，每支試管接種1ml,2. 乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1mL及1mL以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種3管，置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進(jìn)行,3.分離

8、培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。 4.證實(shí)試驗(yàn) 在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落12個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置361的溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h2h，觀察產(chǎn)氣情況。 凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性無(wú)芽胞桿菌，即報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。 5.報(bào)告 根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL（g）食品中大腸菌群的MPN 值,表1 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表,大腸菌群測(cè)定,挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無(wú)光澤菌落； 紅色、粉紅色菌落,抑制劑：膽鹽、煌綠、十二烷基硫酸鈉,產(chǎn)酸判斷：紫色培養(yǎng)液變成黃色,產(chǎn)氣判斷：發(fā)酵導(dǎo)管內(nèi)有小氣泡，如輕輕打動(dòng)試管有氣泡沿管壁上浮，應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，需進(jìn)一步試驗(yàn),飲用水、乳、冷飲食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌指標(biāo) 指 標(biāo) 細(xì)菌總數(shù) 大腸菌群 飲用水 100個(gè)/ml 3個(gè)/L 消毒牛奶 30，000個(gè)/ml 40個(gè)/100ml 瓶裝汽水、果味水 及果汁類(lèi)飲料,品 種,100個(gè)/ml 5個(gè)/100ml,五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,一）、列表記錄并計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （二）、思考題 1、怎樣判斷分離到的微生物