蛋白質(zhì)基礎(chǔ)及檢測技術(shù)ppt課件

1、蛋白質(zhì)基礎(chǔ)及檢測技術(shù),1 蛋白質(zhì)的基本概念,蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是有機大分子，是構(gòu)成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔(dān)者。沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位,蛋白質(zhì)不僅在功能上與糖、脂肪不同，在元素組成上亦有差別。 根據(jù)蛋白質(zhì)的元素分析表明，其元素組成依次為：碳(50-55%)、氧（19-24%）、氮（13-19%）、氫（6-7%）硫（0-4%）。有的還含有少量磷、鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、碘等元素。一切蛋白質(zhì)皆含有氮并且大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量比較接近而恒定，一般為1517，平均為16。這是蛋白質(zhì)元素組成的一個重要特點，也是各種定氮法測定蛋白質(zhì)含量的計算基礎(chǔ)

2、。即用定氮法測得的含氮量乘以625，即可算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。但有的蛋白質(zhì)中氮的含量有一定差別，應(yīng)根據(jù)其氮的真實含量進行計算,2 蛋白質(zhì)的元素組成,3.1 氨基酸的結(jié)構(gòu) 自然界的氨基酸超過300種，但是組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，可以看作是羧酸分子中-碳原子上的氫原子被氨基取代而成的化合物，均屬于-氨基酸，即其氨基和羧基都連接在-碳原子上。 氨基酸碳鏈表示： 其結(jié)構(gòu)可用下列通式表示,注：R代表不同的側(cè)鏈基團，R不同代表不同的氨基酸,3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位氨基酸,各種氨基酸在結(jié)構(gòu)上有下列共同特點： 組成蛋白質(zhì)的氨基酸皆為-氨基酸。 不同的-氨基酸，其R側(cè)鏈不同（氨基酸分類的依據(jù)）。它對蛋

3、白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有重要的影響。 除R側(cè)鏈為氫原子的甘氨酸外，其它氨基酸的-碳原子所連接的四個原子或基團互不相同，該碳原子都是不對稱碳原子。 20種氨基酸中的脯氨酸含有亞氨基，所以它是亞氨基酸。半胱氨酸在蛋白質(zhì)分子中多數(shù)是以胱氨酸的形式存在,3.2 氨基酸的分類 根據(jù)側(cè)鏈R基團的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行分類： 1）酸性氨基酸谷氨酸Glu和天冬氨酸Asp 其R基團含羧基，在pH7時，羧基可解離而使分子帶負(fù)電荷。游離或在蛋白質(zhì)中都帶負(fù)電荷，以酸根形式存在。在蛋白質(zhì)中與正電基團形成鹽鍵。 2）堿性氨基酸賴氨酸Lys、精氨酸Arg和組氨酸His 其R基團含堿性基團，在pH7時，這些基團可質(zhì)子化而使分子帶正

4、電荷。 3）非極性疏水性氨基酸 其R基團無極性、不解離，且為疏水性的。 4）不解離的極性氨基酸（極性非電離氨基酸）羥基氨基酸+巰基氨基酸+甘氨酸 其R基團雖有極性但不能解離。 5）蛋白質(zhì)中少見的氨基酸無遺傳密碼，來自翻譯后加工修飾,3.3 氨基酸的理化性質(zhì) 3.3.1 兩性解離及其等電點 氨基酸是兩性電解質(zhì)： 氨基酸既含羧基,又含氨基,同時能起酸和堿的作用，是兩性電解質(zhì)，在水溶液中主要以兼性離子（偶極離子）的形式存在。 氨基酸的等電點： 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陰、陽離子的趨勢和程度相等而成為兼性離子，呈電中性時溶液的pH稱為該氨基酸的等電點（isoelectric point，pI,

5、3.3.2 紫外吸收性質(zhì) 20種氨基酸在可見光區(qū)無吸收。在遠紫外區(qū)：220nm都有光吸收。在近紫外光區(qū)（220-300nm）只有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸有吸收；色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰都在280nm附近。 由于大多數(shù)蛋白質(zhì)中含有色氨酸和酪氨酸殘基，所以可以測定蛋白質(zhì)溶液的280nm的光吸收值對蛋白質(zhì)進行定量分析。 3.3.3 茚三酮反應(yīng) 氨基酸與茚三酮水合物共熱生成藍紫色化合物，在570nm處有最大吸收峰，可以作為定量測定氨基酸的方法,4.1 肽鍵 一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合形成的共價鍵（-CONH-）稱為肽鍵，又稱酰胺鍵。蛋白質(zhì)分子中的氨基酸通過肽鍵連接,4 肽,4.

6、2 肽 氨基酸通過肽鍵連接起來的化合物稱為肽,4.3 氨基酸殘基（residue） 氨基酸在形成肽鏈后，因有部分基團參加肽鍵的形成，已經(jīng)不是完整的氨基酸，故將蛋白質(zhì)肽鏈中的每個氨基酸部分稱為氨基酸殘基。 每一個氨基酸殘基上都有一個R側(cè)鏈，不同R側(cè)鏈有不同的性質(zhì)和功能。 多肽鏈有兩端： 具有游離-氨基的稱為氨基末端（N-末端，amino terminal），通常寫在肽鏈的左端。 具有游離-羧基的稱為羧基末端（C-末端，carboxyl terminal），常寫在肽鏈的右端。 多肽鏈的方向從N-端到C-端，肽鏈也是從N-端到C-端按氨基酸殘基的順序來命名的,N端測序 幾乎所有的蛋白合成都起始于N-

7、端，蛋白質(zhì)N-端的序列組成對于蛋白質(zhì)整體的生物學(xué)功能有著巨大的影響力。例如N-端序列影響蛋白質(zhì)的半衰期，同時關(guān)聯(lián)著蛋白亞細胞器定位等，這些與蛋白的功能和穩(wěn)定性息息相關(guān)，對蛋白進行N-端測序分析，有利于幫助分析蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，揭示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。 方法： 目前對蛋白N端測序主要分類兩大類，其一為非質(zhì)譜技術(shù)，例如經(jīng)典的Edman降解法、利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR得到對應(yīng)蛋白的cDNA，再來反推得到蛋白序列；其二為質(zhì)譜技術(shù)。各自都有其使用的長處和制約之處，目前，市面上采用的，依然是基于經(jīng)典的Edman降解法原理，利用美國ABI公司Procise491蛋白序列測序系統(tǒng)進行蛋白N-端測序。 原理：Ed

8、man化學(xué)降解，其基本原理是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)和多肽的N-端殘基的偶聯(lián)，苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）環(huán)化裂解，和噻唑呤酮苯氨（ATZ）轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）三個主要的化學(xué)步驟，每個循環(huán)從蛋白質(zhì)與多肽裂解一個氨基酸殘基，同時暴露出新的游離的氨基酸進行下一個Edman降解，最后通過轉(zhuǎn)移的PTH-氨基酸鑒定實現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的測定,C端測序 眾所周知，C端序列是蛋白質(zhì)和多肽的重要結(jié)構(gòu)與功能部位，對蛋白質(zhì)的生物功能甚至起決定性作用。此外，由于蛋白翻譯后在細胞內(nèi)需要進一步剪切和修飾，通常不能簡單的使用基因序列對C-端或N端做簡單的預(yù)測，對于蛋白生物制品來說，使用C-端測序必不可少，

9、隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，蛋白質(zhì)C端測序?qū)ζ涔δ苎芯繉l(fā)揮越來越重要的作用。一些新的蛋白質(zhì)C端測序方法已建立，提高了靈敏度和重復(fù)性，能夠在蛋白質(zhì)組水平應(yīng)用。 方法：羧肽酶法、化學(xué)法及串聯(lián)質(zhì)譜法。 目前，使用較多的是利用串聯(lián)質(zhì)譜法，其原理為利用蛋白質(zhì)在質(zhì)譜中有規(guī)律的破碎，獲得蛋白質(zhì)肽段的碎片，分析圖譜得到蛋白質(zhì)的C-端序列,5.1 穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用力 蛋白質(zhì)是由許多氨基酸單位通過肽鍵連接起來的，具有特定分子結(jié)構(gòu)的高分子化合物。蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)可人為劃分為一、二、三、四級結(jié)構(gòu)。除一級結(jié)構(gòu)外，蛋白質(zhì)的二、三、四級結(jié)構(gòu)均屬于空間結(jié)構(gòu)，即構(gòu)象。蛋白質(zhì)的構(gòu)象通常由非共價鍵（次級鍵）來維系,5 蛋白質(zhì)的

10、三維結(jié)構(gòu),5.2 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)分子內(nèi)各個原子之間相互的立體關(guān)系就是蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)。通常將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。 5.2.1 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)：又稱為初級結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu),是指蛋白質(zhì)分子中,由肽鍵連接起來的各種氨基酸的排列順序。每種蛋白質(zhì)都有唯一而確切的氨基酸序列。 一級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是肽鍵，有些還包括二硫鍵（-S-S-）。因共價鍵的鍵能大，故蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較強,蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)包括： 組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目； 多肽鏈的氨基酸順序； 多肽鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。 其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)

11、。 測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的主要意義： 一級結(jié)構(gòu)是研究高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)； 可以從分子水平闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系； 可為生物進化提供理論依據(jù)； 可為人工合成蛋白質(zhì)提供序列參考。 目前可以運用氨基酸自動分析儀和質(zhì)譜對蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進行測定,氨基酸序列分析一般采用綜合的方法測定目標(biāo)制品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進行比較。 自動序列分析儀測序 其原理為Edman降解法，分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個步驟。首先在pH9.0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯(PhN=C=S，PITC)和蛋白質(zhì)或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)處理耦合

12、后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的N一端第一個肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物并在強酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色譜法鑒定出降解下來的PTH-氨基酸種類，從而得到蛋白質(zhì)或多肽N端序列信息,質(zhì)譜技術(shù) 質(zhì)譜所使用的測序方法是denovo測序, 是根據(jù)肽段與惰性氣體相碰撞產(chǎn)生的一系列的有規(guī)律的片段離子之間的質(zhì)量差來推斷氨基酸序列。我們可以根據(jù)肽鍵斷裂處的y離子和b離子來推測氨基酸序列從而不受翻譯后修飾和純度的限制，但是質(zhì)譜測序是有局限性的，1. 質(zhì)譜測序依賴于公共數(shù)據(jù)庫。 如果所研究的物種的基因組沒有完全被測序，或者其中

13、部分沒有對應(yīng)的序列， 那么質(zhì)譜測序?qū)o法得出正確的鑒定。2. 我們使用的搜索引擎的打分和算法可能也會使得我們遺漏一部分的肽段和質(zhì)譜圖的匹配， 產(chǎn)生假陽性結(jié)果。3. 如果有點突變或者未知修飾存在的話， 由于搜庫算法或者參數(shù)設(shè)置中沒有考慮到， 同樣也無法得出正確的結(jié)果。 質(zhì)譜技術(shù)還廣泛用于蛋白質(zhì)的純度鑒定、分子質(zhì)量測定、肽(質(zhì))譜分析、二硫鍵、乙?；⑻腔?、磷?；?，以及非共價結(jié)合等,5.2.2 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)：是指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈本身的折疊方式。形成蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的是肽單元或肽鍵平面。 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵來維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。 常見的二級結(jié)構(gòu)元件： -螺旋 -折

14、疊 -轉(zhuǎn)角 -凸起 無規(guī)則卷曲,鑒定方法：常用圓二色譜法(Circular dichroism,CD,圓二色譜法 圓二色光譜儀通過測量生物大分子的圓二色光譜從而得到生物大分子的二級結(jié)構(gòu)。當(dāng)平面偏振光通過具有旋光活性的介質(zhì)時，由于介質(zhì)中同一種旋光活性分子存在手性不同的兩種構(gòu)型，故它們對平面偏振光所分解成的右旋和左旋圓偏振光吸收不同，從而產(chǎn)生圓二色性。遠紫外的圓二色譜可用來測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，近紫外的圓二色譜可用來檢測蛋白質(zhì)側(cè)鏈的三級結(jié)構(gòu)。 應(yīng)用： 蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，DNA/RNA反應(yīng)，酶動力學(xué)，光學(xué)活性物質(zhì)純度測量，藥物定量分析。天然有機化學(xué)與立體有機化學(xué)，物理化學(xué)，生物化學(xué)與宏觀大

15、分子，金屬絡(luò)合物，聚合物化學(xué)等相關(guān)的科學(xué)研究,5.2.3 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)：是指具有二級結(jié)構(gòu)的肽鏈,按照一定方式再進一步卷曲、盤繞、折疊成一種看來很不規(guī)則,而實際上有一定規(guī)律性的三維空間結(jié)構(gòu)。 維系三級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵主要是非共價鍵（次級鍵），如疏水作用、氫鍵、鹽鍵、范氏引力等，但也有共價鍵，如二硫鍵等,5.2.4 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)：具有三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子,通過一些非共價鍵結(jié)合起來,而成為具有生物功能的蛋白質(zhì)大分子,就是蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。 亞基：是指參與構(gòu)成蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的、每條具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈。亞基雖然具有二、三級結(jié)構(gòu),但是在單獨存在時并沒有生物活力,只

16、有完整的四級結(jié)構(gòu)才具有生物活力。 維系蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的是氫鍵、鹽鍵、范氏引力、疏水作用等非共價鍵,血紅蛋白空間結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的實驗解析方法,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)實驗分析主要有 三大技術(shù)平臺,1）X-衍射蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析 （2）核磁共振波譜分析 （3）冷凍電鏡技術(shù),蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)X-衍射分析,摸索蛋白質(zhì)結(jié)晶條件、快速處理晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和減少差錯是目前蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析的兩大難題或瓶頸,是目前分辨率最高的結(jié)構(gòu)測定方法，高通量晶體結(jié)構(gòu)分析中的幾大重要環(huán)節(jié)是：數(shù)據(jù)處理與分析、重原子的定位、密度修飾、分子替換、圖形整合、模型加工和確認(rèn),晶體結(jié)構(gòu)分析的常用軟件有SOLVE，RESOLVE等,核磁共振波譜分析,

17、利用核磁共振原理，檢測分子質(zhì)量小于60k的蛋白質(zhì)，通過對其核磁共振譜線特征參數(shù)的測定來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，就是將原始資料利用傅里葉變換轉(zhuǎn)換為不同的峰值，然后采集各種不同的峰組成圖譜，并利用生物信息學(xué)方法篩選出具有特定結(jié)構(gòu)特征的圖譜。 常用NMRPipe和SPARKY軟件處理這些過程，使用XEASY，DYANA和GARANT等軟件分析側(cè)鏈或骨架結(jié)構(gòu),冷凍電子顯微鏡技術(shù),采用高壓快速液氮冷凍方法使樣品包埋在玻璃態(tài)的水環(huán)境中，使我們能夠觀察到生物大分子在天然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)；同時冷凍的速度極快，把細胞在其生理活動的某些特定時刻固定下來，顯示此時的結(jié)構(gòu)特點，進而可通過不同功能狀態(tài)的瞬時構(gòu)象變化來研究生

18、物分子的功能。冷凍電鏡獲得的是處于天然狀態(tài)下未經(jīng)染色的分子的二維投影像。將樣品進行不同角度的傾斜所獲得的數(shù)據(jù)進行綜合分析，并依據(jù)樣品的不同特性使用不同的重構(gòu)技術(shù)獲得分子的結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上觀察多種成分的圖像變化，追蹤生物大分子的裝配及其動力學(xué)過程,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可視化,可視化分析蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，有利于從原子間相互作用的層次理解生命活動過程的信息控制機制，更加有效地揭示分子在完成其功能過程中的演化情況，了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和各種微觀性質(zhì)與宏觀性質(zhì)之間的定量關(guān)系。只要安裝蛋白質(zhì)分子圖形學(xué)軟件，并獲得所需蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，配以商業(yè)軟件或免費的小分子圖形設(shè)計系統(tǒng)，就可開展結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的探索性工作,6.1

19、兩性和等電點 蛋白質(zhì)是由-氨基酸通過肽鍵構(gòu)成的高分子化合物，在蛋白質(zhì)分子中存在著氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，蛋白質(zhì)也是兩性物質(zhì)。 等電點（isoe1ectric point，pI）：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于某一pH值的溶液中時，蛋白質(zhì)分子上所帶的正、負(fù)電荷相等，凈電荷為零，蛋白質(zhì)為兼性離子，此時溶液的pH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點（isoe1ectric point，pI）。等電點是蛋白質(zhì)的特征常數(shù)，各種蛋白質(zhì)有各自的等電點。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處環(huán)境的pH大于pI（等電點）時，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，pH小于pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，pH等于pI時，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，此時溶解度最小。 等電點檢測方法：毛細管電泳法，

20、等點聚焦電泳,6 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),6.2 水解反應(yīng) 蛋白質(zhì)在酸、堿或酶的作用下發(fā)生水解反應(yīng)，經(jīng)過多肽，最后得到多種-氨基酸。蛋白質(zhì)水解時，應(yīng)找準(zhǔn)結(jié)構(gòu)中鍵的“斷裂點”，水解時肽鍵部分或全部斷裂。 舉例：Edman降解法測定蛋白質(zhì)的氨基酸順序，但該法一次只能降解幾十個氨基酸殘基，因此利用蛋白質(zhì)的水解性質(zhì)將蛋白質(zhì)水解為一些小肽段，分別進行測序，最后進行拼接，獲得蛋白質(zhì)的氨基酸順序。 6.3 膠體性質(zhì) 有些蛋白質(zhì)能夠溶解在水里（例如雞蛋白能溶解在水里）形成溶液。蛋白質(zhì)的分子直徑（1-100nm）達到了膠體微粒的大小，所以蛋白質(zhì)具有膠體的性質(zhì)。 在蛋白質(zhì)表面有親水基團，能與水發(fā)生水合作用，水分子受蛋白

21、質(zhì)極性基團的影響，定向排列在蛋白質(zhì)分子的周圍，形成水化層，將蛋白質(zhì)顆粒分開，不致相聚而沉淀。 蛋白質(zhì)在偏離等電點的溶液中，形成電荷層，同性電荷相斥，防止蛋白質(zhì)顆粒相聚沉淀,6.4 沉淀 原因：加入高濃度的中性鹽、加入有機溶劑、加入重金屬、加入生物堿或酸類、熱變性。 鹽析：向蛋白質(zhì)水溶液中加入濃的無機鹽溶液，可使蛋白質(zhì)的溶解度降低，而從溶液中析出，這種作用叫做鹽析。 鹽析出的蛋白質(zhì)仍舊可以溶解在水中，而不影響原來蛋白質(zhì)的性質(zhì)，因此鹽析是個可逆過程。利用這個性質(zhì)，采用分段鹽析方法可以分離提純蛋白質(zhì) 不同的蛋白質(zhì)其性質(zhì)不同，耐受酸、堿、鹽、重金屬等的程度也不同 ，因此我們再對純化工藝獲得的蛋白質(zhì)進行

22、檢測時應(yīng)充分了解該蛋白質(zhì)的相關(guān)性質(zhì)及緩沖成分，保證檢測任務(wù)順利進行,6.5 變性 蛋白質(zhì)的變性：是指蛋白質(zhì)在某些理化因素影響下，其特定空間結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性喪失的現(xiàn)象。 蛋白質(zhì)變性的物理因素有：高溫、高壓、超聲波、紫外線、X射線等。 蛋白質(zhì)變性的化學(xué)因素有：強酸、強堿、濃乙醇、重金屬、尿素、去污劑等。 蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)：蛋白質(zhì)變性只破壞二硫鍵和次級鍵，而不涉及肽鍵的斷裂，因此一級結(jié)構(gòu)并未破壞。 蛋白質(zhì)變性后性質(zhì)的改變：溶解度降低、粘度增加、結(jié)晶能力消失、生物活性喪失、容易被蛋白酶水解、容易沉淀。 Gly-SDS-PAGE: 還原性-SDS-PAGE：還原劑為DTT或巰基乙醇

23、，樣品需煮沸，高級結(jié)構(gòu)破壞，一級結(jié)構(gòu)未被破壞。 非還原性SDS-PAGE(不含還原劑，但含有SDS)，樣品不需煮沸，檢測 蛋白質(zhì)是否存在二硫鍵或多聚體，也可簡單判斷蛋白質(zhì)是否復(fù)性成功。 Native -PAGE：是在不加入SDS、巰基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰氨凝膠電泳。在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性和構(gòu)像。 為什么蛋白質(zhì)純度檢測用非還原性電泳,應(yīng)用： 如在臨床上用高溫、高壓、紫外線、75%酒精消毒就是利用了這些變性因素使細菌、病毒的蛋白質(zhì)變性，從而失去致病作用。 在蛋白質(zhì)的制備過程中，如果提取的目的蛋白是熱穩(wěn)定的，可利用熱變形的方法很方便的除去

24、其它雜蛋白。而對于不利的變性則應(yīng)該盡量避免,蛋白質(zhì)的復(fù)性：是指有些蛋白質(zhì)變性后，如果設(shè)法將變性因 素除去，該變性蛋白質(zhì)尚能恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)與活性。 利用蛋白質(zhì)的復(fù)性特征可對包涵體蛋白質(zhì)進行變性-復(fù)性純化。 例如在包涵體蛋白質(zhì)純化過程中常用尿素或鹽酸胍對包涵體進 行溶解，純化獲得目的蛋白后，再通過透析除去變性劑(尿素、 鹽酸胍、-巰基乙醇等)，或通過稀釋減少變性劑的含量，則其 特定的氨基酸順序重新卷曲、折疊成原來的天然構(gòu)象，酶的活 性也恢復(fù)到原來的水平。 檢測復(fù)性成功的方法： 非還原性電泳、生物活性檢測、結(jié)構(gòu)確認(rèn),6.6呈色反應(yīng) 蛋白質(zhì)分子中，肽鍵及某些氨基酸殘基的化學(xué)基團，可與某些化學(xué)試劑反應(yīng)顯

25、色，稱為蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)。利用這些呈色反應(yīng)可以對蛋白質(zhì)進行定性和定量分析。 6.7 蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì) 這要來自酪氨酸和色氨酸對于280nm紫外光的吸收，可以對蛋白質(zhì)進行定性和定量分析,蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個最基本技術(shù)，是確定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問題，尤其是在研究新的蛋白質(zhì)組分時顯得更重要。研究一個新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質(zhì)進行分離純化，最終用純品對其進行分析鑒定。如果對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚未搞清楚，工作起來將會困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究技術(shù)首先要對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進行分析鑒定。 蛋白質(zhì)分子是非常復(fù)雜的生物大分子,能代表其特征參數(shù)很多。但在普通

26、實驗室能夠進行測定的、最常用的參數(shù)，歸納起來主要有以下幾種： 蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定(分子量) 蛋白質(zhì)帶電性鑒定(等電點) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定(一二級結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、肽譜、N和C-末端) 蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定(生物活性、比活、酶促動力學(xué)) 免疫學(xué)鑒定(抗原-抗體反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng),7 蛋白質(zhì)的表征,7.1 蛋白質(zhì)的純化 蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)和起點。蛋白質(zhì)的來源是多樣的，主要來自動物、植物的各種組織和微生物，取材要采用含量豐富的器官。抽提蛋白質(zhì)的第一步是將組織粉碎，破壞細胞，以便于抽提出蛋白質(zhì)；第二步就是對抽提出來的蛋白質(zhì)進行純化。 7.1.1 幾種常見的細胞破碎方法 (1)機械方法 1)搗碎發(fā)；2)研磨法；3)勻漿法 (2)物理方法 1)溫差法；2)壓差法 (3)生物化學(xué)方法 1)采用化學(xué)試劑甲苯、丙酮、氯仿、Triton等通過化學(xué)滲透使細胞內(nèi)含物選擇性的滲透出來；2)自溶法；3)酶解法,7.1.2 蛋白質(zhì)的純化方法 7.1.2.1將多組分蛋白質(zhì)變?yōu)閱我唤M分蛋白質(zhì) 根據(jù)蛋白質(zhì)的分子形狀和分子質(zhì)量大小、電離性質(zhì)、溶解度和疏水性、生物功能專一性等，常用有各種鹽析法、超離心沉降、結(jié)晶、電泳、凝膠過濾，離子交換層析、親和層析、疏水層析等。近年來發(fā)展的FPL