EB病毒核酸檢測試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則

1、EB病毒核酸檢測試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則(征求意見稿)一、前言本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)EB病毒核酸檢測試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。本指導(dǎo)原則是針對(duì)EB病毒核酸檢測試劑技術(shù)審查的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究

2、資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。二、適用范圍本指導(dǎo)原則所述EB病毒核酸檢測試劑指基于分子生物學(xué)相關(guān)方法的核酸檢測技術(shù)，以EB病毒核酸序列為檢測靶標(biāo)，對(duì)來自人體樣本（如全血、血漿、血清等）中的EB病毒進(jìn)行體外定量檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，本類產(chǎn)品可用于EB病毒感染實(shí)驗(yàn)室診斷及臨床應(yīng)用。本指導(dǎo)原則適用于基于實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-time polymerase chain reaction, qPCR）等核

3、酸檢測方法的EB病毒核酸檢測試劑。對(duì)于其他方法，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)資料進(jìn)行相應(yīng)性能的驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并說明替代方法的科學(xué)合理性。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊(cè)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。三、注冊(cè)申報(bào)資料要求（一）綜述資料綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及不同型別檢出能力等方面寫明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。對(duì)于本類申報(bào)產(chǎn)品，應(yīng)著重從樣本類型、樣本采集與制備

4、方式、目標(biāo)基因片段的選擇、方法學(xué)特征等方面描述。（二）主要原材料的研究資料此類產(chǎn)品的主要原材料應(yīng)包括EB病毒檢測試劑的所有主要組成成分，如引物、探針、酶、反應(yīng)緩沖液、提取成分等。如為申請(qǐng)人自行研制的主要原材料，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)EB病毒目的基因序列確定、引物和探針選擇、酶的選擇和驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)過程予以詳述；并提供對(duì)各主要原材料的性能研究資料，如:外觀、純度、蛋白濃度、功能性研究等。制備完成的原料成品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，整個(gè)生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如為申請(qǐng)人外購主要原材料，應(yīng)詳述每一原材料外購方來源，提交外購方出具的原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并詳述申請(qǐng)人對(duì)外購主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確

5、定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細(xì)依據(jù)。1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。2.PCR組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應(yīng)提交對(duì)其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。2.2引物由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，并對(duì)序列準(zhǔn)確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證。如為外購，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明

6、，如聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。2.3探針特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)PAGE或其他適宜方法純化，在5-端(和/或3-端)進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到HPLC純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜，應(yīng)對(duì)探針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光基團(tuán)進(jìn)行核實(shí)，并進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證。2.4酶DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94保溫1小時(shí)后仍保持50%活性。尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG

7、），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對(duì)酶活性進(jìn)行合理驗(yàn)證。3.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。4. 企業(yè)內(nèi)部參考品：企業(yè)內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過程、定值研究、評(píng)價(jià)指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等。建議采用滅活病毒的臨床樣本或培養(yǎng)后的病毒株建立參考品，并溯源至國際參考物質(zhì)，不宜使用質(zhì)粒。內(nèi)標(biāo)設(shè)置應(yīng)合理，質(zhì)控品宜采用混合臨床樣本或病毒株或假病毒制備。內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）以對(duì)管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。申請(qǐng)人

8、應(yīng)對(duì)內(nèi)標(biāo)的引物、探針和模板的濃度做精確驗(yàn)證，保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線，不應(yīng)對(duì)目的基因的檢測造成競爭性抑制而導(dǎo)致假陰性，對(duì)內(nèi)標(biāo)的Ct應(yīng)有明確的范圍要求。質(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對(duì)各種質(zhì)控品的Ct做出明確的范圍要求。企業(yè)應(yīng)提交詳細(xì)的溯源性研究資料。企業(yè)制備的企業(yè)內(nèi)部參考品、用于制備商品化校準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液均應(yīng)能夠溯源至國際參考品。（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對(duì)pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵

9、參數(shù)進(jìn)行有效控制。生產(chǎn)工藝研究的資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準(zhǔn)方法、質(zhì)控方法、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。2.DNA提取純化方法優(yōu)化，建議包含純化步驟，內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控品均應(yīng)全程參與提取純化。3.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量、加樣量及反應(yīng)體積等。4.確定PCR各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。5.對(duì)于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。6.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件的對(duì)比分析，如果有差異應(yīng)分別詳

10、述。（四）分析性能研究資料申請(qǐng)人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制或成品驗(yàn)證階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來源等。分析性能評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)的美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行,建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。1. EB DNA提取病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加P

11、CR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，無論申報(bào)產(chǎn)品是否含有DNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對(duì)核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細(xì)的驗(yàn)證。臨床標(biāo)本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對(duì)于DNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。目前常見的DNA分離純化方法和改良方法各有優(yōu)勢和不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇DNA分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料（提取效率、與后續(xù)試驗(yàn)的配合等）。2.最低檢出限與定量限（分析靈敏度）（1）最低檢出限與定量限的確定建議使用國際參考品進(jìn)行梯度稀釋并多次檢測，將具有95%以上陽性檢出率的病

12、毒水平作為最低檢出限。定量限應(yīng)高于或等于檢出限，將多次（至少10次）測量的結(jié)果符合試劑準(zhǔn)確度要求的最低病毒水平作為定量限。（2）最低檢出限和定量限的驗(yàn)證申報(bào)試劑應(yīng)在最低檢出限或接近最低檢出限、定量限的病毒濃度進(jìn)行驗(yàn)證。企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢出限/定量限驗(yàn)證的病毒株的來源、及濃度確認(rèn)試驗(yàn)等信息。不同樣本類型（如涉及），應(yīng)分別評(píng)價(jià)最低檢出限及定量限。3.線性范圍線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值臨床樣本或病毒株按一定濃度加入血液基質(zhì)中（由可溯源至國際參考品的方法定量）進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液應(yīng)使用經(jīng)確認(rèn)為陰性的混合人血液樣本，應(yīng)包含不少于9個(gè)濃度（應(yīng)包含接近最低檢測限的臨界值濃度），使用至少3個(gè)批次的試劑

13、進(jìn)行試驗(yàn)。通過評(píng)價(jià)一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及各水平的準(zhǔn)確度確定該產(chǎn)品的線性范圍。不同樣本類型（如涉及），應(yīng)分別評(píng)價(jià)線性范圍。4. 準(zhǔn)確度應(yīng)使用國際參考物質(zhì)或企業(yè)內(nèi)部參考品和臨床樣本進(jìn)行陽性/陰性符合率或者方法學(xué)比對(duì)研究。5.精密度應(yīng)對(duì)可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估重復(fù)性和重現(xiàn)性，包括運(yùn)行內(nèi)的變異和運(yùn)行間、日內(nèi)、日間、批次間、操作者間、儀器間和地點(diǎn)間的變異。建議設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如為期12天的檢測，每天由2人完成不少于2次的完整檢測，注意應(yīng)包括核酸分離/純化步驟?？刹捎门R床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，至少包含3個(gè)濃度水平：陰性樣本、略高于最低檢測限的弱陽性樣本、中等陽性樣本。6.特異性（1）

14、交叉反應(yīng)用于EB DNA檢測試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀（推薦種類見表1）。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 cfu/ml或更高，病毒為105 pfu/ml或更高。申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。表1 用于交叉反應(yīng)研究的微生物（推薦）微生物水痘-帶狀皰疹病毒人類免疫缺陷病毒*乙型肝炎病毒梅毒*巨細(xì)胞病毒人皰疹病毒6型人皰疹病毒7型人皰疹病毒8型

15、單純皰疹病毒1型單純皰疹病毒2型甲型流感病毒*金黃色葡萄球菌白色念珠菌腺病毒*為可選驗(yàn)證的交叉反應(yīng)病原體。 （2）干擾物質(zhì)應(yīng)針對(duì)不同樣本類型，分別評(píng)價(jià)可能存在的干擾情況。建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并在待測物的醫(yī)學(xué)決定水平進(jìn)行檢測。潛在的干擾物質(zhì)包括內(nèi)源性、外源性和其他已報(bào)道的干擾物質(zhì)。樣本應(yīng)至少選取全血（或血紅蛋白和白細(xì)胞）、人白蛋白、膽紅素、甘油三酯、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血、抗核抗體、類風(fēng)濕因子等進(jìn)行驗(yàn)證，并注明對(duì)被測物不產(chǎn)生干擾的最高限值。7.其他需注意問題對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用機(jī)型】項(xiàng)中所列的所有型號(hào)儀器的性能評(píng)估資料。如適用于不同

16、樣本類型，應(yīng)提交對(duì)不同樣本類型一致性的驗(yàn)證，包括不同抗凝劑、采血管（如涉及）的驗(yàn)證。（五）陽性判斷值研究資料申請(qǐng)人應(yīng)考慮不同地理區(qū)域流行病學(xué)背景以及人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征（包括性別、地域、種族等因素）的差異，選擇具有代表性的樣本建立陽性判斷值，注意應(yīng)納入一定數(shù)量的弱陽性樣本。建議申請(qǐng)人從臨床意義的角度出發(fā)，合理設(shè)定灰區(qū)范圍并詳細(xì)說明確定的依據(jù)，并提供灰區(qū)的確定資料。如采用其他研究方法，應(yīng)說明其合理性。對(duì)于熒光實(shí)時(shí)PCR方法即為用于結(jié)果判讀的Ct值的確定資料，包括確定基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）的研究資料等。另外，建議申請(qǐng)人考慮建立陽性判斷值時(shí)使用的受試者樣本對(duì)于目標(biāo)人群的代表性，

17、通過臨床評(píng)價(jià)進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。（六）穩(wěn)定性研究資料 穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。 應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行全性能的分析驗(yàn)

18、證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】兩項(xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說明。（七）臨床評(píng)價(jià)資料臨床試驗(yàn)的開展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的要求。1.試驗(yàn)方法對(duì)于EB病毒核酸檢測試劑而言，臨床試驗(yàn)可采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，證明兩者具有等效性，從而間接證明試驗(yàn)用體外診斷試劑臨床性能能夠滿足預(yù)期用途的要求。對(duì)比試劑在預(yù)期用途、適用人群、

19、樣本類型、檢測性能等方面應(yīng)與試驗(yàn)用體外診斷試劑具有較好的可比性。對(duì)于比較研究試驗(yàn)中測定結(jié)果不符的樣本，應(yīng)采用臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室已建立的參考方法或者其他合理的方法（如第三方試劑、臨床普遍認(rèn)為靈敏度和特異性較好的核酸序列測定方法）進(jìn)行復(fù)核。2.試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)考慮擬申報(bào)產(chǎn)品的特點(diǎn)和預(yù)期用途，結(jié)合流行病學(xué)背景，選擇具有一定地域代表性的試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和受試者。原則上應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測以及相關(guān)學(xué)科的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)操作人員有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉評(píng)價(jià)方案。3.試驗(yàn)方案臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可

20、隨意改動(dòng)。受試人群應(yīng)盡可能全面地代表預(yù)期適用人群。體外診斷試劑的比較研究試驗(yàn)中應(yīng)對(duì)受試者樣本設(shè)盲，并使檢測順序隨機(jī)，以避免因操作者和檢測結(jié)果的評(píng)價(jià)者知曉受試者的疾病診斷或?qū)Ρ仍噭z測結(jié)果等信息而引入偏倚。試驗(yàn)用體外診斷試劑檢測應(yīng)與對(duì)比試劑的檢測同步進(jìn)行，以避免因疾病進(jìn)程不同或樣本采集時(shí)間不同而造成臨床試驗(yàn)結(jié)論偏離真值。不同臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)在臨床試驗(yàn)中應(yīng)盡可能統(tǒng)一試驗(yàn)操作和判讀標(biāo)準(zhǔn)等。應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，如評(píng)價(jià)試驗(yàn)用體外診斷試劑與對(duì)比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)，并提出適合的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法。建議根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)檢測樣本的類型和數(shù)量提出要求。4.受試者EB病毒核酸檢測應(yīng)與臨床癥狀、體征及其他診斷方法相結(jié)合

21、，用于相關(guān)病原體感染的輔助診斷。臨床試驗(yàn)受試者應(yīng)包括各種可能接受EB病毒核酸感染檢查的人群，如活動(dòng)性EB病毒感染、慢性EB病毒感染、EB病毒感染導(dǎo)致的惡性腫瘤、免疫功能低下或者接受免疫抑制劑治療等人群。另外，建議根據(jù)流行病學(xué)證據(jù)納入不同地區(qū)的患者/人群，以驗(yàn)證本產(chǎn)品的臨床檢出能力。5.樣本分布及數(shù)量建議至少活動(dòng)性EB病毒感染、慢性EB病毒感染、EB病毒感染導(dǎo)致的惡性腫瘤或病癥、免疫功能低下或者接受免疫抑制劑治療等人群中均應(yīng)檢測出具有EB病毒陽性的臨床結(jié)果。其中陽性樣本應(yīng)包含一定數(shù)量的弱陽性樣本或灰區(qū)樣本，并在檢測范圍內(nèi)的不同水平均有分布。在病例選擇時(shí)可考慮具有不同臨床癥狀、體征的患者等。陰性樣

22、本主要考慮可能存在的交叉反應(yīng)情況，應(yīng)選擇其他類皰疹病毒感染患者，以從臨床角度考察其特異性。臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)對(duì)臨床試驗(yàn)需要的最低樣本量進(jìn)行估算，并說明依據(jù)。適當(dāng)?shù)臉颖玖渴潜ＷC體外診斷試劑臨床性能得到準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的必要條件。臨床試驗(yàn)中所涉及的樣本類型應(yīng)為實(shí)際臨床檢測中常用的樣本類型。對(duì)于同時(shí)能夠檢測外周血、血清和血漿樣本的試劑，應(yīng)對(duì)同一EB病毒感染患者分別采集的外周血與血清和血漿樣本進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)研究，陽性樣本應(yīng)包括強(qiáng)、中、弱陽性及部分陰性樣本。臨床研究應(yīng)以前瞻性樣本為主，如采用回顧性樣本應(yīng)另行說明 。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)于本類產(chǎn)品對(duì)比實(shí)驗(yàn)的等效性研究，常用相關(guān)性、

23、線性回歸、相關(guān)系數(shù)（r）等對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，考察兩組數(shù)據(jù)之間是否存在相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，即評(píng)價(jià)考核試劑與對(duì)比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行符合率分析，計(jì)算陽性符合率、陰性符合率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和總符合率等指標(biāo)及其可信區(qū)間。7.結(jié)果不符的樣本在數(shù)據(jù)收集過程中，對(duì)于兩種試劑的檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)進(jìn)行第三方復(fù)核，并結(jié)合受試者的臨床診斷信息對(duì)差異原因進(jìn)行分析。如無需復(fù)核，應(yīng)詳細(xì)說明理由。（八）產(chǎn)品技術(shù)要求申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)

24、在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請(qǐng)人產(chǎn)品研制、前期臨床評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，按照醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。如果申報(bào)試劑已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，則申請(qǐng)人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢驗(yàn)要求。按照辦法的規(guī)定，此類產(chǎn)品為第三類體外診斷試劑。申請(qǐng)人應(yīng)按照醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則的規(guī)定，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫規(guī)范的要求，主要原材料部分建議包括目標(biāo)物的基因位點(diǎn)區(qū)域，引物/探針的設(shè)計(jì)及來源（包括目標(biāo)物和內(nèi)對(duì)照），各種酶的來源、技術(shù)

25、指標(biāo)和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，企業(yè)參考品的來源、組成、陰陽性或量值的確認(rèn)，內(nèi)對(duì)照和質(zhì)控品的設(shè)置和驗(yàn)證情況等內(nèi)容。（九）產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告根據(jù)辦法的要求，申請(qǐng)注冊(cè)的第三類體外診斷試劑產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢驗(yàn)。（十）產(chǎn)品說明書說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，進(jìn)口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡

26、量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。下面對(duì)EB病毒核酸檢測試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明。1【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：1.1試劑盒用于定量檢測人體樣本（如全血、血漿、血清等）中的EB DNA，適用樣本類型應(yīng)依據(jù)申報(bào)產(chǎn)品的分析性能評(píng)估和臨床研究情況進(jìn)行確認(rèn)。1.2目標(biāo)物的特征：簡要描述病原體生物學(xué)特征及致病性，感染后臨床表現(xiàn)，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法等。1.3目標(biāo)人群：各種可能接受EB病毒核酸感染檢查的人群

27、。例如活動(dòng)性EB病毒感染、慢性EB病毒感染、EB病毒感染導(dǎo)致的惡性腫瘤或病癥、免疫功能低下或者接受免疫抑制劑治療等人群。1.4產(chǎn)品功能：結(jié)合目標(biāo)人群的臨床表現(xiàn)和其他診斷指標(biāo)，可用于EB病毒感染的檢測。2.【檢驗(yàn)原理】2.1 描述試劑盒檢測能夠覆蓋的目標(biāo)基因序列特征，引物及探針的設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系（管）組合形式，內(nèi)對(duì)照和質(zhì)控品的設(shè)置及熒光信號(hào)標(biāo)記等。2.2 描述核酸提取純化的方法、原理等。2.3 描述試劑盒的技術(shù)原理，可結(jié)合圖示進(jìn)行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶），也應(yīng)介紹其作用機(jī)理。3.【主要組成成分】3.1詳細(xì)說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、成分、濃度

28、等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他特性；說明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。3.2 如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，應(yīng)在此明確經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、注冊(cè)證號(hào)（如有）以及配合使用的儀器等信息。3.3試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測必須的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及備案憑證號(hào)或注冊(cè)證號(hào)（如有）等信息。4.【儲(chǔ)存條件及有效期】說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲(chǔ)存條件及效期。5.【適用機(jī)型】注明所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操

29、作。6.【樣本要求】 6.1樣本收集要求：結(jié)合臨床公認(rèn)推薦的采樣要求。 6.2血液樣本應(yīng)當(dāng)說明對(duì)采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說明樣本采集、處理及保存方式。 6.3樣本處理、運(yùn)送及保存：對(duì)血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預(yù)處理、運(yùn)送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。如有需要應(yīng)對(duì)高于檢測范圍的樣本稀釋方法進(jìn)行規(guī)定。7.【檢驗(yàn)方法】描述自動(dòng)分析的工作流程或者詳細(xì)說明試驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，例如：7.1試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項(xiàng)。7.2詳細(xì)描述待測樣本、質(zhì)控品的核酸提取/純化方法，包括條件、步驟及注意事項(xiàng)。7.3擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。7.4 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及注意事項(xiàng)。7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況設(shè)置目標(biāo)基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道。7.6基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。7.7質(zhì)量控制方法：試劑盒內(nèi)陰/陽性質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)的Ct值范圍要求。8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】結(jié)合陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）以及目標(biāo)基因的檢測結(jié)果，以列表形式詳細(xì)描述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋，可用Ct值表示。如存在灰區(qū)，應(yīng)同時(shí)說明對(duì)灰區(qū)結(jié)果的處理方式，包括在何種情況下需要進(jìn)行重復(fù)檢測，重復(fù)檢測的方法，對(duì)樣本可能采取的優(yōu)