犬小孢子菌SSH文庫中差異基因的研究

1、犬小孢子菌SSH文庫中差異基因的研究,前 言,犬小孢子菌主要侵犯兒童 引起白癬、膿癬和體癬 兒童頭癬48,兒童體癬36% 成人頭體癬16,研究背景,1.兒童皮脂腺發(fā)育不完全 2.犬小孢子菌蛋白酶的作用,犬小孢子 菌兒童頭癬 發(fā)病機制,推測兒童頭皮是否誘導 犬小孢子菌毒力因子,材 料,前期試驗克?。壕篜CR，菌液克隆 主要試劑： 1. DIG High Prime Labeling&Detection Starter Kit I 2. 雜交膜 3. Real time PCR Kit 主要儀器： 1. CL1000紫外交聯(lián)儀（UVP） 2. Applied Biosystems 7500 Re

2、al Time PCR System,兒童頭皮 培養(yǎng)菌株 (tester,兒童光滑皮膚 培養(yǎng)菌株 (driver1,成人頭皮組織 培養(yǎng)菌株 (driver2,斑點雜交 實時PCR,技術(shù)路線,獲得差 異基因,前期完成試驗,消 減 文 庫,SSH,方法-斑點雜交,正反向 消減文庫 PCR擴增,制備探針,酶切回收,雜交膜,DIG-High Primer,探針,菌液PCR產(chǎn)物,陽性克隆測序,陽性克隆菌液送大連寶生物測序：菌種為DH10B，載體為PMD-T18 測序使用引物為：F Primer（M13-47）；R Primer（RV-M,測序分析,序列預處理,去除混雜基因,同源性比對,功能分類,實時PC

3、R,Tester mRNA,Driver1 mRNA,Driver2 mRNA,2個 基因,2個 基因,18S rRNA,3個RNA池均為構(gòu)建消減文庫時保存的總RNA,探針引物序列,結(jié) 果消減文庫酶切前后結(jié)果,結(jié) 果-斑點雜交,消減文庫1斑點雜交部分結(jié)果,正向 反向,正向,反向,消減文庫2斑點雜交部分結(jié)果,結(jié) 果-斑點雜交,陽性克隆測序及分析,共得到106個有效序列,共得到13個ESTs,8個ESTs找到了同源基因,6個同源基因具有功能分類,消減文庫1差異基因比對結(jié)果,消減文庫2差異基因比對結(jié)果,蛋白功能分類,實時PCR-18s rRNA,18s rRNA基因在3個RNA池中的實時PCR表達情

4、況,FSH1基因在tester RNA池和driver 1 RNA池中的實時PCR表達情況,實時PCR- FSH1,PQ-LRP基因在tester RNA和driver 1 RNA池中的實時PCR表達情況,實時PCR- PQ-LRP,P-GAL4基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的實時PCR表達情況,實時PCR- P-GAL4,NADH1基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的實時PCR表達情況,實時PCR- NADH1,4個ESTs表達的相對表達倍數(shù)關(guān)系,討 論,犬小孢子菌 致病因子表達,犬小孢子菌 主要致兒童頭癬,兒童頭皮組織 結(jié)構(gòu)蛋白差異,利用

5、SSH,可能影響,討 論,Tester和driver作為探針,低豐度基因的丟失,正反向消減DNA作為探針,避免低豐度基因的丟失 高背景，陽性率降低,去掉接頭,降低背景，篩選差異基因,討 論,兒童頭皮培養(yǎng)菌株,兒童光滑皮膚培養(yǎng)菌株,構(gòu)建文庫 富集差異基因,成人頭皮培養(yǎng)菌株,討 論,討 論-FSH1,目前對FSH1的研究主要是對其結(jié)構(gòu)的分析 FSH1是酯酶，水解疏水磷酸酯、油酯化合物 FSH家族功能較多：蛋白酶作用 、調(diào)控因子作用等 FSH1在此發(fā)揮蛋白酶作用還是調(diào)控因子作用還不清楚,Sophie Quevillpn-cheruel,討 論-PQ-LRP,PQ-LRP蛋白是膜綁定蛋白，擁有一對重復

6、的環(huán)結(jié)構(gòu) （環(huán)1和環(huán)2） 環(huán)2對半胱氨酸載體定位于溶酶體至關(guān)重要 半胱氨酸載體調(diào)控半胱氨酸代謝 PQ-LRP基因的上調(diào)表達，可能與半胱氨酸的代謝增強有關(guān) PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌的重要致病因子,討 論-NADH1,NADH1是呼吸鏈的組成部分，參與ATP的生成 犬小孢子菌ATP利用率的增加，可能與其在兒童頭皮組織中生長更活躍有關(guān),討 論-P-GAL4,P-GAL4基因?qū)儆贕AL4家族，含有一個真菌中獨有的GAL4域 GAL4家族普遍的功能是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，主要調(diào)控氮源代謝、生殖繁殖等 在本研究中，P-GAL4基因在此可能是調(diào)控真菌的生殖，導致犬小孢子菌在兒童的頭皮組織中大量繁殖 ，導致頭癬的發(fā)生,結(jié) 論,SSH1文庫得到5個差異基因： 1. FSH1 2. PQ-LRP 3. multidrug resistance protein MDR 4. RING zinc finger protein 5. RING zinc finger protein, putative,結(jié) 論,SSH2文庫3個差異基因： 1. P-GAL4 2. NADH1 3. DNA-dir