質(zhì)粒plasmPPT課件

1、1,第六章 質(zhì) 粒 (plasmid,質(zhì)粒：是指存在于細(xì)菌、真菌等微生物細(xì)胞中、獨(dú)立于染 色體外、能進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子,a、可以整合到染色體上，又可以游離于染色體外（附加體） b、質(zhì)粒通常是共價(jià)、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA(covalent closed circular DNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)， c、分子大小范圍從l kb左右到1000 kb。 自20世紀(jì)80年代中期以來(lái)，在鏈霉菌、酵母、絲狀真菌等微生物中都發(fā)現(xiàn)了線狀DNA質(zhì)粒，甚至還有RNA質(zhì)粒,2,質(zhì)粒對(duì)宿主細(xì)胞是非必需的，但在某些條件下，質(zhì)粒能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機(jī)能，從而使宿主得到生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。 如抗藥性質(zhì)粒和降解性質(zhì)粒就能使宿主細(xì)

2、胞在有相應(yīng)藥物或化學(xué)毒物的環(huán)境中生存。 質(zhì)粒也像染色體一樣攜帶編碼多種遺傳性狀的基因，并授予宿主細(xì)胞一定的遺傳特性，許多與醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)境密切相關(guān)的重要細(xì)菌的特殊特征便是由質(zhì)粒編碼的，如植物結(jié)瘤、固氮、對(duì)有機(jī)物的代謝等,3,在基因工程和分子生物學(xué)的發(fā)展過(guò)程中，質(zhì)粒也起著非常重要的作用。以質(zhì)粒為載體進(jìn)行的基因克隆技術(shù)，以質(zhì)粒為載體在原核生物和真核生物中表達(dá)外源蛋白的方法和技術(shù)已在工、農(nóng)、醫(yī)各個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。 因此，對(duì)質(zhì)粒的研究無(wú)論在理論上或應(yīng)用上均具有十分重要的意義，是現(xiàn)代生物學(xué)研究中的重要課題之一,4,第一節(jié) 質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和命名,大腸桿菌的F因子是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)(1946年)的細(xì)菌質(zhì)粒

3、，它的發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌遺傳學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。 日本學(xué)者(1957年)報(bào)道了志賀菌(Shigella)中質(zhì)粒介導(dǎo)抗生素抗性的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。在以后的20多年中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)各種細(xì)菌攜帶質(zhì)粒，且它們的表型特征已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了致育性和藥物抗性的范圍。 70年代末，隨著遺傳工程的崛起，質(zhì)粒作為載體己被廣泛應(yīng)用在遺傳工程和分子生物學(xué)的研究中。對(duì)很多不同微生物中的質(zhì)粒進(jìn)行了基因克隆和生物學(xué)功能分析，使質(zhì)粒的生物學(xué)跨入了空前繁榮的研究時(shí)期,一、質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn),5,二、質(zhì)粒的命名原則,質(zhì)?？梢砸罁?jù)其表型效應(yīng)、大小、復(fù)制特性、轉(zhuǎn)移性或親和性差異劃分為不同的類型。 最初發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒均由研究者根據(jù)表型、大小等特征自行命名，如F因子(

4、fertility factor，致育因子)、R質(zhì)粒(resistance factor，抗性質(zhì)粒)和Col質(zhì)粒(colicin，大腸桿菌毒素質(zhì)粒)等。 隨著研究工作的深入和發(fā)展，愈來(lái)愈多的含有質(zhì)粒的微生物新類群和新質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)，由于缺乏統(tǒng)一的命名規(guī)則而導(dǎo)致文獻(xiàn)中質(zhì)粒名稱的混亂。直至1976年Novick等才提出一個(gè)可為質(zhì)粒研究者普遍接受和遵循的命名原則,6,其規(guī)則是： 質(zhì)粒的名稱一般由三個(gè)英文字母及編號(hào)組成，第一個(gè)字母一律用小寫(xiě)p表示，后兩個(gè)字母應(yīng)大寫(xiě)，可以采用發(fā)現(xiàn)者人名、實(shí)驗(yàn)室名稱、表型性狀或其他特征的英文縮寫(xiě)。 編號(hào)為阿拉伯?dāng)?shù)字，用于區(qū)分屬于同一類型的不同質(zhì)粒，如pUC18和pUC19等,

5、7,第二節(jié) 質(zhì)粒的遺傳特征,一、 質(zhì)粒的大小和拷貝數(shù),質(zhì)粒的大小：以分子質(zhì)量MD或堿基對(duì)數(shù)kb表示，1MD的雙鏈DNA=1.65kb。質(zhì)粒的大小一般在1-200kb，最大的可達(dá)1400kb(如苜蓿根瘤菌質(zhì)粒pRm141a)。 質(zhì)粒的拷貝數(shù)是指同一質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中的數(shù)量，不同的質(zhì)粒在同一細(xì)胞中的拷貝數(shù)有差異。 質(zhì)?？截悢?shù)是確定某種質(zhì)粒特性的一個(gè)重要參數(shù)，從中也可獲得其復(fù)制本質(zhì)的基本信息。一般而言，質(zhì)粒的拷貝數(shù)與其分子質(zhì)量成反比關(guān)系，分子質(zhì)量大的拷貝數(shù)低，分子質(zhì)量小的拷貝數(shù)高,8,質(zhì)?？筛鶕?jù)其拷貝數(shù)分為嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒（Stringent plasmid）和松弛型質(zhì)粒（Relaxed plasmid）。

6、 質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)受到控制而與染色體復(fù)制同步進(jìn)行，被稱為嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒。其拷貝數(shù)也低，通常只有1-3個(gè)拷貝。 如F質(zhì)粒，每個(gè)細(xì)胞中只有1-2個(gè)拷貝，它們的復(fù)制受到嚴(yán)格控制，屬于嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)?；虻涂截愘|(zhì)粒,9,另一類質(zhì)粒的復(fù)制與染色體復(fù)制不同步，稱為松馳型質(zhì)粒。通常每個(gè)細(xì)胞含有10-100個(gè)拷貝，屬于高拷貝質(zhì)粒。 分子量小的CoLEl質(zhì)粒，每個(gè)細(xì)胞中有10-100個(gè)拷貝，它們的復(fù)制不受到嚴(yán)格控制，稱為松弛型質(zhì)?；蚋呖截愘|(zhì)粒。 含有松弛型質(zhì)粒的菌株在含有氯霉素的培養(yǎng)液中細(xì)胞分裂受到抑制，染色體DNA也停止了復(fù)制，但所含的ColEl質(zhì)?？沙掷m(xù)復(fù)制1015小時(shí)，直到每一個(gè)細(xì)胞中含有1 0003 000個(gè)質(zhì)粒

7、。基因工程研究中所用的載體質(zhì)粒大多數(shù)是這一類型的質(zhì)粒。 控制拷貝數(shù)的基因存在質(zhì)粒上，同時(shí)也是宿主和質(zhì)粒相互作用的結(jié)果,質(zhì)粒大小和類型,11,二、 質(zhì)粒的復(fù)制,復(fù)制子(replicon)是一個(gè)復(fù)制單位，細(xì)菌染色體是一個(gè)復(fù)制子，每一個(gè)質(zhì)粒也是一個(gè)復(fù)制子。 復(fù)制起點(diǎn)是復(fù)制子起始復(fù)制的部位，作為一個(gè)復(fù)制子，至少需要有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，即ori位點(diǎn)。大腸桿菌染色體的復(fù)制起點(diǎn)稱為oriC，質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)叫做oriV,12,幾種常見(jiàn)質(zhì)粒載體所攜帶的復(fù)制子,13,質(zhì)粒的復(fù)制主要是通過(guò)型復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制兩種方式之一進(jìn)行的，其中以型復(fù)制為主。在型復(fù)制中，有單向復(fù)制和雙向復(fù)制兩種類型。 革蘭氏陰性細(xì)菌中多數(shù)質(zhì)粒是以型方式

8、復(fù)制，R1、R100等是單向復(fù)制，F(xiàn)、R6k等是雙向復(fù)制類型,1. 質(zhì)粒復(fù)制的方式,14,質(zhì)粒滾環(huán)復(fù)制示意圖,質(zhì)粒只編碼一種或少數(shù)幾種與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，而復(fù)制所需要的其他蛋白，如DNA聚合酶、引物酶、連接酶、RNA-H酶、旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)和拓?fù)洚悩?gòu)酶I、DnaB和DnaC等都是利用寄主的復(fù)制酶體系,在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中大多數(shù)質(zhì)粒是以滾環(huán)方式復(fù)制,15,復(fù)制起點(diǎn)是一段特定的DNA序列，長(zhǎng)約幾百堿基對(duì)，在其相關(guān)的調(diào)控元件中含有由質(zhì)?；蛩拗魅旧w編碼的、參與DNA合成起始調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)。 在大多數(shù)質(zhì)粒中，與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)基因位于它們的作用位點(diǎn)ori序列附近，因此ori位點(diǎn)周圍的小范圍DN

9、A是質(zhì)粒復(fù)制所必需的。 如果質(zhì)粒DNA的大部分區(qū)域被去掉，而只保留質(zhì)粒的ori序列，而且質(zhì)粒是環(huán)狀的，則質(zhì)粒仍然能進(jìn)行復(fù)制,2. 復(fù)制起點(diǎn)(ori)區(qū)的功能,16,將ori區(qū)克隆到一個(gè)不能自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子上并引入到原核細(xì)胞后，該重組DNA具有自主復(fù)制能力。分子克隆中常用的質(zhì)粒載體就是以這種方法構(gòu)建的，同時(shí)用這種方法可以確定哪部分DNA是ori區(qū)并研究ori區(qū)的功能。 ori區(qū)域常決定了質(zhì)粒的許多特性，如質(zhì)粒的寄主范圍和質(zhì)粒的拷貝數(shù),17,質(zhì)粒的寄主是指質(zhì)粒能在其中自我復(fù)制的生物種類。質(zhì)粒的寄主范圍通常是由ori區(qū)決定的。有些質(zhì)粒如ColEl類型的質(zhì)粒，包括pBR322、pET和pU

10、C具有較窄的寄主范圍，這些質(zhì)粒只在E.coli及一些親緣關(guān)系較近的如沙門(mén)菌和克氏桿菌(Klebsiella)中復(fù)制,相反，RP4、RK2和RSFl010及從G+細(xì)菌中分離的滾環(huán)復(fù)制的質(zhì)粒都屬于廣寄主范圍(broad host range)質(zhì)粒。廣寄主范圍的質(zhì)粒一般能編碼與復(fù)制起始有關(guān)的所有蛋白，這樣就不依賴于寄主的功能,18,三、質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控,質(zhì)粒的復(fù)制機(jī)理與細(xì)菌染色體的基本相同，但二者之間的復(fù)制調(diào)控則有區(qū)別。至今所研究的質(zhì)粒，其復(fù)制調(diào)控一般采用直接或間接的負(fù)調(diào)控機(jī)制，負(fù)調(diào)控因子可以是蛋白質(zhì)、RNA或DNA重復(fù)序列,目前關(guān)于質(zhì)粒的調(diào)控大致可以分為兩種類型： 抑制物-靶位調(diào)控（inhibito

11、r-target regulation） 重復(fù)子-競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合調(diào)控（iteron-binding regulation,19,1. 抑制物-靶位調(diào)控,特點(diǎn)是依賴一小段反向轉(zhuǎn)錄的RNA作為抑制物，通過(guò)與目標(biāo)RNA的互補(bǔ)結(jié)合阻止質(zhì)粒復(fù)制的起始。 目標(biāo)RNA是質(zhì)粒DNA復(fù)制的引物或用于編碼復(fù)制所需的Rep蛋白的mRNA。 屬于這一類復(fù)制調(diào)控的質(zhì)粒有ColE1、pT181、p15A、pMB1、RSF1010、CloDF13、R1等,20,1）ColE1質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控,ColE1為6.6kb的小質(zhì)粒，拷貝數(shù)1020。其復(fù)制不需任何質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)，而是完全依賴于宿主提供的壽命較長(zhǎng)的酶和蛋白質(zhì)，包括分子伴侶、

12、DNA聚合酶I和, DNA依賴的RNA聚合酶、核糖核酸酶H (RNase H), DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶I,ColE1質(zhì)粒DNA的復(fù)制，是從一個(gè)特定的復(fù)制起點(diǎn)oriV開(kāi)始，并單向進(jìn)行?？刂拼朔N質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)的兩種關(guān)鍵因素RNAI和RNA，以及另一種負(fù)調(diào)控因子Rop蛋白，都是由ColE1 DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的,21,RNA也叫做復(fù)制引物。RNA分子在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)附近同互補(bǔ)的模板DNA形成一種雜交分子，被RNaseH酶所切割，從而釋放出3-OH末端，作為供DNA聚合酶合成DNA的引物。 RNA前體的合成起始于其復(fù)制起點(diǎn)上游555bp處的啟動(dòng)子區(qū)，繼而穿過(guò)復(fù)制起點(diǎn)，終止于下游大約150個(gè)核苷酸附近的一

13、個(gè)位點(diǎn)。此約750個(gè)核苷酸的起始轉(zhuǎn)錄物的5端折疊成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使RNA產(chǎn)生一個(gè)富G環(huán)，后者與位于模板鏈復(fù)制起點(diǎn)上游20個(gè)核苷酸處的質(zhì)粒DNA富C區(qū)正好匹配。隨后，該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由RNaseH加工為成熟引物，其切割位點(diǎn)位于復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)5個(gè)A序列中。所得的555個(gè)核苷酸的成熟RNA II被DNA聚合酶I用作引物啟動(dòng)前導(dǎo)鏈的合成,22,質(zhì)粒DNA的復(fù)制過(guò)程,23,RNA是復(fù)制的負(fù)調(diào)節(jié)物 RNA可以通過(guò)同RNA結(jié)合，以阻止其與模板DNA發(fā)生雜交作用。 colE1復(fù)制子不能影響質(zhì)粒復(fù)制所必需的宿主酶的活性，因此，一旦DNA合成啟動(dòng)后，便不能改變其速度或進(jìn)程。故而拷貝數(shù)的控制必須在DNA復(fù)制啟動(dòng)時(shí)

14、或啟動(dòng)前進(jìn)行。 質(zhì)粒DNA的合成依賴于復(fù)制起點(diǎn)處穩(wěn)定的DNA-RNA II雜交體的形成。正常情況下，復(fù)制的起始是由正確折疊與不當(dāng)折疊的RNA II間相互轉(zhuǎn)化的平衡來(lái)控制的，前者可形成穩(wěn)定的雜交體，后者則不能。 這一平衡的改變主要由RNA來(lái)控制，RNA是由RNA基因的反義鏈編碼的108個(gè)堿基小分子轉(zhuǎn)錄物。它折疊成可與新生RNA II前體結(jié)合的三葉草結(jié)構(gòu)，從而阻止后者折疊成形成穩(wěn)定雜交體所必需的二級(jí)結(jié)構(gòu),24,ColE1質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)結(jié)構(gòu),25,與RNA I的配對(duì)有可能引起引物RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，從而阻止了3-OH 的產(chǎn)生（ RNaseH 不能切割,26,ROM/ROP蛋白對(duì)RNA負(fù)調(diào)節(jié)活性的調(diào)

15、控 由質(zhì)粒編碼的一種被稱為ROM(RNA modulator)或ROP(repressor of primer)的蛋白質(zhì)可提高RNA與RNA結(jié)合的效率。ROM蛋白通過(guò)促進(jìn)RNA和RNA雜交體的形成，增強(qiáng)RNA的負(fù)調(diào)節(jié)作用。 ROM是含有63個(gè)氨基酸的多肽的同型二聚體，它由位于colE1復(fù)制起點(diǎn)下游400個(gè)核苷酸處的一個(gè)基因所編碼。該二聚體每個(gè)亞單位含有由一個(gè)轉(zhuǎn)角連接的兩個(gè)螺旋，因而此二聚體是由4個(gè)螺旋組成的呈雙重對(duì)稱的緊密束狀結(jié)構(gòu)。 ROM蛋白與RNA和RNA具有相似的親和力。它促使這兩種RNA分子的互補(bǔ)結(jié)合物由不穩(wěn)定的中間體變?yōu)楦€(wěn)定的結(jié)構(gòu),rom/rop基因缺失至少可使colE1質(zhì)?？截悢?shù)

16、提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。例 如，rom /rop基因的缺失可使較早期組建的載體pBR322在每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中的質(zhì)?？截悢?shù)從1520個(gè)增至500個(gè)以上，在rom/rop基因中插入一段外源DNA片段，則可導(dǎo)致致死性的大量質(zhì)粒DNA復(fù)制,27,28,2）R1質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控,R1質(zhì)粒是IncF類型的代表質(zhì)粒，其復(fù)制調(diào)控也是在RNA和蛋白質(zhì)的作用下進(jìn)行的，但RNA是間接調(diào)控的。 質(zhì)粒復(fù)制起始所必需的RepA蛋白能在兩個(gè)啟動(dòng)子的作用下轉(zhuǎn)錄。質(zhì)粒剛進(jìn)入細(xì)胞尚無(wú)CopB時(shí)，RepA在自身啟動(dòng)子下迅速轉(zhuǎn)錄；當(dāng)達(dá)到適當(dāng)?shù)目截悢?shù)時(shí)，PrepA啟動(dòng)子被CopB阻遏，RepA只能從PcopB轉(zhuǎn)錄。 copA自身啟動(dòng)子帶動(dòng)下從re

17、pA基因的互補(bǔ)鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，因此其RNA與repA的翻譯起始區(qū)重疊但轉(zhuǎn)錄方向相反，二者之間形成雙鏈結(jié)構(gòu)，被染色體編碼的切割雙鏈RNA的RNase降解,29,30,2. 重復(fù)子-競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合調(diào)控,F、P1、R6k、RK2、RP4和pSC101等質(zhì)粒是通過(guò)RepA進(jìn)行復(fù)制調(diào)控的，它們?cè)趶?fù)制起始位點(diǎn)（ori）和復(fù)制基因（rep）附近存在多個(gè)17-22bp的DNA短片段，這些短片段被叫做重復(fù)子（iteron），含有重復(fù)子序列的質(zhì)粒也叫重復(fù)子質(zhì)粒（iteron plasmid）。 重復(fù)子能與復(fù)制必需的RepA蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而抑制了質(zhì)粒的復(fù)制和拷貝數(shù)的增加,31,轉(zhuǎn)錄自體調(diào)控（transcriptional

18、 autoregulation）：RepA蛋白通過(guò)與自身啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而抑制自身的合成,32,質(zhì)粒濃度較低時(shí)，RepA只與一個(gè)質(zhì)粒結(jié)合；質(zhì)粒濃度較高時(shí)，RepA通過(guò)與重復(fù)子序列的結(jié)合使兩個(gè)質(zhì)粒聯(lián)結(jié)在一起，因此阻止了質(zhì)粒的復(fù)制。 重復(fù)子質(zhì)粒的復(fù)制不僅受RepA蛋白濃度的控制，而且受質(zhì)粒濃度，更確切地說(shuō)重復(fù)子序列濃度的控制,偶聯(lián)模型（coupling or handcuffing model）：重復(fù)子序列間的相互作用使兩個(gè)質(zhì)粒偶聯(lián)在一起，從而抑制了質(zhì)粒復(fù)制的起始,33,四、不相容性和質(zhì)粒的類群,質(zhì)粒不相容性：是指親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒，在非選擇性條件下常不能穩(wěn)定地存在于同一個(gè)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)若干代的培養(yǎng)

19、，只含有同一種質(zhì)粒的細(xì)胞越來(lái)越多，而含有兩種質(zhì)粒的細(xì)胞相對(duì)減少。這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性（incompatibility）。 一般來(lái)說(shuō)，同種質(zhì)粒衍生物是不相容的，而不同質(zhì)粒的衍生物則可能是相容性的，也可能是不相容性的,34,質(zhì)粒的不相容性也是與質(zhì)粒復(fù)制起始的控制密切相關(guān)的。由于性狀相近的質(zhì)粒通常具有相同或相似的復(fù)制調(diào)控機(jī)制，其阻遏物(抑制物或重復(fù)序列)亦相似，在調(diào)控時(shí)，它們也能隨機(jī)地與其中的任一質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)結(jié)合而阻遏了其復(fù)制過(guò)程，并進(jìn)而使之在子代細(xì)胞中丟失,由于阻遏物的結(jié)合是隨機(jī)的，因此兩個(gè)質(zhì)粒在子代細(xì)胞中的出現(xiàn)幾率相等，即各占50。對(duì)于高拷貝數(shù)質(zhì)粒而言，質(zhì)粒在子代細(xì)胞中的丟失需要多次分裂才

20、能實(shí)現(xiàn),35,有些質(zhì)粒能夠穩(wěn)定地存在于同一細(xì)胞中，是因?yàn)榭刂瓶截悢?shù)的機(jī)制完全不同。 例如，F(xiàn)質(zhì)粒和ColE1質(zhì)粒二者是相容的，也就是說(shuō)，它們分別屬于不同的不相容群（different incompatibility group）。 有些細(xì)菌在同一個(gè)細(xì)胞中可以含有幾種不同類型的質(zhì)粒，例如，Borrelia burgdorferi （博氏疏螺旋體 ）含有17種不同類型的環(huán)狀和線狀質(zhì)粒,36,在細(xì)菌中已區(qū)分出大量的不相容群（Inc），同一種不相容群的質(zhì)粒享有調(diào)節(jié)它們復(fù)制子的共同機(jī)制。 因此，也可以根據(jù)復(fù)制子是否相同來(lái)劃分質(zhì)粒的不相容群，攜帶有相同復(fù)制子的不同質(zhì)粒屬于同一不相容群，它們不能共存于同一細(xì)

21、菌中。 帶有不同復(fù)制子的質(zhì)粒屬于不同的不相容群，它們可以共存于同一細(xì)菌中。例如p15A、R6K、F能與colE1質(zhì)粒相容,38,五、質(zhì)粒的穩(wěn)定性 (細(xì)胞分裂中的質(zhì)粒分配,質(zhì)粒的不穩(wěn)定性（plasmid instability）包括兩個(gè)方面,分離的不穩(wěn)定性（segregation instability）：指在細(xì)胞分裂過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)粒DNA，并最終增殖成為無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性（structural instability）：指由于轉(zhuǎn)座作用或重組作用引起的質(zhì)粒DNA的重排或缺失,39,1、每個(gè)世代每個(gè)質(zhì)粒平均都必須至少發(fā)生一次復(fù)制； 2、當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制產(chǎn)生的質(zhì)粒拷貝必

22、須平均分配 到兩個(gè)子細(xì)胞中去,要使質(zhì)粒能夠保持穩(wěn)定的遺傳，至少需要滿足下面兩個(gè)方面的條件,在細(xì)胞分裂過(guò)程中，質(zhì)粒分配到子細(xì)胞的途徑可分為： 隨機(jī)分配(random distribution) 主動(dòng)分配(active distribution,40,這些質(zhì)粒的穩(wěn)定性是通過(guò)兩種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的： （1）質(zhì)粒編碼的基因產(chǎn)物，如質(zhì)粒編碼的致死蛋白來(lái)抑制不含質(zhì)粒的子細(xì)胞。 （2）質(zhì)粒上的分配體系（par,1.主動(dòng)分配的機(jī)理,對(duì)低拷貝質(zhì)粒而言，需要某種特定機(jī)制，將細(xì)胞分裂與質(zhì)粒復(fù)制協(xié)調(diào)起來(lái)，以保證每個(gè)細(xì)胞至少獲得一個(gè)拷貝。目前已對(duì)F、R1分配機(jī)制進(jìn)行了深入研究,41,par區(qū)叫做分配區(qū)(partition r

23、egion)或分配座位(partition locus)：是指在細(xì)胞分裂過(guò)程中使質(zhì)?？截悢?shù)均等的分配到子細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA序列,在F質(zhì)粒中par區(qū)是同復(fù)制起點(diǎn)緊密相鄰的，而在R1質(zhì)粒中則是遠(yuǎn)離其復(fù)制起點(diǎn)。質(zhì)粒的復(fù)制與分配是分開(kāi)獨(dú)立進(jìn)行的，而且par區(qū)還會(huì)使無(wú)親緣關(guān)系的其他質(zhì)粒保持穩(wěn)定,主動(dòng)分配體系的par區(qū),GGTCTGATTATTAGTCTGGGACCACGGTCCCACTCGTATCGTC CCAGACTAATAATCAGACCCTGGTGCCAGGGTGAGCATAGCAG,35,10,SD,sopA,sopB,sopC,SopA,在F質(zhì)粒中，par區(qū)由sopA和sopB兩個(gè)基因及sop

24、C區(qū)組成,sopA和sopB反式作用基因,sopC:順式作用位點(diǎn)，也叫類著絲粒位點(diǎn),12個(gè)43bp的正向重復(fù)序列,SopB與sopC區(qū)結(jié)合，形成蛋白-核酸復(fù)合物，該復(fù)合物參與質(zhì)粒的分配,sopA和sopB構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，其產(chǎn)物SopA和SopB兩種蛋白協(xié)同抑制sopAB操縱子的轉(zhuǎn)錄，屬于自體阻遏蛋白,有一對(duì)7bp的反向重復(fù)序列,43,SopA蛋白與sopAB轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子區(qū)的操縱基因結(jié)合，對(duì)其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控； SopB蛋白雖不能與sopAB操縱子的啟動(dòng)子結(jié)合，但它能促進(jìn)SopA蛋白的結(jié)合能力。 因此，SopB蛋白必須維持在適當(dāng)?shù)臐舛?，才能保證F質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性,44,復(fù)制,質(zhì)粒分配,細(xì)胞

25、分裂,質(zhì)粒,分配復(fù)合體,復(fù)制體,一種尚未知的結(jié)構(gòu)很快地將兩個(gè)質(zhì)粒移向細(xì)胞的兩極,細(xì)菌質(zhì)粒DNA的分配模型圖,質(zhì)粒DNA在位于細(xì)胞中央的復(fù)制體(replisome)的作用下進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒復(fù)制后，分配蛋白與sopC位點(diǎn)結(jié)合形成分配復(fù)合物,復(fù)制后的質(zhì)粒均等地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，分配后的質(zhì)粒可能在分配蛋白的作用下，定位于細(xì)胞的特定區(qū)域,45,F質(zhì)?；蚪M中控制寄主致死功能的基因ccdA和ccdB，屬于同一個(gè)自我調(diào)節(jié)的操縱子，分別編碼8.3kD和11.7kD的兩種蛋白。 在含質(zhì)粒的細(xì)胞中，CcdA蛋白作為解毒劑專門(mén)與毒劑CcdB蛋白結(jié)合，并使之失效。 在沒(méi)有CcdA蛋白的情況下，CcdB蛋白通過(guò)抑制DN

26、A解旋酶的活性，或引發(fā)解旋酶誘導(dǎo)寄主染色體DNA發(fā)生雙鏈斷裂，從而使染色體在細(xì)胞分裂過(guò)程中無(wú)法進(jìn)行正確的分配,寄主致死體系（host-killing mechanism,46,在新產(chǎn)生的無(wú)質(zhì)粒的子細(xì)胞中，開(kāi)始的時(shí)候是含有CcdA和CcdB這兩種蛋白質(zhì)的。 但由于無(wú)ccd操縱子可發(fā)生進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄，因此隨后這兩種蛋白質(zhì)的濃度便逐漸下降。毒劑CcdB和解毒劑CcdA具有不同的穩(wěn)定性，是導(dǎo)致分裂后細(xì)胞致死的關(guān)鍵因素。 CcdA蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，易被蛋白水解酶(protease)降解，于是較穩(wěn)定的CcdB蛋白質(zhì)便可行使其對(duì)寄主細(xì)胞的致死作用,47,隨機(jī)分配：是指在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)?？截悢?shù)在兩個(gè)子細(xì)胞之間是隨

27、機(jī)分配的。在一般情況下，通過(guò)隨機(jī)分配質(zhì)粒也能夠得到穩(wěn)定的遺傳，但在分裂中也會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒的子細(xì)胞,2.隨機(jī)分配機(jī)制(random distribution,48,ColEl等多數(shù)高拷貝質(zhì)粒一般沒(méi)有par基因，它們依賴于高拷貝質(zhì)粒的隨機(jī)分配來(lái)實(shí)現(xiàn)分裂過(guò)程中的穩(wěn)定性。 但在某些情況下，尤其是在recA+的宿主細(xì)胞中，ColE1常能彼此重組而形成多聚體(multimer)，從而使單個(gè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)減少，并增加產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的可能性,另外，ColEl質(zhì)粒含有不依賴于recA的cer基因，負(fù)責(zé)多聚體的解聚作用，使之重新轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w質(zhì)粒以保證質(zhì)粒在細(xì)胞分裂時(shí)的穩(wěn)定性,49,人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體如pBR322

28、等，在構(gòu)建過(guò)程中并不攜帶par區(qū)，因此它們?cè)诩?xì)胞分裂過(guò)程中是被隨機(jī)分配的。 盡管在大腸桿菌培養(yǎng)物中出現(xiàn)無(wú)pBR322質(zhì)粒細(xì)胞的可能性較低，但在一定的條件下，如培養(yǎng)基耗盡或是寄主細(xì)胞快速生長(zhǎng)分裂的過(guò)程中，仍有可能產(chǎn)生出無(wú)質(zhì)粒的細(xì)胞,因此，人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體，都必須具有選擇性遺傳標(biāo)記如：抗藥性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等，以保持選擇壓力,50,質(zhì)粒轉(zhuǎn)移性：是指質(zhì)粒能自動(dòng)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞，甚至還能帶動(dòng)供體細(xì)胞的染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移，這類質(zhì)粒常常被叫做自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(self-transmissible plasmid)。 質(zhì)粒在細(xì)菌間的轉(zhuǎn)移，需要供體和受體細(xì)胞間的直接接觸才能進(jìn)行，即接合作用(co

29、njugation)，這類質(zhì)粒又被稱接合質(zhì)粒(conjugative plasmid,六、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性-分為轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性兩大類型,有些質(zhì)粒雖然不能自主轉(zhuǎn)移，但能被其他一些自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒所轉(zhuǎn)移，這類質(zhì)粒又被叫做可移動(dòng)質(zhì)粒(mobilizable plasmid,幾種不同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性能,52,已知大腸桿菌的F質(zhì)粒、R1、R100、ColV、Collb-P9、R6k、RP4等均屬于自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，它們是低拷貝的大質(zhì)粒，其中較小的R6k質(zhì)粒也有38kb。 G+細(xì)菌如鏈霉菌中的自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，除SCPl是巨大質(zhì)粒外，很多都是10kb左右的小質(zhì)粒，而與轉(zhuǎn)移有關(guān)的區(qū)域只有2kb左右。 自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大小差異可

30、能是因?yàn)樗鼈兊霓D(zhuǎn)移機(jī)制不同，G+細(xì)菌中質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移不需要性菌毛，因此質(zhì)粒的容量就較小,1.自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的特點(diǎn),53,許多G-細(xì)菌中的自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒需要大于30kb的DNA來(lái)編碼與接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白質(zhì)，如F質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移操縱子(tra)就包含23個(gè)基因，大小為33 kb,tra基因和oriT在質(zhì)粒自主轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，所以大多數(shù)自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒都有tra基因和oriT位點(diǎn),自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒能誘導(dǎo)含有與自己相同或相似的oriT位點(diǎn)的非自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)移，如將自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒整合到染色體上后，帶動(dòng)染色體轉(zhuǎn)移也是從質(zhì)粒的oriT位點(diǎn)開(kāi)始的,54,1) tra基因：大多數(shù)tra基因的產(chǎn)物與性菌毛的形成(F、RP4和

31、pKMl01都編碼一根性菌毛)、雜交對(duì)的形成有關(guān)；有些tra基因編碼作用于oriT位點(diǎn)的內(nèi)切酶，使質(zhì)粒中的一條DNA鏈產(chǎn)生切口，從而開(kāi)始轉(zhuǎn)移；有些tra基因則與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移調(diào)控等有關(guān),2) oriT位點(diǎn)：oriT位點(diǎn)不僅是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的起始位點(diǎn)，也是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移后DNA末端再環(huán)化的位點(diǎn)，因此質(zhì)粒必須具有oriT位點(diǎn)才能進(jìn)行自主轉(zhuǎn)移,oriT位點(diǎn)的基本特征正在研究之中。F質(zhì)粒的oriT位點(diǎn)的序列小于300bp，含有反向重復(fù)序列，并富含AT堿基,55,2.可移動(dòng)質(zhì)粒的特點(diǎn),G-細(xì)菌中可移動(dòng)質(zhì)粒缺少與性菌毛合成有關(guān)的基因(約10個(gè)左右) 。因此，在進(jìn)行轉(zhuǎn)移時(shí)，必須利用位于同一細(xì)胞內(nèi)的自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒編碼合成的性菌毛

32、才能進(jìn)行,如ColEl具有獨(dú)特的bom位點(diǎn)和負(fù)責(zé)DNA轉(zhuǎn)移的mob基因。ColEl的bom位點(diǎn)類似于F質(zhì)粒的oriT。mob基因的功能類似于tra基因，mob基因也能編碼特異的核酸內(nèi)切酶，在bom位點(diǎn)進(jìn)行切割，但沒(méi)有編碼性菌毛的tra基因，所以它不能自主轉(zhuǎn)移,但它們含有與F質(zhì)粒的oriT類似的bom位點(diǎn)和可移動(dòng)基因mob(mobilization)，因而能夠被帶有tra基因的質(zhì)粒誘動(dòng)轉(zhuǎn)移,mob產(chǎn)物,bom,F- mob,F+ mob bom,F+ mob,F+ mob+ bom,不能轉(zhuǎn)移,性菌毛,轉(zhuǎn)移,不能轉(zhuǎn)移,不能轉(zhuǎn)移,F質(zhì)粒,F質(zhì)粒誘動(dòng)ColEl轉(zhuǎn)移的模型圖,57,七、IncP組質(zhì)粒的特

33、征和接合轉(zhuǎn)移,F質(zhì)粒能在大腸桿菌細(xì)胞間自主轉(zhuǎn)移，而且能帶動(dòng)供體細(xì)胞的染色體向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移，也能帶動(dòng)ColE質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。但F質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移只限于親緣關(guān)系較近的腸桿菌，其寄主范圍較窄。 IncP、IncN、IncQ、IncW組的質(zhì)粒屬于廣寄主范圍質(zhì)粒(broad host range plasmid)。 廣寄主范圍質(zhì)粒：指質(zhì)粒能通過(guò)接合作用轉(zhuǎn)移到很多不同種甚至不同屬的寄主內(nèi)，并能穩(wěn)定地存在于這些寄主細(xì)胞內(nèi),下面以IncP為例對(duì)這一類質(zhì)粒進(jìn)行介紹,58,IncP組的質(zhì)粒的寄主較廣，IncP質(zhì)粒自身或帶動(dòng)其他質(zhì)粒能從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到幾乎所有的G-細(xì)菌中; 有研究表明IncP質(zhì)粒還能接合轉(zhuǎn)移到G+細(xì)菌、酵母、

34、植物細(xì)胞中; IncP質(zhì)粒雖然能通過(guò)接合作用轉(zhuǎn)移到酵母、植物等這些寄主中，但質(zhì)粒卻不能在這些寄主中復(fù)制，屬于轉(zhuǎn)移寄主; 大腸桿菌IncP組包括很多種天然質(zhì)粒，大小在60-90kb，具有多種抗性基因，如：卡那霉素(Kan)、四環(huán)素(Tet)、氨芐青霉素(Amp)、鏈霉素(Str)、磺胺(Sul)、汞離子(met)、氯霉素(Cam)、慶大霉素(Gen)、甲氧芐二氨嘧啶(Tp)、環(huán)絲氨酸(Ox)等,1. IncP質(zhì)粒的特征,59,在IncP組中，RK2、RPl、RP4的特征極為類似，也是IncP組中研究最深入的質(zhì)粒。 這類質(zhì)粒的大小為60kb，在大腸桿菌中的拷貝數(shù)為4-7個(gè)，oriV是質(zhì)粒的營(yíng)養(yǎng)復(fù)制

35、區(qū)，具有與接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的tra基因和oriT位點(diǎn)，含有氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性及四環(huán)素抗性。 另外，質(zhì)粒上還攜帶有轉(zhuǎn)座子Tn1和插入序列IS21,60,61,RK2和RP4質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移機(jī)制類似于F質(zhì)粒，即接合轉(zhuǎn)移需要兩個(gè)功能區(qū)：oriT區(qū)和tra區(qū)。 tra基因編碼性菌毛、DNA內(nèi)切酶等與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白。 oriT是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移的起始位點(diǎn)，當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí)tra基因編碼的內(nèi)切酶在oriT位點(diǎn)造成缺口，質(zhì)粒的一條DNA開(kāi)始從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移,2. IncP質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移,62,1. 構(gòu)建廣寄主范圍的質(zhì)粒載體 根據(jù)自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒能自主轉(zhuǎn)移及其能帶動(dòng)可移動(dòng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移這兩個(gè)特征而設(shè)計(jì)的。

36、從理論上講，可移動(dòng)質(zhì)粒只要含有與自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒相同的oriT位點(diǎn)就能被轉(zhuǎn)移。 對(duì)自然界中不能自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，可人工加上oriT位點(diǎn)，然后誘動(dòng)其轉(zhuǎn)移,八、廣寄主范圍質(zhì)粒載體,63,一般把RP4或RK2質(zhì)粒中DNA轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，即oriT DNA序列稱為mob-site。 常用的大腸桿菌質(zhì)粒載體如pBR322、pBR325、pACYCl84，既不能自主轉(zhuǎn)移也不能被高效誘動(dòng)。 如果這些質(zhì)粒上帶有RP4質(zhì)?；蚱渌|(zhì)粒的mob-site，則能被RP4質(zhì)粒誘動(dòng)轉(zhuǎn)移到不含質(zhì)粒的大腸桿菌或其他G-細(xì)菌中,pBR325-mob,在pBR325質(zhì)粒上插入RP4質(zhì)粒的mob-site后，構(gòu)建成的幾種pSUP可移動(dòng)質(zhì)粒載體

37、，又稱為廣寄主范圍質(zhì)粒載體,65,2. 廣寄主范圍質(zhì)粒載體的接合轉(zhuǎn)移,1）分別含有tra和oriT的雙質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 利用廣寄主范圍質(zhì)粒載體和自主轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蚱溲苌|(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)移，通過(guò)雙親雜交或三親雜交的方法進(jìn)行,雙親雜交：將兩種質(zhì)粒共同導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，再以此帶有雙質(zhì)粒的菌株與受體菌（如根瘤菌）進(jìn)行雜交，廣寄主范圍質(zhì)粒就能以高頻率轉(zhuǎn)移到受體菌中,三親雜交：將兩種質(zhì)粒分別導(dǎo)入不同的大腸桿菌細(xì)胞，再將含有不同質(zhì)粒的兩個(gè)菌株與受體菌混合培養(yǎng),66,2）tra整合到染色體上的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 一般將整合有自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌供體菌叫做誘動(dòng)菌株。 接合轉(zhuǎn)移時(shí)，先將可移動(dòng)質(zhì)粒載體導(dǎo)入誘動(dòng)菌株，然后將該菌株與

38、受體菌混合，從而誘動(dòng)可移動(dòng)質(zhì)粒向受體轉(zhuǎn)移，而自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒本身并不轉(zhuǎn)移,67,第三節(jié) 質(zhì)粒的檢測(cè)和遺傳表型,目前用來(lái)檢測(cè)質(zhì)粒的方法主要根據(jù)質(zhì)粒兩方面的特性： 遺傳學(xué)特性：指質(zhì)粒具有與染色體DNA不同的特征，如獨(dú)特的表型效應(yīng)、能獨(dú)立地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞、消除后不影響宿主的生存等。根據(jù)這些遺傳學(xué)特性，可采用質(zhì)粒消除、遺傳轉(zhuǎn)移、分子雜交等初步檢測(cè)菌株中是否含有質(zhì)粒。 分子結(jié)構(gòu)特性：質(zhì)粒DNA在細(xì)胞中處于共價(jià)、閉合、環(huán)狀的超螺旋狀態(tài)，與染色體相比，它們對(duì)堿、高溫等理化因子處理有更強(qiáng)的抗性。根據(jù)這些特性可以容易地對(duì)宿主中的質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)、分離和純化,68,一、質(zhì)粒消除,理化因子消除法 常用的理化因子

39、：吖啶橙、溴化乙錠、利福平、亞硝基胍、高溫、紫外線等,如何區(qū)別某一遺傳性狀的喪失是質(zhì)粒消除還是染色體基因突變的結(jié)果,回復(fù)突變：質(zhì)粒消除不可逆，基因突變（缺失突變除外）可以經(jīng)回復(fù)突變而恢復(fù)原有性狀。 突變率：質(zhì)粒消除的效率可從菌體數(shù)的百分之幾到百分之百，而基因突變的頻率要低得多,69,影響質(zhì)粒消除的因素：消除劑、宿主狀態(tài)、消除條件等,消除質(zhì)粒的作用機(jī)制： 對(duì)質(zhì)粒本身的復(fù)制和分離產(chǎn)生抑制作用，從而在細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中逐步淘汰； 選擇性抑制帶有質(zhì)粒的菌生長(zhǎng)。 吖啶橙染料等是質(zhì)粒復(fù)制子的復(fù)制抑制劑，大炭霉素、SDS等是選擇性殺菌劑，它們對(duì)有性菌毛的菌產(chǎn)生作用,70,2. 原生質(zhì)體誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除 使待消除質(zhì)粒的菌株在一定條件下形成原生質(zhì)體，在再生后生長(zhǎng)的菌株中可以出現(xiàn)高頻率（約94%）質(zhì)粒消除菌,71,二、遺傳轉(zhuǎn)移,自主轉(zhuǎn)移、誘動(dòng)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等方法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)移,三、分子雜交,在初步確定某菌株可能含有質(zhì)粒的情況下，利用已知表型性狀的基因片段作探針進(jìn)行分子雜交，來(lái)檢測(cè)其菌株是否含有該質(zhì)粒，這也是目前用于質(zhì)粒檢測(cè)的重要手段,72,四、質(zhì)粒的分離、檢測(cè)與純化,質(zhì)粒存在的直接證明取決于從宿主細(xì)胞中直接檢測(cè)、分離和純化質(zhì)粒DNA,常用的質(zhì)粒分離方法是堿變性法。 質(zhì)粒的純化和檢測(cè)可用： 瓊脂糖凝膠電泳 一般同一分子量、不同