蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)PPT課件

1、蛋白質(zhì)研究進(jìn)展,目錄,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) Protein structure 蛋白質(zhì)折疊 Protein folding 分子馬達(dá) Molecular motor 蛋白質(zhì)相互作用 Protein-protein interaction 蛋白質(zhì)剪接 Intein: Protein Splicing 糖蛋白-糖生物學(xué)Glycoprotein -Glycobiology 蛋白質(zhì)工程 Protein engineering,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)Protein structure,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的中心問題 結(jié)構(gòu)生物學(xué)是分子生物學(xué)的分支，特 別是蛋白質(zhì)和核酸的三維形狀和功能。 包括： 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 蛋

2、白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息學(xué)：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測,蛋白質(zhì)大小,蛋白質(zhì)是相對分子質(zhì)量很大的生物分子。 對一種給定的蛋白質(zhì)來說，氨基酸的組成和順序以及鏈的長度方面都應(yīng)該是相同的，即均一的蛋白質(zhì)。均一蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量可以測得。 蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量其變化范圍很大，從約6103到1107或更大一些 目前估計(jì)蛋白質(zhì)平均約300殘基。約50殘基似乎是執(zhí)行特定的生化功能下限 蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的單位：Kd 與 S,蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量的估計(jì),對不含輔基的簡單蛋白質(zhì)，用110除它的相對分子質(zhì)量即該蛋白的氨基酸的數(shù)。 蛋白質(zhì)20種氨基酸的平均相對分子質(zhì)量約為138，但多數(shù)蛋白質(zhì)中較小的氨基酸占優(yōu)勢，因此平均相對分子質(zhì)量接近1

3、28。又因每形成一個(gè)肽鍵將除去一分子水（相對分子質(zhì)量18），所以氨基酸殘基的平均相對分子質(zhì)量約為128-18=110,三種蛋白質(zhì)分子量的測定方法,沉降法：又叫超速離心法，蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高速離心時(shí)，沉降速度與蛋白質(zhì)顆粒大小成正比，利用 M=RTS/D(1-V) 求其分子量M。 凝膠過濾法：又稱分子排阻層析或分子篩層析法，此法葡聚糖凝膠分子篩層析，根據(jù)待測樣品的洗脫體積求其分子量。 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法：蛋白質(zhì)在 SDS 聚丙烯酰胺凝膠中電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子在電泳中的相對遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成正比關(guān)系，可以求出蛋白質(zhì)分子量,葡聚糖凝膠測定蛋白質(zhì)分子量,VeV0KdVi（0Kd1） 在一定的

4、凝膠柱內(nèi)，凝膠孔隙所占的體積成為內(nèi)水體積Vi，凝膠顆粒間的自由空間所占的體積稱為外水體積V0。Kd為分配系數(shù)。 如果假定蛋白質(zhì)分子近于球形，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在1000015000時(shí)，蛋白質(zhì)在葡聚糖凝膠柱上層析的洗脫體積和分子量的對數(shù)呈直線關(guān)系。若用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在一定型號葡聚糖凝膠柱上層析，精確測其洗脫體積，并以洗脫體積Ve對分子量對數(shù)logMW作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,三個(gè)不同大小分子洗脫曲線示意圖,Ve / V0對log MW作圖,lgMW = K - bm 將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SDS-PAGE 中的電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)

5、在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量,SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳,12,蛋白質(zhì)分類,蛋白質(zhì)分為三個(gè)主要類別，這與典型的高 級結(jié)構(gòu)相關(guān)： 球狀蛋白質(zhì) Globular proteins 纖維狀蛋白 Fibrous proteins 膜蛋白 Membrane proteins,纖維狀蛋白,Fibrous proteins or scleroproteins. 纖維蛋白是僅見于動(dòng)物的結(jié)締組織，肌腱，骨基質(zhì)和肌纖維 通常桿或線樣形狀 惰性或貯存蛋白質(zhì) 水不溶性 氨基酸序列往往具有有限的殘基與重復(fù),纖維狀蛋白,a-Keratin,Keratin: -Sheet Proteins,Tri

6、ple Helix : Collagen,纖維狀蛋白質(zhì)極具潛力的材料,結(jié)構(gòu)賦予了這些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)特定的機(jī)械強(qiáng)度，為此可以作為特制的材料。在利用天然的纖維狀蛋白質(zhì)作為材料外，目前人們還利用這些重形成一種新的人工蛋白質(zhì)材料，稱為SELP47K。這種新的蛋白質(zhì)材料兼有絲蛋白和彈性蛋白的特點(diǎn)，而且具有RSPP的特點(diǎn)，可以自組裝，成為納米材料。SELP47K除了高強(qiáng)度外，還可形成親水凝膠，作為細(xì)胞外基質(zhì)。 另有一種蛋白質(zhì)/肽纖維的構(gòu)建是利用又一種蛋白質(zhì)纖維的結(jié)構(gòu)原理。新的蛋白質(zhì)纖維有SAF-p1和SAF-p2,胱氨酸的生產(chǎn),我國巳開發(fā)出利用雞、鴨毛和豬蹄甲殼等下腳料提取胱氨酸工藝。 迄今為止，日本、美國等

7、仍在進(jìn)口我國提取法生產(chǎn)的胱氨酸，現(xiàn)我國仍為世界胱氨酸第一產(chǎn)銷大國。 國際市場上采用發(fā)酵法生產(chǎn)的胱氨酸實(shí)際上仍未成熟，難以與提取法生產(chǎn)的胱氨酸在成本上進(jìn)行較量。這就是我國胱氨酸能在競爭異常激烈的國際市場上暢銷不衰的主要原因。 據(jù)了解，從2004年以來，國際市場上的從飼料級、食品級到藥用級等各種規(guī)格的胱氨酸價(jià)格均有所上漲。1999年胱氨酸出口均價(jià)每公斤7085元人民幣，2004年我國出口胱氨酸均價(jià)升至每公斤近100元。2007年上半年，我國僅食品級胱氨酸出口均價(jià)已超過每公斤100元，國內(nèi)經(jīng)銷商每公斤107元，符合美國藥典或歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)的藥用級胱氨酸出口價(jià)更高達(dá)每公斤320元。 據(jù)有關(guān)部門估計(jì)，國際

8、市場對胱氨酸和半胱氨酸原料藥的需求量已超過12000噸，而我國出口量始終保持在30004000噸。 近年來國內(nèi)興建的一批較大的羽絨制品廠提絨后剩下的鴨毛、 鵝毛羽毛梗已被用于代替人發(fā)和豬毛作為生產(chǎn)胱氨酸的原料,球狀蛋白質(zhì),在水溶液中球樣蛋白。Globular proteins, or spheroproteins The term globular protein is quite old (dating probably from the 19th century) 現(xiàn)在鑒于成千上萬的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，有時(shí)以更優(yōu)雅的描述詞匯 structural motif 。 分子極性：疏水基團(tuán)在分子內(nèi)部，而極

9、性親水基團(tuán)在分子外部,Globular proteins,膜蛋白,膜蛋白是細(xì)胞膜或細(xì)胞器的蛋白質(zhì)分子 膜蛋白可分為兩組： integral membrane protein peripheral membrane protein or Integral amphitropic,膜蛋白,蛋白結(jié)構(gòu)分類,對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類的方法有多種，有多個(gè)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（包括SCOP、CATH和FSSP）分別采用不同的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分類。存放蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的PDB數(shù)據(jù)庫中就引用了SCOP的分類。 對于大多數(shù)已分類的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來說，SCOP、CATH和FSSP的分類是相同的，但在一些結(jié)構(gòu)中還有所區(qū)別。仍存在一些分歧和矛盾。

10、 一級數(shù)據(jù)庫,二級數(shù)據(jù)庫,在一級數(shù)據(jù)庫、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論分析的基礎(chǔ)上，針對不同的研究內(nèi)容和需要，對生物學(xué)知識和信息的進(jìn)一步整理得到的數(shù)據(jù)庫。 人類基因組圖譜庫 GDB 轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)合位點(diǎn)庫 TRANSFAC 蛋白質(zhì)序列功能位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫 Prosite,SWISSPROT,1. 日內(nèi)瓦大學(xué)醫(yī)學(xué)生物化學(xué)系和歐洲生物信息學(xué)研究所 (EBI)合作維護(hù)（1986年）； 2. 在EMBL和GenBank數(shù)據(jù)庫上均建立了鏡像站點(diǎn); 3. 數(shù)據(jù)庫包括了從EMBL翻譯而來的蛋白質(zhì)序列，這些 序列經(jīng)過檢驗(yàn)和注釋； 4. 數(shù)據(jù)記錄包括兩部分： 序列 注釋(結(jié)構(gòu)域、功能位點(diǎn)、跨膜區(qū)域、二硫鍵位置、翻譯后的修飾、突變體等)

11、 5. SWISS-PROT的網(wǎng)址： /sprot,PIR(protein information resource,由美國NCBI翻譯自GenBank的DNA序列(1984年)； 在EMBL和GenBank數(shù)據(jù)庫上均建立了鏡像站點(diǎn)； 數(shù)據(jù)依據(jù)注釋的質(zhì)量分為4類。 PIRPIR網(wǎng)址： ,一個(gè)數(shù)據(jù)庫記錄(entry)一般由兩部分組成： 1. 原始數(shù)據(jù)(data) 2. 描述這些數(shù)據(jù)生物學(xué)信息的注釋(annotation) 注釋中包含的信息與相應(yīng)的序列數(shù)據(jù)同樣重要和有應(yīng)用價(jià)值 數(shù)據(jù)的完整性和注釋工作量：

12、 1. 序列數(shù)據(jù)廣，序列注釋不夠完整 2. 庫數(shù)據(jù)面窄，序列注釋全面 數(shù)據(jù)庫的動(dòng)態(tài)更新： 1.不斷增加 2.不斷修正,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次,初級結(jié)構(gòu):一級結(jié)構(gòu)(primary structure)； 高級結(jié)構(gòu): 二級結(jié)構(gòu)（secondary structure） 超二級結(jié)構(gòu)（supersecondary structure） 結(jié)構(gòu)域（structural domain） 三級結(jié)構(gòu)（tertiary structure） 四級結(jié)構(gòu)（quarternary structure,初級結(jié)構(gòu),今天已知約有10萬蛋白質(zhì)的氨基酸序列 兩個(gè)主要的蛋白質(zhì)測序方法： Edman degradation reactio

13、n Mass spectrometry 預(yù)測蛋白質(zhì)序列：從DNA / RNA序列,蛋白質(zhì)序列分析策略,鏈的分離純化。 鏈內(nèi)二硫鍵裂切割（如果是鏈間二硫鍵的聯(lián)系，第2步在第1步之前） 氨基酸組成確定 N -末端和C -末端氨基酸分析 用不同的切割程序產(chǎn)生不同和重疊多肽片段 短肽自動(dòng)化程序測序 氨基酸序重疊片段列重建。 二硫鍵定位,組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目種類,將肽鏈水解成片斷,將肽鏈水解，胰蛋白酶（LysArg）， 胰凝乳蛋白酶（PheTyrTrp） 溴化氰（Met,The Edman degradation reaction,質(zhì)譜分析,自約翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi

14、.Tanaka)發(fā)明了對生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的方法及發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析法以來，隨著生命科學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物質(zhì)譜目前已成為有機(jī)質(zhì)譜中最活躍、最富生命力的前沿研究領(lǐng)域之一,質(zhì)譜分析,傳統(tǒng)的Edman降解技術(shù)獲得氨基酸序列信息只能逐個(gè)獲取,效率低,不能適應(yīng)高通量實(shí)驗(yàn)的需求; 質(zhì)譜技術(shù)為快速準(zhǔn)確地獲取蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)信息提供了新的檢測技術(shù)手段。首先通過質(zhì)譜儀測量蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量信息, 獲得樣本的質(zhì)譜信息，然后據(jù)此進(jìn)行計(jì)算分析和推理, 來獲得蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)信息, 該過程即蛋白質(zhì)鑒定(protein identification,質(zhì)譜分析的特點(diǎn),質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分

15、子的研究具有如下優(yōu)點(diǎn)： 很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息 能最有效地與色譜聯(lián)用 適于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測定 同時(shí)具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性,質(zhì)譜分析的方法,用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)： 1)電噴霧電離質(zhì)譜；(electrospray ionisation，ESI) 2)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜；(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI) 3)快原子轟擊質(zhì)譜 4)離子噴霧電離質(zhì)譜 5)大氣壓電離質(zhì)譜。 在這些軟電離技術(shù)中，前面種研究得最多，應(yīng)用也最廣泛,蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析,蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特

16、殊方式組合的生物大分子，復(fù)雜結(jié)構(gòu)主要包括以肽鏈為基礎(chǔ)的肽鏈線型序列稱為一級結(jié)構(gòu)及由肽鏈卷曲折疊而形成三維結(jié)構(gòu)。 目前質(zhì)譜主要測定蛋自質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置,蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析原理,以往質(zhì)譜()僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)分析. 由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開始用于生物大分子的分析。 其原理是：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(/值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的/值，分析鑒定未知蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)和肽的序列分析,近年來隨著

17、電噴霧電離質(zhì)譜(ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能， 檢測限下降到fmol級 可測定分子量范圍則高達(dá)100000 Da 目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI TOF MS)已成為測定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級結(jié)構(gòu)的有效工具，也是蛋白質(zhì)組研究所必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一,蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方式,質(zhì)譜用于肽和蛋白質(zhì)的序列測定主要分為三種方法： 蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶或化學(xué)方法將蛋白水解切成小片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫。將蛋白質(zhì)繪制“肽圖”，

18、肽質(zhì)量指紋譜(peptide mass fingerprinting, PMF) 第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基，其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂. 第三種方法與Edman法相似，即用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從端或端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測序(laddersequencing)，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基,質(zhì)譜儀,質(zhì)譜儀是使大量分子帶上電荷(離子), 并根據(jù)不同離子的質(zhì)量與電荷比的差異而導(dǎo)致它們在電場或磁場中運(yùn)動(dòng)軌跡的不同而對這些離子

19、進(jìn)行分離, 進(jìn)而測量這些離子的質(zhì)荷比與強(qiáng)度, 并記錄下來獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)的一種儀器. 它由三大部分串聯(lián)而成： 離子源(ion source) 質(zhì)量分析器(mass analyzer) 檢測器(detector,Main steps of mass spectrometer,用質(zhì)譜測定序列,串聯(lián)質(zhì)譜Tandem mass spectrometry,串聯(lián)質(zhì)譜儀是能夠多輪質(zhì)譜。 第一個(gè)質(zhì)量分析器可以分離許多進(jìn)入質(zhì)譜儀的一個(gè)多肽。 第二個(gè)質(zhì)量分析器穩(wěn)定肽離子碰撞時(shí)的氣體，使他們片段的碰撞誘導(dǎo)解離(CID) 。 第三個(gè)質(zhì)量分析器分離多肽產(chǎn)生的各種碎片。 有各種方法：碰撞誘導(dǎo)解離(CID) ，電子捕獲解離(E

20、CD) ，電子轉(zhuǎn)移解離（ ETD ） ，紅外多光子解離（ IRMPD ）和紅外輻射解離(BIRD,Protein mass spectrometry,串聯(lián)質(zhì)譜儀通常的兩個(gè)主要電離方法： electrospray ionization (ESI) matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI). 兩種策略： 完整蛋白質(zhì)首先離子化，然后進(jìn)分析儀。這種稱為“自上而下”的策略。 蛋白質(zhì)用蛋白酶消化成較小的多肽和引入質(zhì)譜儀和確定。他的做法也被稱為“自下而上”的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)研究中的質(zhì)譜技術(shù),2002 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)： MALDI 和ESI技術(shù)的發(fā)明

21、 基于質(zhì)譜技術(shù)在計(jì)算蛋白質(zhì)研究中主要包括： 蛋白質(zhì)的身份鑒定 氨基酸序列信息分析 翻譯后修飾分析 定量化信息 提取生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)與疾病診斷建模等,蛋白質(zhì)組學(xué)Proteomics,The word proteome ：protein and genome蛋白質(zhì)是生物體或系統(tǒng)的整個(gè)蛋白質(zhì)，包括修飾的蛋白質(zhì)。 術(shù)語“蛋白質(zhì)組學(xué)”來自基因組學(xué)類推,蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容,1.蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合Western等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定研究。 2.翻譯后修飾：很多蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化，糖基化等。對蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究對闡明蛋白質(zhì)的

22、功能具有重要作用。 3.蛋白質(zhì)功能確定：如分析酶活性和確定酶底物，配基-受體結(jié)合分析?？梢岳没蚯贸头戳x技術(shù)分析基因表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能。 蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位研究，Clontech的熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的一個(gè)很好的工具。 4.蛋人類白質(zhì)組學(xué)的研究最主要是促進(jìn)分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子,蛋白質(zhì)組學(xué),蛋白質(zhì)分離 :雙向凝膠電泳 蛋白質(zhì)鑒定和相對數(shù)量測定:基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜maldi-ms/ms和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜 esi-ms/ms,Two-dimensional gel electrophoresis,分離技術(shù)：雙向凝膠電泳，為2-D或二維電泳 等電聚焦 Is

23、oelectric focusing SDS -PAGE 分子生物學(xué)的ExPASy網(wǎng)，日內(nèi)瓦大學(xué)（http:/expasy.hcuge.ch/）提供了訪問二維聚丙烯酰胺凝膠電泳數(shù)據(jù)庫，命名 SWISS-2D-PAGE。這個(gè)數(shù)據(jù)庫包含來自許多不同的細(xì)胞和組的蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠信息,等電聚焦,SDS - PAGE,雙向凝膠電泳,為什么要進(jìn)行樣品制備,目前雙向電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，而樣品中的蛋白種類可達(dá)到10萬種以上，因此樣品的制備是必須的。 樣品制備需要不同步驟，不同方法來配合。 首先需要明確實(shí)驗(yàn)的最終目的：是分離盡可能多的蛋白還是樣品中某些感興趣的蛋白。 蛋白的溶解的效

24、果取決于裂解、破碎、沉淀、溶解過程以及去污劑的選擇和各種溶液的組成。 如果是樣品中部分感興趣蛋白，可采取預(yù)分離的方法，如來自細(xì)胞器蛋白，應(yīng)先采取細(xì)胞器分離；如進(jìn)行全蛋白質(zhì)組分析，則可以分級制備,樣品制備的原則,應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。 防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性,AXIMA-QIT MALDI-QIT-TOF Mass Spectroscop

25、y,蛋白質(zhì)構(gòu)象,二級結(jié)構(gòu) Secondary structure 三級結(jié)構(gòu) Tertiary structure 四級結(jié)構(gòu) Quaternary structure,蛋白質(zhì)構(gòu)象,蛋白質(zhì)構(gòu)象測定 蛋白質(zhì)構(gòu)象預(yù)測,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定方法,高分辨率：X射線晶體學(xué)|核磁共振|電子晶體學(xué) 中分辨率： 低溫電子顯微鏡Cryo-electron microscopy 光纖衍射 質(zhì)譜 光譜：核磁共振|圓二色|熒光|各向異性熒光 平移擴(kuò)散分析超離心 排阻色譜 流動(dòng)雙折射 介電弛豫化學(xué)：氫氘交換|定點(diǎn)突變|化學(xué)修飾 熱力學(xué)：平衡展開,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中大約90的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由X射線晶體學(xué)確定。大約9的蛋

26、白質(zhì)結(jié)構(gòu)由核磁共振獲得。 低溫電子顯微鏡Cryo-electron microscopy最近已成為一種手段來確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)高分辨率（小于5?；?.5納米） ，在未來的十年是一種高分辨率的工具,晶體x射線 an X-Ray Beam, a Crystal, and a Detector,Workflow for solving the structure of a molecule by X-ray crystallography,Crystallization of Myoglobin,Myoglobin Crystal and X-Ray. (A) Crystal of myoglobin.

27、 (B) X-ray precession photograph of a myoglobin crystal,Section of the Electron-Density Map of Myoglobin. This section of the electron-density map shows the heme group. The peak of the center of this section corresponds to the position of the iron atom,Resolution Affects the Quality of an Image. The

28、 effect of resolution on the quality of a reconstructed image is shown by an optical analog of x-ray diffraction: (A) a photograph of the Parthenon; (B) an optical diffraction pattern of the Parthenon; (C and D) images reconstructed from the pattern in part B. More data were used to obtain image D t

29、han image C, which accounts for the higher quality of image D,蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)開始在1950年代后期,因?yàn)檫@成功,超過39000 x射線晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、核酸及其他的生物分子巳測定,myoglobin,限制 小分子晶體通常少于100原子不對稱單位;這種晶體結(jié)構(gòu)通常好解決。 生物大分子晶體在晶胞往往涉及成千上萬的原子。這種晶體結(jié)構(gòu)一般的解決較差（smeared out ）-原子和化學(xué)鍵顯示電子密度管，而不是孤立的原子。 內(nèi)在膜蛋白的結(jié)晶仍然具有挑戰(zhàn)性,核磁共振光譜,核磁共振波譜用于獲取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)的信息。 Kurt Wthric

30、h開創(chuàng)，2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 核磁共振（Nuclear Magnetic ResonanceNMR） ，即核磁共振成像（Nuclear Magnetic Resonance Imaging，NMRI），又稱磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI） NMR技術(shù)即核磁共振譜技術(shù)，是將核磁共振現(xiàn)象應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)測定的一項(xiàng)技術(shù)。 核磁共振譜與紫外光譜、紅外光譜和質(zhì)譜一起被稱為“四大名譜,核磁共振光譜學(xué)的基礎(chǔ),One-Dimensional NMR Spectra. (A) 1H-NMR spectrum of ethanol (CH3CH2OH) shows th

31、at the chemical shifts for the hydrogen are clearly resolved. (B) 1H-NMR spectrum from a 55 amino acid fragment of a protein with a role in RNA splicing shows a greater degree of complexity. A large number of peaks are present and many overlap,The Nuclear Overhauser Effect. The nuclear Overhauser ef

32、fect (NOE) identifies pairs of protons that are in close proximity. (A) Schematic representation of a polypeptide chain highlighting five particular protons. Protons 2 and 5 are in close proximity (4 apart), whereas other pairs are farther apart. (B) A highly simplified NOESY spectrum. The diagonal

33、shows five peaks corresponding to the five protons in part A. The peaks above the diagonal and the symmetrically related one below reveal that proton 2 is close to proton 5,Detecting Short Proton-Proton Distances. A NOESY spectrum for a 55 amino acid domain from a protein having a role in RNA splici

34、ng. Each off-diagonal peak corresponds to a short proton-proton separation. This spectrum reveals hundreds of such short proton-proton distances, which can be used to determine the three-dimensional structure of this domain,Structures Calculated on the Basis of NMR Constraints. (A) NOESY observation

35、s show that protons (connected by dotted red lines) are close to one another in space. (B) A three-dimensional structure calculated with these proton pairs constrained to be close together,A Family of Structures. A set of 25 structures for a 28 amino acid domain from a zinc-finger-DNA-binding protei

36、n. The red line traces the average course of the protein backbone. Each of these structures is consistent with hundreds of constraints derived from NMR experiments. The differences between the individual structures are due to a combination of imperfections in the experimental data and the dynamic na

37、ture of proteins in solution,900MHz, 21.2T NMR Magnet at HWB-NMR, Birmingham,Cryo-electron microscopy,Electron cryomicroscopy (cryo-EM or cryo-electron microscopy) 是一種形式的電子顯微學(xué)（ EM ），研究的樣本是在結(jié)晶溫度（一般液態(tài)氮）的 電子晶體顯微圖是三維圖像 這種方法可能提供一種新的建立近天然蛋白質(zhì)骨架或其他大分子模型的的解決方案。 CryoEM是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展,Wen Jiang, Matthew L. Baker, Jo

38、anita Jakana, Peter R. Weigele, Jonathan King R)=0 若R的發(fā)生有利于S的發(fā)生，則I(S; R)0 若R的發(fā)生不利于S的發(fā)生，則I(S; R)0,I(S; R)在二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中的含義 R代表中心氨基酸及其所處環(huán)境 S代表二級結(jié)構(gòu)類型 I(S; R)代表中心氨基酸處于S的信息值,例如：假定數(shù)據(jù)庫中有1830個(gè)殘基， 780個(gè)處于螺旋態(tài)，1050個(gè)處于非螺旋態(tài)，庫中共有390個(gè)丙氨酸（A），有240個(gè)A處于螺旋態(tài)，其余150個(gè) A 處于非螺旋態(tài)。可得,基于已有知識的預(yù)測方法（knowledge based method,這類預(yù)測方法包括Lim 和 C

39、ohen 兩種方法。 Lim 方法是一種物理化學(xué)的方法，它根據(jù)氨基酸殘基的物理化學(xué)性質(zhì)，包括：疏水性、親水性、帶電性以及體積大小等，并考慮殘基之間的相互作用而制訂出一套預(yù)測規(guī)則。對于小于50個(gè)氨基酸殘基的肽鏈， Lim 方法的預(yù)測準(zhǔn)確率可以達(dá)到73%. 另一種是 Cohen 方法，它的提出當(dāng)時(shí)是為了/蛋白的預(yù)測，基本原理是說：疏水性殘基決定了二級結(jié)構(gòu)的相對位置，螺旋亞單元或擴(kuò)展單元是結(jié)構(gòu)域的核心，螺旋和折疊組成了結(jié)構(gòu)域,人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法進(jìn)行序列的預(yù)測，即反饋式神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法是目前二級結(jié)構(gòu)預(yù)測應(yīng)用最廣的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，它是由三層相同的神經(jīng)元構(gòu)成的層狀網(wǎng)絡(luò)，使用反饋式學(xué)習(xí)規(guī)則，在學(xué)習(xí)過

40、程中根據(jù)輸入的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的關(guān)系的信息不斷調(diào)整各單元之間的權(quán)重，最終目標(biāo)是找到一種好的輸入與輸出的映象，并對未知二級結(jié)構(gòu)的蛋白進(jìn)行預(yù)測 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用方便，獲得結(jié)果較快較好，主要缺點(diǎn)是沒有反映蛋白的物理和化學(xué)特性，而且利用大量的可調(diào)參數(shù)，使結(jié)果不易理解。許多預(yù)測程序如PHD、PSIPRED等均結(jié)合利用了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的計(jì)算方法,綜合方法,綜合方法不僅包括各種預(yù)測方法的綜合，而且也包括結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果、序列對比結(jié)果、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類預(yù)測結(jié)果等信息的綜合。 多個(gè)程序同時(shí)預(yù)測，綜合評判一致結(jié)果 序列比對與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 雙重預(yù)測 首先預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)類型 然后再預(yù)測二級結(jié)構(gòu),利用進(jìn)化信息預(yù)測蛋白質(zhì)

41、的二級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)序列家族中氨基酸的替換模式是高度特異的，如何利用這樣的進(jìn)化信息是二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的關(guān)鍵。 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件系統(tǒng) PHD 第一步工作是形成同源序列的多重對比排列 第二步工作是將得到的多重比對的統(tǒng)計(jì)結(jié)果送到一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中計(jì)算,Levels of protein structure,motif 與 domain,Motif ，模體，基序,Motif in biochemistry,Motif ，模體，基序，超二級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)有規(guī)律的組合。 Structural motif, 結(jié)構(gòu)模體,氨基酸的空間排列形成的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)類型,核苷酸的空間排列形成的核酸空間結(jié)構(gòu)類型 Sequen

42、ce motif, DNA中一個(gè)核苷酸序列模式或蛋白質(zhì)中一個(gè)序列模式 晶體結(jié)構(gòu)的一個(gè)重復(fù)模式元件,Sequence motif,遺傳學(xué)：序列模體是一個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列模式,普遍分布,被推測有生物學(xué)意義。 元素的一個(gè)重復(fù)模式在水晶結(jié)構(gòu) 對蛋白質(zhì),序列模體區(qū)別于結(jié)構(gòu)模體,一個(gè)結(jié)構(gòu)模體所形成的三維排列,氨基酸不接近,Sequence motif,When a sequence motif appears in the exon of a gene, it may encode the structural motif of a protein Outside of gene exons, th

43、ere exist regulatory sequence motifs and motifs within the junk, such as satellite DNA. Some of these are believed to affect the shape of nucleic acids , but this is only sometimes the case. Short coding motifs, which appear to lack secondary structure, include those that label proteins for delivery

44、 to particular parts of a cell, or mark them for phosphorylation. Within a sequence or database of sequences, researchers search and find motifs using computer-based techniques of sequence analysis, such as BLAST,Structural motif types in proteins,Examples of motif types in proteins,Beta ribbon Omeg

45、a loop Helix-loop-helix Zinc finger Helix-turn-helix Beta hairpin,Motif bioinformatics,Motifs and consensus sequences De novo computational discovery of motifs Discovery through evolutionary conservation Pattern description notations PROSITE pattern notation Matrices Another scheme,Motif-finding met

46、hods,MINIMOTIF MINER The public interface to the minimotif miner database PROSITE Database of protein families and domains Database and Analysis Suite for Quadruplex forming motifs in Nucleotide Sequences The MEME/MAST System for Motif Discovery and Search MEME Documentation TRANSFAC: A public datab

47、ase for transcription factor motifs,eMotif homepage (from Stanford University) Bioprospector homepage (from Stanford University) TEIRESIS homepage Improbizer homepage BLOCK-maker homepage NCBI Home Page NIHs National Library of Medicine NCBI (National Center for Biotechnology Information) Transcriptional Regulation Wiki Wikiomic Sequence motifs page PLACE,Protein binding motif,Protein binding motif is a short protein sequence motif that interacts with other proteins. A typical example of such motif are proline-rich sequences that are responsible for binding of SH3 domains. Protein binding seq