離子交換色譜ppt課件

1、離子交換色譜,Ion exchange chromatography,IEC,2021/2/16,內(nèi) 容,一、離子交換色譜的基本原理 二、離子交換劑的基本性質(zhì) 三、離子交換介質(zhì)的選擇原則 四、離子交換色譜的基本操作,一、基本原理,1、基本原理 以離子交換樹脂等作為固定相，樹脂上具有固定離子基團及可交換的離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換。根據(jù)組分離子對樹脂親合力不同而得到分離,2、平衡常數(shù) 離子交換反應(yīng)和其他化學(xué)反應(yīng)一樣，完全服從質(zhì)量作用定律，且離子交換劑與溶液中的離子或離子化合物所進行的離子交換反應(yīng)是可逆的。 陽離子交換劑RA，

2、在溶液中解離出陽離子A+與溶液中的陽離子B+發(fā)生可逆交換反應(yīng)：RA+B+ RB+A+ 離子交換劑對溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，離子交換劑的選擇性可用平衡常數(shù)K表示,1 2 3 4 5,反離子,樣品溶液,梯度溶液,1-平衡階段：離子交換劑與反離子結(jié)合 2-吸附階段：樣品與反離子進行交換 3,4-梯度緩沖液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，再洗下強吸附物質(zhì) 5-再生階段：原始平衡緩沖液進行充分洗脫，即可重復(fù)使用,圖1 IEC原理示意圖,二、離子交換劑的基本性質(zhì),1、離子交換劑應(yīng)具備高度的不溶性，保證在各種溶劑中不會發(fā)生溶解； 2、具備穩(wěn)定的理化性質(zhì)，不能因物理化學(xué)變化而發(fā)生分解； 3、具有較大的表面積或

3、疏松的孔狀結(jié)構(gòu)，確保交換離子自由地發(fā)生擴散和交換,離子交換劑,1、疏水性離子交換劑 與水親和力較小的人工合成樹脂 （1）陽離子交換劑 陽離子交換樹脂具有酸性基團，電荷基團帶負電，反離子帶正電，可與溶液中的陽離子或帶正電荷的化合物進行交換反應(yīng)。 （2）陰離子交換劑 陰離子交換樹脂是在基質(zhì)骨架上引入伯胺-NH2、仲胺-NHCH3、叔胺-N(CH3)2和季胺-N+(CH3)3基團后構(gòu)成的,2、親水性離子交換劑 基質(zhì)為與水親和力較大的天然或人工的化合物 （1）纖維素離子交換劑 以微晶纖維素為基質(zhì)，再引入電荷基團構(gòu)成，最為廣泛使用的是二乙氨基乙基（DEAE-）纖維素和羧甲基（CM-）纖維素。 （2）交聯(lián)

4、葡聚糖離子交換劑 以交聯(lián)葡聚糖G-25和G-50為基質(zhì)，通過化學(xué)方法引入電荷而制成的。 （3）瓊脂糖離子交換劑 以交聯(lián)瓊脂糖CL-6B為基質(zhì)，引入電荷基團而構(gòu)成,三、離子交換劑的選擇原則,1、離子交換劑的選擇 （1）如果被分離物質(zhì)帶正電荷，則選用陽離子交換劑；如果帶負電荷，應(yīng)選用陰離子交換劑。 （2）強型離子交換劑適用的pH范圍很廣，用來分離一些在極端pH中解離且較穩(wěn)定的物質(zhì)；弱型則適宜用來分離生物大分子，活性不易喪失。 （3）在分離生物大分子物質(zhì)時，由于親水性基質(zhì)對被分離物質(zhì)的吸附和洗脫都比較溫和，生物活性不易破壞而常被選用。 （4）交換容量：通常選用離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進行交

5、換能力較大的介質(zhì)。 （5）交換速度：一般選用交換速度快的介質(zhì),2、緩沖液的選擇 （1）對于兩性蛋白質(zhì)來說，緩沖液的pH決定蛋白質(zhì)在該緩沖體系下所帶的電荷， 以一個pI為5的蛋白為例,蛋 白 質(zhì) 凈 電 荷,pH pI（,2）在離子交換劑的交換容量固定的情況下，起始緩沖液的濃度應(yīng)盡可能的低 （3）緩沖液離子不影響被分離蛋白或干擾其活性，同時不應(yīng)影響目標蛋白的溶解度,四、離子交換色譜的基本操作,圖3 IEC裝置示意圖,一）交換劑的預(yù)處理、再生 （1）用水浸透使干樹脂吸水溶脹，再用酸、堿處理除去水中的不溶性雜質(zhì)。 （2）再生是指將用過的離子交換劑恢復(fù)原狀的處理過程,二）交換劑裝柱 （1）離子交換色譜柱的選用 （2）裝柱 垂直裝柱，嚴防氣泡和斷層,當所用的交換劑與待分離物質(zhì)各組分之間親和力差不多而需要交換劑體積較大時，以增加柱長為宜，使待分離組分被洗脫后再結(jié)合于交換劑上的概率增加。柱的直徑與高度比以1:20左右為宜。 如采用離子強度較大的洗脫液梯度洗脫時，以選用粗而短的柱子為宜，因為當柱上洗脫液的離子強度高到足以完全取代被吸附離子時，這些被置換的離子則以同洗脫液等速率向下移動，如果柱細長，就增加了脫附離子擴散的機會,三）樣品上柱、洗脫和收集 （1）上柱 （2）洗脫 IEC中的洗脫是至關(guān)重要的一步，從交換劑上把被吸附的物質(zhì)洗脫下來，有兩種方法：一種是增加離子