臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的質(zhì)量保證

1、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的質(zhì)量保證,衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心 李金明,定 義,質(zhì)量保證(Quality Assurance,QA) 為一產(chǎn)品或服務(wù)滿足特定質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計(jì)劃的和系統(tǒng)的措施。 室內(nèi)質(zhì)量控制（Internal Quality Control,IQC) 由實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測(cè)和控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測(cè)定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)工作,定 義,室間質(zhì)量評(píng)價(jià) （External Quality Assessment, EQA） 為客觀比較一實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果與靶值的

2、差異，由外單位機(jī)構(gòu)，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性。這是對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作和實(shí)驗(yàn)方法的回顧性評(píng)價(jià)，而不是用來決定在實(shí)時(shí)的測(cè)定結(jié)果的可接受性。當(dāng)EQA用來為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒?yàn)室認(rèn)證的目的而評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，常描述為實(shí)驗(yàn)室能力比對(duì)檢驗(yàn)（Proficiency testing, PT）。在以前的文獻(xiàn)中，EQA常描述室間質(zhì)量控制,定 義,準(zhǔn)確度 (Accuracy) 待測(cè)物的測(cè)定值與其真值的一致性程度。準(zhǔn)確度不能直接以數(shù)值表示，通常以不準(zhǔn)確度來間接衡量。對(duì)一分析物重復(fù)多次測(cè)定，所得均值與其真值或參考靶值之間的差異亦即偏差即為測(cè)定的不準(zhǔn)確度。 偏差

3、 (Bias) 待測(cè)物的測(cè)定值與一可接受參考值之間的差異,定 義,精密度(Precision) 在一定條件下所獲得的獨(dú)立的測(cè)定結(jié)果之間的一致性程度。與準(zhǔn)確度一樣，精密度同樣也是以不精密度來間接表示。測(cè)定不精密度的主要來源是隨機(jī)誤差，以標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和/或變異系數(shù)（CV）具體表示。SD或CV越大，表示重復(fù)測(cè)定的離散度越大，精密度越差，反之則越好,定 義,批 (Run) 在相同條件下所獲得的一組測(cè)定。 均值（Mean） 標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation, SD或s） 變異系數(shù)（Coefficient of variation, CV,定 義,正態(tài)分布(Gaussian distribu

4、tion) 當(dāng)一質(zhì)控物用同一方法在不同的時(shí)間重復(fù)多次測(cè)定，當(dāng)測(cè)定數(shù)據(jù)足夠多時(shí)，如以橫軸表示測(cè)定值，縱軸表示在大量測(cè)定中相應(yīng)測(cè)定值的個(gè)數(shù)，則可得到一個(gè)兩頭低，中間高，中為所有測(cè)定值的均值，左右對(duì)稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布,定 義,正態(tài)分布的基本統(tǒng)計(jì)學(xué)含義可用均數(shù)（）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和概率來說明,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)測(cè)定步驟,標(biāo)本收集：選擇測(cè)定項(xiàng)目、標(biāo)本收集和保存。 實(shí)驗(yàn)室測(cè)定：標(biāo)本接收、貼標(biāo)簽、樣本處理、核酸擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)、測(cè)定的有效性和臨床診療價(jià)值。 報(bào)告和解釋：結(jié)果發(fā)出、結(jié)果解釋和臨床管理,質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)之間的關(guān)系,臨床標(biāo)本收集、運(yùn)送、保存及其質(zhì)量控制,標(biāo)

5、本收集 標(biāo)本保存 標(biāo)本運(yùn)送,標(biāo)本收集,標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響 標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備 標(biāo)本的類型和采集量 采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià) 采樣及運(yùn)輸容器 標(biāo)本采集中的防污染,標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響,在疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都可能會(huì)給出假陰性結(jié)果,標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備,標(biāo)本采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物或其它雜物,但應(yīng)適度,過度清潔消毒有可能會(huì)去掉或破壞靶微生物,故標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進(jìn)行,標(biāo)本的類型和采集量,標(biāo)本的類型: 血清(漿)、分泌物、痰、糞便、尿和腦脊液等。 標(biāo)本的采集量:應(yīng)根據(jù)所測(cè)病原體而定。一般來說，如果標(biāo)本的量對(duì)病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于

6、核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測(cè)。 對(duì)于定量測(cè)定來說，對(duì)標(biāo)本的收集要求更為精確,采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià),血清(漿)標(biāo)本:溶血、脂血等； 分泌物、痰：評(píng)價(jià)內(nèi)容包括細(xì)胞組成，所需類型細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。 評(píng)價(jià)方法：包括肉眼觀察,顯微鏡下觀察和化學(xué)分析等,采樣及運(yùn)輸容器,標(biāo)本的采集材料如棉簽應(yīng)為一次性使用； 運(yùn)輸容器亦應(yīng)為密閉的一次性裝置； 采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)過程造成干擾,標(biāo)本采集中的防污染,采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等； 如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RNase失活,標(biāo)本保存,靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解

7、，因此標(biāo)本的保存對(duì)于核酸擴(kuò)增測(cè)定的有效性極為重要。 使用GITC作為穩(wěn)定劑保存標(biāo)本，標(biāo)本可在室溫下穩(wěn)定約7天,標(biāo)本保存,臨床體液標(biāo)本長(zhǎng)期保存應(yīng)在-70下。 如為提取核酸后用于DNA擴(kuò)增分析的樣本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)緩沖液中4 下保存。 用于RNA擴(kuò)增分析的樣本，則應(yīng)于上述緩沖液中-80或液氮下保存。 核酸的乙醇沉淀物則可于-20下保存,標(biāo)本運(yùn)送,樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。 樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測(cè)定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測(cè)定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)

8、待測(cè)靶核酸的特性，對(duì)各種臨床樣本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)量控制,測(cè)定前的質(zhì)量控制 核酸樣本的制備及其質(zhì)量控制 統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制 質(zhì)量控制的評(píng)價(jià),測(cè)定前質(zhì)量控制,實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理 理想的試劑和操作方法 人員培訓(xùn),實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充分合理的空間、良好的照明和空調(diào)設(shè)備 ； 實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備應(yīng)保養(yǎng)良好，實(shí)驗(yàn)用品要達(dá)到相應(yīng)的要求。加樣器的校準(zhǔn)？帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢？離心機(jī)？熱循環(huán)儀？水浴箱和/或恒溫干浴儀？酶標(biāo)儀和洗板機(jī),基因擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控,帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢,首先制備一個(gè)含12%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸頭的最

9、大體積為100l，則將加樣器吸取體積調(diào)至110120l，再套上吸頭后吸取上述有色液體。如果吸頭質(zhì)量好，則有色液體不應(yīng)出現(xiàn)在濾塞之上，否則說明濾塞不嚴(yán),帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢,用實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)帶濾塞吸頭的質(zhì)量：先純化制備數(shù)份強(qiáng)陽(yáng)性和數(shù)份陰性核酸標(biāo)本，然后將加樣器吸取量設(shè)至擴(kuò)增加樣所需的體積，使用待評(píng)價(jià)帶濾塞吸頭對(duì)一份強(qiáng)陽(yáng)性樣本來回吸取10次（模擬10份陽(yáng)性樣本的吸?。?，將最后一次的吸取液加至一含擴(kuò)增反應(yīng)液的管中，之后，換一個(gè)新吸頭，連續(xù)吸取10份陰性樣本分別至10個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)管中，此過程重復(fù)35次，最后對(duì)每一管按所用試劑方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。強(qiáng)陽(yáng)性樣本應(yīng)為強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性弱或出現(xiàn)陰性則說明吸頭可能含有擴(kuò)增抑制

10、物。所有陰性樣本應(yīng)為陰性，出現(xiàn)陽(yáng)性則表明吸頭不能有效地防止氣溶膠對(duì)加樣器的污染,擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的檢測(cè)方法,一是使用一種熱電偶探針、微伏轉(zhuǎn)換器和自動(dòng)圖示記錄儀組成擴(kuò)增加熱模塊孔內(nèi)溫度監(jiān)測(cè)記錄系統(tǒng)，當(dāng)孔間溫度變異超出1時(shí)，其可測(cè)出來。 具體做法是將裝有TE緩沖液并上加石蠟油的擴(kuò)增反應(yīng)管放置于擴(kuò)增儀各孔中，熱電偶探針透過擴(kuò)增反應(yīng)管蓋插至緩沖液中，然后按程序進(jìn)行一個(gè)常規(guī)的PCR擴(kuò)增，加熱模塊如為96孔，則至少要測(cè)定12孔不同位置孔內(nèi)的溫度，在整個(gè)擴(kuò)增過程中，可移動(dòng)熱電偶探針至上述不同孔中監(jiān)測(cè)溫度，但每一孔內(nèi)溫度監(jiān)測(cè)至少要有一個(gè)擴(kuò)增周期,擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的檢測(cè)方法,第二種方

11、法并非直接測(cè)定孔內(nèi)溫度，而是通過擴(kuò)增功能來間接獲知孔間的均一性，即將加有一已知的含一定濃度的陽(yáng)性質(zhì)控樣本的擴(kuò)增反應(yīng)管置于擴(kuò)增儀各孔中按常規(guī)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，觀察結(jié)果的一致性程度，如果有某一個(gè)或幾個(gè)孔結(jié)果有問題，則應(yīng)確定這一個(gè)或幾個(gè)孔是否會(huì)重復(fù)性地得到假陰性結(jié)果，如果是，則表明相應(yīng)孔的熱傳導(dǎo)有損壞,理想的試劑和操作方法,試劑盒的質(zhì)檢 定量測(cè)定的精密度是測(cè)定組成步驟的變異和的平方根(SD)= 上式中SDa、SDb、SDc是步驟a、b、c等（例如試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)等）的標(biāo)準(zhǔn)差,理想的試劑和操作方法,改善測(cè)定精密度的措施必須首先著重在最不精密的步驟上，應(yīng)對(duì)試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本收集、核酸

12、提取、測(cè)定方法和儀器操作寫出“標(biāo)準(zhǔn)操作程序”(SOP,人員培訓(xùn),臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的操作主要是標(biāo)本處理中的核酸提取步驟，這其中所涉及的又主要是加樣器的使用，盡管操作簡(jiǎn)單，但由于均為微量操作，要獲得穩(wěn)定可靠的測(cè)定結(jié)果，操作人員需要一定的專業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，要盡可能做到知其然又知其所以然,核酸樣本的制備、擴(kuò)增檢測(cè)及其質(zhì)量控制,一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理 核酸的分離純化 靶核酸提取的質(zhì)量 臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì) 核酸樣本制備及擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)控 產(chǎn)物檢測(cè)的質(zhì)控,一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理,靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞

13、內(nèi)，如測(cè)定的是病原微生物,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲或真菌細(xì)胞內(nèi)，如果上述細(xì)胞破裂,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。 一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來,核酸的分離純化,核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。 經(jīng)典方法 硅吸附法 對(duì)于商品核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對(duì)其核酸提取純度和效率進(jìn)行評(píng)價(jià),靶核酸提取的質(zhì)量,純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與一核酸標(biāo)準(zhǔn)比較測(cè)定。 核酸提取的產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測(cè)定。 核酸純度：可通過提取物A260/A2

14、80比率判定 血清或血漿中病原體核酸純化純度：采用一種間接的方法，即使用已知病原體含量的溶血和/或脂血標(biāo)本用待評(píng)價(jià)試劑提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，比較所得到的結(jié)果,臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì),臨床標(biāo)本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。 核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑,核酸樣本制備及擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)控,對(duì)臨床標(biāo)本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)控措施 核酸提取及擴(kuò)增有效性的質(zhì)控,對(duì)臨床標(biāo)本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)

15、控措施,質(zhì)控措施： 采用內(nèi)質(zhì)控（internal control, IC）（通常稱為內(nèi)標(biāo)）的方法 內(nèi)標(biāo)有兩種,即競(jìng)爭(zhēng)性的和非競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)標(biāo)。 內(nèi)標(biāo)設(shè)置的必要性,核酸提取及擴(kuò)增有效性的質(zhì)控,已知弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：至少帶1份，其最后的檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)是核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)的有效性的綜合反映。 已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：至少帶1份，擴(kuò)增測(cè)定的結(jié)果可以判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染,統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制,理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件 測(cè)定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序 統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的特點(diǎn) 統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法,理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件,基質(zhì)與待測(cè)樣本一致； 所含待測(cè)物濃度接近試驗(yàn)的決定性水平；

16、 穩(wěn)定； 靶值或預(yù)期結(jié)果已定； 無已知的生物傳染危險(xiǎn)性； 單批可大量獲得； 價(jià)廉,測(cè)定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序,每次檢測(cè)究竟使用幾個(gè)質(zhì)控樣本并排在臨床標(biāo)本中的哪個(gè)位置最為適宜？從理論上說，為最大可能地檢出實(shí)驗(yàn)的隨機(jī)和系統(tǒng)誤差，應(yīng)每隔幾份臨床標(biāo)本插入1份質(zhì)控樣本，但考慮國(guó)內(nèi)目前的實(shí)際情況及成本效益，一般來說，如果臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的標(biāo)本量不是特別大，定性測(cè)定有一份接近c(diǎn)ut-off的弱陽(yáng)性和一份陰性質(zhì)控樣本應(yīng)可以滿足要求。而定量測(cè)定則要根據(jù)試驗(yàn)的測(cè)定范圍，采用高、中、低三種濃度的質(zhì)控樣本。至于在測(cè)定中的排列順序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控的獨(dú)特性,即監(jiān)

17、測(cè)污染發(fā)生的陰性質(zhì)控的設(shè)置。 應(yīng)該包括1份陰性原血清樣本、1份在標(biāo)本核酸提取過程中帶入的一個(gè)空管和僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管,陰性原血清質(zhì)控樣本的功能,監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染； 由實(shí)驗(yàn)操作所致的標(biāo)本間的交叉污染； 擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染,在標(biāo)本核酸提取過程中帶入的一個(gè)空管的功能,基本功能與陰性原血清質(zhì)控樣本相同，但不同的是，其基質(zhì)為水，不含陰性原血清質(zhì)控樣本中可能有的擴(kuò)增抑制物，因而對(duì)污染的反映更為靈敏； 不能取代原血清陰性樣本,僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管的功能,監(jiān)測(cè)擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染，具有較強(qiáng)的污染鑒別性。 如想鑒別實(shí)驗(yàn)室是否發(fā)生污染，可將一個(gè)或多個(gè)空管打開靜置于標(biāo)本制備區(qū)3060分鐘，然后加

18、入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時(shí)以水替代核酸樣本擴(kuò)增，如為陽(yáng)性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管為陰性，則說明實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的存在,統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的特點(diǎn),檢驗(yàn)誤差有兩類，一是系統(tǒng)誤差，一是隨機(jī)誤差。 系統(tǒng)誤差通常表現(xiàn)為質(zhì)控物測(cè)定均值的漂移，是由操作者所使用的儀器設(shè)備、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)物出現(xiàn)問題而造成的，這種誤差可以通過前述的措施方法加以控制，是可以排除的。 隨機(jī)誤差則表現(xiàn)為測(cè)定SD的增大，主要是由實(shí)驗(yàn)操作人員的操作等隨機(jī)因素所致，其出現(xiàn)難以完全避免和控制,統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的功能,統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的功能就是發(fā)現(xiàn)誤差的產(chǎn)生及分析誤差產(chǎn)生的原因，采取措施予以避免。 開展統(tǒng)計(jì)質(zhì)量控制前，應(yīng)將可以控制的誤差產(chǎn)生因素盡可能地加以控

19、制，這不但是做好室內(nèi)質(zhì)控的前提，也是保證常規(guī)檢驗(yàn)工作質(zhì)量的先決條件,統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法,基線測(cè)定 質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義 Levey-Jennings質(zhì)控圖方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法 “即刻法”質(zhì)控方法,基線測(cè)定,最佳條件下的變異（Optimal conditions variance, OCV）和常規(guī)條件下的變異（Routine conditions variance, RCV）； 當(dāng)RCV與OCV接近，或小于2 OCV時(shí)，則RCV是可以接受的。以上為批間變異。 批內(nèi)變異的測(cè)定； 室內(nèi)質(zhì)控物的測(cè)定準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià),臨床

20、基因擴(kuò)增檢驗(yàn)IQC統(tǒng)計(jì)計(jì)算問題,可使用質(zhì)控樣本擴(kuò)增后的拷貝數(shù)/ml或IU/ml來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，也可用其對(duì)數(shù)值進(jìn)行。 由于基因擴(kuò)增結(jié)果的原始數(shù)據(jù)通常很大，故使用其對(duì)數(shù)值來進(jìn)行質(zhì)控統(tǒng)計(jì)分析可能要更為方便一些,質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式 質(zhì)控規(guī)則的功能 常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式,通常質(zhì)控規(guī)則以符號(hào)AL來表示，其中A為質(zhì)控測(cè)定中超出質(zhì)量控制限的測(cè)定值的個(gè)數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值13SD來表示。 當(dāng)質(zhì)控測(cè)定值超出控制限L時(shí)，即可將該批測(cè)定判為失控。 常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測(cè)定值中，如果

21、有一個(gè)測(cè)定值超出均值3s范圍，即可將該批測(cè)定判為失控,質(zhì)控規(guī)則的功能,簡(jiǎn)單地說就是用于判斷測(cè)定批的失控還是在控 。 當(dāng)整個(gè)質(zhì)控過程中使用同一個(gè)質(zhì)控物時(shí)，可用來判斷單個(gè)或多個(gè)測(cè)定批內(nèi)該質(zhì)控物的測(cè)定值是否失控； 當(dāng)整個(gè)質(zhì)控過程中使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同的質(zhì)控物時(shí)，可用來判斷同一或多個(gè)測(cè)定批內(nèi)的兩個(gè)或兩個(gè)以上的質(zhì)控物的測(cè)定值是否失控,常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義,符 號(hào) 定 義 12S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出2s控制限。 13S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出3s控制限。 22S 兩個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+2s或2s控制限。 R4S 同一批測(cè)定中，兩個(gè)不同濃度質(zhì)控物的測(cè)定值之間的 差值超出4s控制限。 31S 三個(gè)

22、連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+1s或1s控制限。 41S 四個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+1s或1s控制限。 7X 七個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（）的同一側(cè)。 7T 七個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值呈現(xiàn)一個(gè)向上或向下的趨勢(shì)變化。 8X 八個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（）的同一側(cè)。 9X 九個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（）的同一側(cè)。 10X 十個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（）的同一側(cè),Levey-Jennings質(zhì)控圖方法,也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國(guó)的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。后來（二十世紀(jì)五十年代初），Levey-Jennings將其引入臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量控

23、制 。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖,質(zhì)控圖,質(zhì)控圖,Levey-Jennings質(zhì)控圖基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義,穩(wěn)定條件下，在20個(gè)IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個(gè)結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個(gè)測(cè)定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個(gè)。 如以3s為失控限，假失控的概率為0.3,質(zhì)控圖的記錄的其它方面,IQC數(shù)據(jù)是用來控制實(shí)際過程的，因此其表達(dá)應(yīng)清楚和直接，在質(zhì)控圖上記錄結(jié)果時(shí)，應(yīng)同時(shí)記錄測(cè)定的詳細(xì)情況，如日期、試劑、質(zhì)控物批號(hào)和含量及測(cè)定者姓名等,Levey-Jennings質(zhì)控圖方法的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單明了； 缺

24、點(diǎn)： 以2s為失控限，假失控的概率太高，通常不能接受； 以3s為失控限，假失控的概率低，但誤差檢出能力不強(qiáng),Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法,Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法即是將前述的多個(gè)質(zhì)控規(guī)則同時(shí)應(yīng)用進(jìn)行質(zhì)控判斷的方法。最初常用的有六個(gè)質(zhì)控規(guī)則，即12S、13S、22S、R4S、41S和10X，其中12S規(guī)則作為告警規(guī)則，當(dāng)出現(xiàn)質(zhì)控測(cè)定值違反12S規(guī)則時(shí)，則起動(dòng)其它規(guī)則進(jìn)行判斷。只有當(dāng)使用所有質(zhì)控規(guī)則判斷確定某測(cè)定批在控時(shí)才說明該測(cè)定批在控，只要上述質(zhì)控規(guī)則之一判斷測(cè)定批失控則即認(rèn)為該測(cè)定批失控。通常上述規(guī)則中，13S和R4S規(guī)則反映的是隨機(jī)誤差，而22

25、S、41S和10X反映的是系統(tǒng)誤差，系統(tǒng)誤差超出一定的程度，也可從13S和R4S規(guī)則反映出來,Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法的特點(diǎn),其是在Levey-Jennings質(zhì)控圖方法的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的，自然也就具有Levey-Jennings質(zhì)控圖方法的優(yōu)點(diǎn)，可通過相似的質(zhì)控圖來進(jìn)行分析； 假失控和假告警概率低； 誤差檢出能力增強(qiáng),累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法,累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法于1977年由Westgard等提出,對(duì)系統(tǒng)誤差有較好的測(cè)出能力,常用的累積和 (CUSUM) 質(zhì)控規(guī)則,質(zhì)控規(guī)則 起動(dòng)累積和計(jì)算的閾值（k） 質(zhì)控限（h） 1.0s 2.7s 1.0s 3.0s 0.5s 5

26、.1s,累積和 (CUSUM) 質(zhì)控具體步驟,與上述其它質(zhì)控方法一樣,首先得到測(cè)定均值和標(biāo)準(zhǔn)差(s) ; 確定起動(dòng)累積和計(jì)算的閾值（k）和質(zhì)控限（h）; 確定質(zhì)控規(guī)則; 繪制質(zhì)控圖; 累積和(CUSUM)計(jì)算; 如有失控，則采取措施予以糾正，再開始上述累積和計(jì)算,累積和 (CUSUM) 質(zhì)控圖,即刻法”質(zhì)控方法,即刻法”質(zhì)控方法的實(shí)質(zhì)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,即Crubs異常值取舍法 ； 只要有3個(gè)以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在,即刻法”質(zhì)控方法具體步驟,將連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值按從小到大排列，即x1、x2、x3、x4、x5、x6、xn（x1為最小值，xn為最大值）； 計(jì)算均值()和標(biāo)準(zhǔn)差(s); 按

27、下述公式計(jì)算SI上限和SI下限值； SI上限=（x最大值 均值）/s SI下限=（均值 x最大值 ）/s 將SI上限和SI下限值與SI值表中的數(shù)值比較,質(zhì)控結(jié)果的判斷,SI上限和SI下限值均 n3s對(duì)應(yīng)的值時(shí)，說明該質(zhì)控測(cè)定值的變化已超出3s，屬“失控,室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的評(píng)價(jià),IQC為一集體活動(dòng)，除實(shí)際測(cè)定者外，還應(yīng)有另外一人對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢。 不能將IQC作為一個(gè)監(jiān)察方法，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一次測(cè)定未達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)以建設(shè)性的而非批評(píng)的方式去探查失控的原因。 除了將IQC數(shù)據(jù)作為日常質(zhì)控外，還應(yīng)定期評(píng)價(jià)累積數(shù)據(jù)以監(jiān)測(cè)在測(cè)定操作中的長(zhǎng)期變化趨勢(shì)。 評(píng)價(jià)應(yīng)定期進(jìn)行,弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本常見的失控原因,核酸提取中的

28、隨機(jī)誤差。如核酸提取中的丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。 儀器的問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。 試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等,陰性質(zhì)控樣本的失控原因,主要為擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”和/或臨床標(biāo)本的核酸提取過程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉 “污染,室內(nèi)質(zhì)控的局限性,IQC可確保每次測(cè)定與確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一致，但不能保證在單個(gè)的測(cè)定樣本中不出現(xiàn)誤差。比如樣本鑒別錯(cuò)誤、樣本吸取錯(cuò)誤、結(jié)果記錄錯(cuò)誤等。此類誤差的發(fā)生率在不同的實(shí)驗(yàn)室有所不同，一般要求小于0.1%，且應(yīng)均勻地分布于測(cè)定前、測(cè)定中和測(cè)定后的不同階段,影響臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果的最關(guān)鍵因素,產(chǎn)物“污染”（Carry-over) 測(cè)定人員的操作：標(biāo)本混淆；貼錯(cuò)標(biāo)簽、核酸提取等 試劑,避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果的措施,嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)； 使用帶“濾心”的吸頭； 設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標(biāo)本同時(shí)處理）； 使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑； 臨床“假陽(yáng)性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽(yáng)性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測(cè),避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陰性結(jié)果的措施,避免由于來自于標(biāo)本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標(biāo)本處理中的去垢劑、有機(jī)溶劑的抑制作用的措施：純化核酸；標(biāo)本重復(fù)雙份測(cè)定；稀釋標(biāo)本。 使