親子鑒定與個(gè)體識(shí)別[研究材料]

1、親子鑒定的基本原理和方法,榮 媛 武漢大學(xué)中南醫(yī)院 檢驗(yàn)科&法醫(yī)司法鑒定所,1,特選課堂,親子鑒定發(fā)展概況,不科學(xué),2,特選課堂,親子鑒定與遺傳標(biāo)記,親子鑒定：應(yīng)用生物學(xué)技術(shù)方法來檢測(cè)遺傳標(biāo)記，并依據(jù)遺傳學(xué)理論進(jìn)行分析，從而對(duì)被檢者之間是否存在生物學(xué)親緣關(guān)系所作的科學(xué)判定，實(shí)質(zhì)是一種特殊的個(gè)體識(shí)別,血液細(xì)胞表面的標(biāo)記 血液蛋白質(zhì)的標(biāo)記,蛋白質(zhì)標(biāo)記,DNA標(biāo)記,限制性酶切片段多態(tài)性 DNA長(zhǎng)度多態(tài)性（微衛(wèi)星STR） DNA序列多態(tài)性,3,特選課堂,蛋白標(biāo)記： 紅細(xì)胞ABO,Ph,MN,Kell,Duffy,P等21個(gè)血型系統(tǒng) 白細(xì)胞HLA-A，-B，-C，-D，-DP，-DQ，-DR,DNA標(biāo)記

2、： RFLP，VNTR，STR ，SNP,蛋白標(biāo)記： 血清型 Hp， Gc, Bf, Tf, C2, 酶型 PGM，EsD，ACP，GPT,遺傳標(biāo)記分類,4,特選課堂,蛋白質(zhì)遺傳標(biāo)記（血型檢查,由等位基因決定的紅細(xì)胞表面抗原的差異，為最早用于親子鑒定的遺傳標(biāo)記，有ABO、MN、P、Rh等21個(gè)血型系統(tǒng)。 特點(diǎn)： 遺傳性狀簡(jiǎn)單，符合孟德爾遺傳規(guī)律 遺傳多態(tài)性，不易受年齡、性別、疾病影響 操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，結(jié)果明確,5,特選課堂,ABO血型檢查,人的ABO血型是受A,B,O三個(gè)復(fù)等位基因控制的，O為隱性基因，A、B為顯性基因。 決定ABO血型的基因型AO,AA,BO,BB,OO,AB等6種，表現(xiàn)

3、型有4種：A型、B型、 AB型和O型；根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，即可計(jì)算出孩子的可能血型的概率,6,特選課堂,紅細(xì)胞ABO血型檢查,孩子的血型不是唯一確定的 除了A型血與B型血的人婚配外，其他血型組合都有概率為0的不可能事件,只能否定,7,特選課堂,蛋白質(zhì)遺傳標(biāo)記檢測(cè)的局限性,對(duì)檢材需要量大，且對(duì)時(shí)限要求較高，蛋白質(zhì)容易失活而得不到理想的結(jié)果，不適用于陳舊、微量檢材（HLA分型要求采血后16-24小時(shí)內(nèi)必須檢驗(yàn)） 多態(tài)性信息含量有限，鑒別能力有限，只能用于父權(quán)排除，準(zhǔn)確率較低，不宜用于父權(quán)肯定和同一認(rèn)定 存在有生理或病理性變異（如：A，O型血的人受大腸桿菌感染后B抗原的檢測(cè)可能呈陽性,8,特選課堂,

4、DNA分子遺傳標(biāo)記的檢測(cè),DNA指紋技術(shù)（RFLP）：第一代遺傳標(biāo)記 PCR分型技術(shù)：第二、三代遺傳標(biāo)記的檢測(cè)(微衛(wèi)星STR位點(diǎn)和單核苷酸多態(tài)性SNP,線粒體DNA SNP,核內(nèi)染色體 STR,9,特選課堂,1985 英國(guó) Jefferys Nature 人源小衛(wèi)星 DNA 用作基因探針，同人體核 DNA 的酶切片段雜交，獲得了由多個(gè)位點(diǎn)上的等位基因組成的長(zhǎng)度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋極少有兩個(gè)人完全相同，故稱為 DNA指紋 實(shí)驗(yàn)程序：基因組DNA的提取 限制性內(nèi)切酶消化酶切 電泳分離 印跡轉(zhuǎn)移 探針制備和標(biāo)記 分子雜交和自顯影,DNA指紋技術(shù)（RFLP,10,特選課堂,DNA指紋技術(shù)（RFL

5、P,實(shí)驗(yàn)結(jié)果（DNA指紋圖譜）： 優(yōu)點(diǎn)：群體多態(tài)性高，穩(wěn)定遺傳，孟德爾遺傳 缺點(diǎn)：操作繁瑣、對(duì)檢材的質(zhì)、量要求較高、靈敏度低、沒有種屬特異性,11,特選課堂,PCR分型技術(shù)（現(xiàn)代DNA親子鑒定方法,PCR擴(kuò)增序列多態(tài)性標(biāo)記（PCR-SNP分析,PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（PCR-STR分型,優(yōu)點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異，適用于微量陳舊的生物學(xué)檢材,12,特選課堂,TAGA,TAGA,TAGA,TAGA,TAGA,TAGA,1 2 3 4 5,微衛(wèi)星DNA，簡(jiǎn)短串聯(lián)重復(fù)（STR） 是一種廣泛分布在人類基因組中具有長(zhǎng)度多態(tài)性的DNA序列。由2-6bp的核心序列頭尾相連串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成，通常重復(fù)4-60次

6、不等（串珠結(jié)構(gòu),PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記,13,特選課堂,TTTTA)4 76bp (TTTTA)4 TTTTA 81bp (TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA 91bp (TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 96bp (TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 101bp (TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 106bp (TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 111bp,Apo(a)基因,14,特選課

7、堂,STR的特點(diǎn),多態(tài)性（Polymorphism ）：主要由核心序列拷貝數(shù)目即重復(fù)次數(shù)的變化，產(chǎn)生長(zhǎng)度多態(tài)性 目前國(guó)內(nèi)外最廣泛應(yīng)用的遺傳標(biāo)記 多態(tài)性信息含量大，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99999%，可用于個(gè)體識(shí)別 擴(kuò)增片段較短（100-300bp），易于檢測(cè)，適用的生物檢材類型廣泛 靈敏度高，50pg，對(duì)于檢材要求不高,15,特選課堂,16,特選課堂,DNA條帶、重復(fù)次數(shù)與遺傳的關(guān)系,17,特選課堂,STR等位基因命名,等位基因通過PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度來區(qū)分和命名,18,特選課堂,19,特選課堂,檢材的收集,血液 精液 頰粘膜 病理切片 頭發(fā) 牙齒 骨骼 組織 石蠟包埋組織,20,特選課堂,21,特選課堂

8、,Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,DNA的提取,22,特選課堂,23,特選課堂,多重?zé)晒釶CR,24,特選課堂,PCR product size (bp,Figure 5.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,D3S1358,TH01,D21S11,D18S51,Penta E,D5S818,D13S317,D7S

9、820,D16S539,CSF1PO,AMEL,VWA,D8S1179,TPOX,FGA,PowerPlex 16 kit (Promega Corporation,ILS600 CXR size standard,CXR (Red,FL (Blue,JOE (Green,TMR (Yellow,D3S1358,TH01,D21S11,D18S51,Penta E,AMEL,VWA,D8S1179,TPOX,FGA,PowerPlex 16 kit (Promega Corporation,ILS600 CXR size standard,CXR (Red,FL (Blue,JOE (Gree

10、n,TMR (Yellow,D3S1358,TH01,D21S11,D18S51,Penta E,AMEL,VWA,D8S1179,TPOX,FGA,PowerPlex 16 kit (Promega Corporation,ILS600 CXR size standard,CXR (Red,FL (Blue,JOE (Green,TMR (Yellow,AmpFlSTR Identifiler kit (Applied Biosystems,6-FAM (Blue,VIC (Green,NED (Yellow,PET (Red,D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S

11、1358,TH01,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,D18S51,TPOX,VWA,AMEL,D5S818,FGA,GS500 LIZ size standard,LIZ (Orange,AmpFlSTR Identifiler kit (Applied Biosystems,6-FAM (Blue,VIC (Green,NED (Yellow,PET (Red,AMEL,D5S818,FGA,GS500 LIZ size standard,LIZ (Orange,25,特選課堂,26,特選課堂,Figure 12.3, J.M. Butler (2005) F

12、orensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳和檢測(cè) 在ABI基因分析儀上完成,27,特選課堂,ABI遺傳分析儀家族,28,特選課堂,3130遺傳分析儀的正面結(jié)構(gòu),29,特選課堂,技術(shù)核心（電泳與檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行） 毛細(xì)管電泳技術(shù)：PCR產(chǎn)物片段越長(zhǎng)，遷移越慢，到達(dá)熒光檢測(cè)窗口所需要的時(shí)間越長(zhǎng) 熒光檢測(cè)技術(shù)：CCD（將收集到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)傳輸入電腦,遺傳分析儀的基本原理,30,特選課堂,31,特選課堂,32,特選課堂,步驟1 毛細(xì)管灌膠,每次電泳前毛細(xì)管都會(huì)灌膠，替換已經(jīng)用過的舊膠，不會(huì)污染新的樣品,3

13、3,特選課堂,步驟2 樣品盤移動(dòng),樣品盤X、Y、Z三維移動(dòng) 支持96孔或384孔樣品盤 有專門的盛放緩沖液、水及廢液的4個(gè)槽,34,特選課堂,步驟3 自動(dòng)電進(jìn)樣和電泳,毛細(xì)管和電極進(jìn)入樣品溶液 儀器開始加電壓 荷負(fù)電的DNA分子進(jìn)入毛細(xì)管，并在電場(chǎng)的作用下向陽極泳動(dòng),35,特選課堂,步驟4 熒光激發(fā)及檢測(cè)分析,五色熒光標(biāo)記的DNA片段按大小依次通過激光檢測(cè)區(qū)，小片段在前，大片段在后 激光激發(fā)熒光分子，產(chǎn)生熒光信號(hào) 發(fā)射的熒光信號(hào)被CCD收集 數(shù)據(jù)收集軟件自動(dòng)將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換成電泳圖譜中的有色峰，并通過自動(dòng)分析軟件進(jìn)行分析,36,特選課堂,37,特選課堂,38,特選課堂,結(jié)果分析,39,特選課堂,

14、肯定案例,40,特選課堂,排除案例,41,特選課堂,結(jié)果的判定,每個(gè)位點(diǎn)都符合遺傳規(guī)律，則肯定 大于三個(gè)位點(diǎn)不符合，則排除 小于三個(gè)位點(diǎn)不符合，則考慮是遺傳變異,42,特選課堂,肯定案例,43,特選課堂,排除案例,44,特選課堂,STR分型檢測(cè)的應(yīng)用,已婚夫婦，丈夫懷疑孩子非己所生 私生子 超生子女血緣鑒定 移民案件 懷疑育嬰室調(diào)錯(cuò)嬰兒 拐賣兒童，失散兒童,大型災(zāi)難中受難者身份識(shí)別 無名尸體身份鑒定 移植鑒定 病理切片來源鑒定 刑事案件中犯罪現(xiàn)場(chǎng)生物檢材來源鑒定,親權(quán)鑒定,個(gè)體識(shí)別,45,特選課堂,Y染色體STR在親子鑒定中的應(yīng)用,46,特選課堂,男性所特有的性染色體，它處于半合子的單倍體狀態(tài)

15、，呈父系遺傳，同一父系的所有后代均具有相同的Y染色體特異性基因（除非是發(fā)生了突變,Y染色體STR,47,特選課堂,作為常規(guī)親子鑒定的有力補(bǔ)充，用于父子單親鑒定，叔侄，兄弟，祖孫親緣關(guān)系的鑒定 性侵犯案件發(fā)生48小時(shí)后仍可以檢出，男女混合斑的檢查 個(gè)體識(shí)別：刑偵過程中確定性別，提供線索，縮小偵查范圍 人類遷移的研究：父系進(jìn)化史,Y染色體STR的應(yīng)用,48,特選課堂,Modern Use of Y-STR Testing,Captured December 13, 2003,Is this man really Sadaam Hussein,Butler, J.M. (2005) Forensic

16、 DNA Typing, 2nd Edition, Box 23.1, p. 534,49,特選課堂,DNA序列多態(tài)性標(biāo)記,50,特選課堂,線粒體DNA多態(tài)性在親子鑒定中的應(yīng)用,51,特選課堂,穩(wěn)定的母系遺傳：母系血緣親屬具有完全相同的mtDNA 拷貝數(shù)多：有利于微量檢材；檢測(cè)敏感度高 片段短：抗降解，有利于降解檢材，如角化組織（毛發(fā)等） 突變率高：多態(tài)性高，個(gè)人識(shí)別能力強(qiáng),線粒體DNA特征,52,特選課堂,Heavy (H) strand,Light (L) strand,Figure 10.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,Coding Region,53,特選課堂,線粒體DNA多態(tài)性分析,DNA提取 引物設(shè)計(jì)合成和HVI和HVII的PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物測(cè)序