微生物計數(shù)[基礎(chǔ)教育]

1、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)教材內(nèi)容解讀要點1篩選菌株（1）實驗室中微生物的篩選應(yīng)用的原理人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。（2）選擇性培養(yǎng)基在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。（3）配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質(zhì)以達到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物；加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。要點2統(tǒng)計菌落數(shù)目（1）測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和

2、顯微鏡直接計數(shù)。（2）稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般設(shè)置35個平板，選擇菌落數(shù)在30300的平板進行計數(shù)，并取平均值。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。要點3設(shè)置對照設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。要點4實驗設(shè)計實驗設(shè)計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。（1）土壤取樣從富含有

3、機物、潮濕、pH7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約38cm的土壤層取樣。（2）制備培養(yǎng)基準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。（3）微生物的培養(yǎng)與觀察將土樣以1、101、102依次等比稀釋至107稀釋度，按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期以及平板培養(yǎng)樣品的稀釋度。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌產(chǎn)生。比較牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。（4）細菌的計數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，進行計數(shù)，防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。求出

4、平均值，根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。要點5實驗案例土壤中某樣品細菌的分離與計數(shù)實驗的具體操作步驟如下。1.土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。2.制備培養(yǎng)基準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103107。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個選擇

5、培養(yǎng)基，5個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8個滅菌的試管和1個滅菌的移液管。3.微生物的培養(yǎng)與觀察參考課本中圖2-7的實驗流程示意圖，將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250mL），充分搖勻，吸取上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落

6、接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中圖2-10的顏色反應(yīng)。4.細菌的計數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30300的平板進行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。要點6疑難解答（1）如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進行計算（2）為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的

7、，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。高考資源網(wǎng)土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)1基礎(chǔ)知識11 尿素是一種重要的氮肥，農(nóng)作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通過土壤中的細菌將尿素分解為 氨和CO2，這是因為細菌能合成 脲酶。12 科學(xué)家能從熱泉中把耐熱細菌篩選出來是因為 熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，這樣也適用于實驗室中微生物的篩選，原理是 人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、PH等），同時抑制或

8、阻止其他微生物生長。點評：生物適應(yīng)一定環(huán)境，環(huán)境對生物具有選擇作用。所以通過配制選擇培養(yǎng)基、控制培養(yǎng)條件等選擇目的微生物。思考1在該培養(yǎng)基配方中，為微生物的生長提供碳源的是 葡萄糖，提供氮源的的是 尿素，瓊脂的作用是 凝固劑。思考2該培養(yǎng)基對微生物 具有（具有，不具有）選擇作用。如果具有，其選擇機制是 只有能夠以尿素作為氮源的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長。13在統(tǒng)計菌落數(shù)目時，常用來統(tǒng)計樣品中活菌數(shù)目的方法是 稀釋涂布平板法。除此之外， 顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法?！狙a充】顯微鏡直接計數(shù)是測定微生物的方法。公式：觀察到的紅細胞平均數(shù)觀察到的細菌平均數(shù)紅細胞含量細菌含量14 采用稀

9、釋涂布平板法統(tǒng)計菌落數(shù)目時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于 樣品稀釋液中一個活菌。通過統(tǒng)計 平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在 30300的平板進行計數(shù)。思考3從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)的計算方法是 （平均菌落數(shù)涂布的稀釋液體積）稀釋倍數(shù)。思考4利用稀釋涂布平板法成功統(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵是 恰當(dāng)?shù)南♂尪?。思?第 二位同學(xué)的結(jié)果接近真實值。你認為這兩位同學(xué)的實驗需要改進的操作是第一位同學(xué)需設(shè)置重復(fù)實驗組；第二位同學(xué)統(tǒng)計的三個菌落數(shù)相差太大，說明操作有誤，需重新實驗。15統(tǒng)計的菌落數(shù)比活菌的實際數(shù)目 低。這是因為當(dāng)兩個或多個細胞在一

10、起時，平板上觀察到的只是 一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用 菌落數(shù)來表示。16設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。17對照實驗是指除了 被測試的條件外，其他條件都 相同的實驗。滿足該條件的稱為 對照組，未滿足該條件的稱為 實驗組。思考6請設(shè)計本實驗的對照實驗組：方案1：其他同學(xué)用A同學(xué)的土樣進行實驗。方案2：A同學(xué)以不接種的培養(yǎng)基作為空白對照。2實驗設(shè)計21 實驗設(shè)計的內(nèi)容包括實驗方案、材料用具、實施步驟和時間安排等。22 根據(jù)圖示27填寫以下實驗流程：菌落計數(shù)配制土壤溶液系列稀釋涂布平板與培養(yǎng) 23 土壤微生物主要分布在距地表38cm的近中性土壤中

11、，約7080為細菌。24 分離不同的微生物采用不同的稀釋度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù)的平板。細菌稀釋度為104、105、106，放線菌稀釋度為103、104、105，真菌稀釋度為102、103、104。25 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細菌一般在3037培養(yǎng)12d，放線菌一般在2528培養(yǎng)57d，霉菌一般在2528的溫度下培養(yǎng)34d。26 在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。點評：菌種中有些菌體增殖快，有些菌體增值慢，所以培養(yǎng)時間要充足，使得每個

12、菌體都能形成肉眼可觀察到的菌落。27菌落的特征包括 形狀、大小、隆起程度、顏色等方面。思考8土壤微生物種類最多、數(shù)量最大的原因是什么？土壤中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，環(huán)境條件適宜等。29 實驗過程1）取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。2）應(yīng)在火焰旁稱取土壤 10g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。3）在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行。4）實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。5）為了提高效率，在操作時更加有條不紊，應(yīng)當(dāng)事先規(guī)劃時間。思考9在研究未知微生物時務(wù)必規(guī)范操作，以防被致病微生物感染，實驗后一定要洗手。3結(jié)果分析與評價31對分離的菌種作進一步的鑒定，還需要借助 生物化學(xué)的方法。32在細菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細菌合成的 脲酶將尿素分解成了 氨。氨會使培養(yǎng)基的堿性 增強，PH 升高。因此，我們可以通過檢測培養(yǎng)基 pH