載體構(gòu)建的基本步驟

1、載體構(gòu)建一、原理依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對(duì)目的基因和載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。二、操作步驟1、搖菌（制作感受態(tài)細(xì)胞備用） 取裝有液體培養(yǎng)基的3ml試管兩支（依情況而定），每管加40-100l菌種，過(guò)夜搖。2、提質(zhì)粒（也就是載體） 依照提質(zhì)粒試劑盒中的說(shuō)明書操作（根據(jù)情況最后一步洗脫時(shí)可以多洗1-2次）。3、酶切（雙酶切產(chǎn)生粘性末端）反應(yīng)所需試劑 體積（單位：ul）質(zhì)粒 10所需內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液 2所需限制性內(nèi)切核酸酶 1H2O 7 將加好的EP管置于37保溫1-2h。（依照提酶切的具

2、體步驟操作；為了達(dá)到最佳酶切的效果，最好根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應(yīng)溫度）4、電泳檢測(cè)將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)酶切是否成功?；厥漳z：瓊脂糖與緩沖液一比一制膠，經(jīng)過(guò)切膠回收目的產(chǎn)物，也有目的產(chǎn)物純化的功能；檢測(cè)膠：瓊脂糖與緩沖液一比二制膠，為了檢測(cè)目的條帶與預(yù)期是否相符。切膠回收與產(chǎn)物純化是差不多的過(guò)程，所達(dá)到的目的是一樣的：切膠回收也是一種純化過(guò)程，它能去除非目的片段，然后用回收試劑盒進(jìn)行純化，能將很不純的DNA溶液純化；產(chǎn)物純化是將較純的DNA溶液進(jìn)一步除去多余的雜質(zhì)，用純化試劑盒，你會(huì)發(fā)現(xiàn)純化試劑盒和回收試劑盒的步驟幾乎一樣。5、載體與目的基因連接如果電泳檢測(cè)酶切成功的話，則仔

3、細(xì)將所需的片段切割下來(lái)，將膠體回收（依照膠回收試劑盒說(shuō)明書操作）；之后將回收的片段和載體連接。置于溫箱，12-16，保溫8-16h6、轉(zhuǎn)化（連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中）依照轉(zhuǎn)化具體操作步驟做感受態(tài)，將上述連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，涂板培養(yǎng)，37，12-16h。7、單克隆檢測(cè)（1）挑單克隆先將AMP從冰箱中取出，待融化后，在3ml裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中加入3L的AMP，用槍頭混勻；取1.5 mlEP管5支（依情況可以多挑幾管），給每支管中加500L上述培養(yǎng)液，然后用接種環(huán)（或黃槍頭）挑單克隆，挑完后用槍吹打；之后，將挑好的菌搖4-5小時(shí)，至混濁即可。（2）單克隆檢測(cè)以每管搖好的菌液為模板，以原有

4、的引物進(jìn)行PCR，然后將PCR產(chǎn)物跑電泳，觀察電泳圖像中那幾管的條帶正確，將正確條帶相對(duì)應(yīng)管的菌液再抽取100L，加到3ml（有LB液體培養(yǎng)液，AMP+）試管中，過(guò)夜搖；第二天重?fù)u，將搖好的菌取1ml于1.5mlEP管中送測(cè)序，并保種。 注：挑單克隆時(shí)，一定要挑單一圓潤(rùn)的菌落，有衛(wèi)星斑的不挑。 別忘記往培養(yǎng)基中加AMP。 用接種環(huán)挑菌后，要在酒精燈上反復(fù)灼燒，然后再進(jìn)行下一次挑菌。三、注意事項(xiàng)1 連接產(chǎn)物可短時(shí)間在-20保存，使用時(shí)可以取出進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；2 在細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，冰浴和熱激要嚴(yán)格控制好時(shí)間；3 連接反應(yīng)是DNA重組過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，其成敗的重要參數(shù)之一就是溫度，因此要控制好連接溫度。4進(jìn)行黏末端連接時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一定數(shù)量的載體自身環(huán)化分子