細(xì)胞自噬與腫瘤

1、細(xì)胞自噬與腫瘤,一、自噬簡(jiǎn)介二、自噬研究方法三、自噬與腫瘤的關(guān)系,目錄,一、自噬簡(jiǎn)介,1.1 自噬過程 (1) 在饑餓、氧化應(yīng)激損傷等情況下，自噬體膜脫落形成杯狀分隔膜，包繞在被降解物周圍； (2) 分隔膜逐漸延伸，將要被降解的胞漿成分完全包繞形成雙層膜自噬體； (3) 自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成分，自噬體膜脫落再循環(huán)利用。,自噬過程,2.1 自噬的功能： （1）對(duì)外源性刺激的適應(yīng)性反應(yīng)； （2）細(xì)胞保持穩(wěn)定狀態(tài)的管家機(jī)制； （3）參與一定的組織特異性融合； （4）作為一種細(xì)胞死亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)性死亡。,自噬發(fā)生過程的分子機(jī)制,自噬的研究方法,目前普遍采用的自噬檢測(cè)方法包括

2、電鏡、免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡等方法檢測(cè)自噬體及其標(biāo)志蛋白。 準(zhǔn)確評(píng)估自噬不僅包括自噬體的檢測(cè)，還包括動(dòng)態(tài)觀察整個(gè)自噬性降解的過程是否順暢(即自噬潮分析)。 另外，通過藥物或基因干預(yù)技術(shù)來人為地調(diào)控自噬以觀察其在體內(nèi)體外模型中的作用也是自噬分析的重要內(nèi)容。 任何一種方法單獨(dú)應(yīng)用均不能作為自噬的依據(jù)，不能將自噬體的增多減少或自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的高低等同于自噬的增強(qiáng)或減弱1。,1、自噬性結(jié)構(gòu)的電鏡下形態(tài)學(xué)觀察 透射電子顯微鏡是觀察自噬現(xiàn)象的最直接、最經(jīng)典的方法。電鏡檢測(cè)自噬主要是基于辨認(rèn)自噬體結(jié)構(gòu)。 電鏡觀察僅能證明自噬性結(jié)構(gòu)的存在，難以反映自噬活性的強(qiáng)弱。Swanlund 等2介紹了一種免疫金電鏡技術(shù)

3、來對(duì)電鏡結(jié)果進(jìn)行定量分析。通過圖像分析軟件自動(dòng)測(cè)量所有自噬囊泡的面積(m2)，如果一個(gè)細(xì)胞胞漿中被自噬性囊泡所占據(jù)的總面積增加，則可說明自噬機(jī)制的上調(diào)。,2、基于自噬體標(biāo)記蛋白LC3 的檢測(cè)方法 自噬過程由一系列自噬相關(guān)蛋白(Atg 蛋白)介導(dǎo)完成，這些蛋白質(zhì)在自噬體形成的不同階段發(fā)揮作用.。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3 蛋白：LC3-和LC3-。當(dāng)自噬體形成后，LC3-和磷脂酰乙醇胺(PE)偶聯(lián)形成LC3-并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。LC3-始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記。,2.1、 細(xì)胞免疫熒光 LC3-在胞漿內(nèi)彌散分布，LC3-聚集于自噬體膜上，通過免

4、疫熒光的方法檢測(cè)內(nèi)源性LC3或轉(zhuǎn)染GFP-LC3 融合蛋白的表達(dá)，自噬誘導(dǎo)后的細(xì)胞表現(xiàn)為點(diǎn)狀聚集增多。理論上，觀察到的點(diǎn)狀聚集的數(shù)目即為自噬體的數(shù)量，根據(jù)點(diǎn)狀聚集的密集程度可以判斷細(xì)胞自噬的情況。 但是這種方法僅從總體上大致反映自噬的增加或減少，定量分析則存在局限性。,GFP-LC3 單熒光自噬指示體系：,綠色斑點(diǎn)增多也并不一定代表自噬活性增強(qiáng)，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻，可以通過western blot 檢測(cè)游離的GFP、p62來驗(yàn)證。,2.2 、LC3 蛋白轉(zhuǎn)化 實(shí)驗(yàn) 自噬發(fā)生后，通過Western-blot 可以檢測(cè)到兩個(gè)條帶的蛋白質(zhì)。由于在自噬時(shí)細(xì)胞內(nèi)LC3 蛋白總的表達(dá)水平其實(shí)

5、并無上調(diào)，僅僅是一部分LC3 -轉(zhuǎn)變成了LC3 -，那么理論上自噬時(shí)應(yīng)表現(xiàn)為L(zhǎng)C3 -的減少和LC3 -的增加，通過LC3 -/LC3 -或者LC3 -/(LC3 -+LC3 -)即可反映自噬水平。,但是由于二者對(duì)抗體結(jié)合能力的差異導(dǎo)致檢測(cè)敏感性的不同(LC3-檢測(cè)敏感性高于LC3-)，實(shí)際檢測(cè)結(jié)果LC3-的減少并不與LC3-的增加同步，因此單純比較LC3-蛋白的水平可能更好。,3、 基于自噬性降解的檢測(cè) “自噬潮” 分析自噬過程是動(dòng)態(tài)變化的，想要說明細(xì)胞自噬活性的強(qiáng)弱，必須通觀整個(gè)自噬的過程是否順利，即通過基于自噬性降解的自噬潮分析來進(jìn)一步說明自噬活性。 自噬潮涵蓋了自噬體的形成、自噬性底物

6、向溶酶體的運(yùn)送以及在溶酶體內(nèi)降解的整個(gè)過程。顯然，對(duì)這整個(gè)過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)比單純自噬體檢測(cè)更能反映自噬活性，因此“自噬潮”分析是反映自噬活性的可靠指標(biāo)。,3.1、長(zhǎng)壽命蛋白降解 根據(jù)自噬機(jī)制主要負(fù)責(zé)降解長(zhǎng)壽命蛋白的特性，先讓細(xì)胞在含有同位素標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間，細(xì)胞在此期間合成的蛋白質(zhì)都將被同位素標(biāo)記，然后換成不含同位素的培養(yǎng)基，讓一些被標(biāo)記的短壽命蛋白通過蛋白酶體途徑降解。 在自噬誘導(dǎo)后，通過檢測(cè)培養(yǎng)基上清中釋放的自噬性降解產(chǎn)物的放射性活度即可反映細(xì)胞自噬性降解的能力。,3.2、LC3 和其他自噬性底物的降解 自噬過程中，自噬體內(nèi)膜上的LC3-被溶酶體降解，通過免疫印跡監(jiān)測(cè)自噬過程中

7、LC3 蛋白量的變化或流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)GFP-LC3 熒光強(qiáng)度的變化即可反映自噬活性。在自噬誘導(dǎo)一開始，GFP-LC3 點(diǎn)狀聚集顯著增多，隨后信號(hào)可能會(huì)出現(xiàn)下降，代表著自噬性降解的發(fā)生。,3.3、mRFP-GFP-LC3 的溶酶體呈遞,mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系：,3.4、GFP-LC3 切割 LC3 連同自噬體內(nèi)膜和內(nèi)容物一起被溶酶體降解，但GFP 在溶酶體中僅表現(xiàn)熒光信號(hào)猝滅，GFP 本身并不被降解，在自噬性溶酶體降解后會(huì)釋放出游離的GFP。 通過免疫印跡的方法檢測(cè)游離GFP 蛋白的出現(xiàn)即意味著自噬性降解的發(fā)生。,4 、自噬的實(shí)驗(yàn)性調(diào)控 通過人為的干預(yù)來激活或者抑制自噬功能

8、后觀察細(xì)胞行為或效應(yīng)分子的變化能夠使研究結(jié)論更具有說服力。目前，實(shí)驗(yàn)性激活或者抑制自噬的方法有藥物處理、自噬基因敲除、沉默或過表達(dá)。 常用的自噬激活劑：雷他霉素、營(yíng)養(yǎng)缺乏、Lithum 常用的自噬抑制劑：3-MA、氯化銨、Bafilomycin A1,自噬與腫瘤的關(guān)系,自噬在腫瘤治療中有雙重作用：作為腫瘤抑制機(jī)制，自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡、 限制細(xì)胞數(shù)量，或者減少 DNA 的突變概率，以防止腫瘤形成；作為腫瘤保護(hù)機(jī)制，自噬可以保護(hù)癌細(xì)胞免受化療藥物的作用并延緩腫瘤細(xì)胞凋亡3。 自噬可以抑制腫瘤，例如葡萄籽原花青素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡4，硅膠納米顆粒通過活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及自噬性死亡5。另外，有研

9、究顯示，在多種應(yīng)激狀況下，自噬可以提高細(xì)胞存活6。例如，腫瘤進(jìn)展造成局部缺氧和營(yíng)養(yǎng)匱乏， 此時(shí)自噬水平升高以增加腫瘤細(xì)胞存活7。,參考文獻(xiàn),1馬泰, 孫國(guó)平, 李家斌. 細(xì)胞自噬的研究方法J. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2012, 39(3): 204-209. 2Chen N, Karantza-Wadsworth V. Role and regulation of autophagy in cancerJ. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 2009, 1793(9): 1516-1523. 3 石文沽

10、, 劉凱, 陳德喜, 等. 自噬與肝癌J. 北京醫(yī)學(xué), 2011, 33(12). 4王威, 陳景紅, 王新寧, 等. 葡萄籽原花青素誘導(dǎo)人肝癌 HepG2 細(xì)胞凋亡及自噬性死亡J. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版), 2011, 32(2). 5 Sharma V, Anderson D, Dhawan A. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria mediated apoptosis in human liver cells (HepG2)J. Apoptosis, 2012, 17(8): 852-870. 6 Kroemer G, Mario G, Levine B. Autophagy and the integrated stress responseJ. Molecular cell, 2010, 40(2): 280-293. 7 Degenhar