高效液相色譜六種定量方法原理及使用條件

1、高效液相色譜六種定量方法原理及使用條件,六種定量方法,1、峰面積百分比法 2、峰面積歸一法 3、外標(biāo)法 4、雜質(zhì)檢查法 5、內(nèi)標(biāo)法,加校正因子的主成分自身對照法,不加校正因子的主成分自身對照法,峰面積百分比法,按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。 某化合物百分含量（%）= 簡單的說就是配制溶液，進(jìn)樣，按峰面積百分比法讀取含量。一般系統(tǒng)適應(yīng)性主要考察分離度。（如：雙乙酰阿昔洛韋。D-NAP方法，P4）,峰面積,峰面積,100%,優(yōu)點： 快速、簡單、無需考察系統(tǒng)重復(fù)性（進(jìn)樣量不嚴(yán)格）無

2、需對照品 缺點： 測定誤差大，本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。,峰面積百分比法,峰面積歸一法,在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液（一般為100%限度加樣溶液），進(jìn)樣，記錄色譜圖，按 式中：Ci加樣溶液中加入的雜質(zhì)百分含量； Ai1回收異丙醇中雜質(zhì)的平均峰面積； Ai2加樣溶液中雜質(zhì)的峰面積； Cs加樣溶液中主成份的百分含量； As加樣溶液中主成份的峰面積。 計算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質(zhì)，通常定位或

3、以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。,峰面積歸一法,按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積，加入校正因子計算各組分面積及總峰面積。計算各組分折算后峰面積占總峰面積的百分比。 公式如下： 某化合物百分含量（%）= 比面積百分比法多了一步校正因子計算。如雙乙酰阿昔洛韋。 若雜質(zhì)含量較少，乘校正因子對總面積影響較小，可按結(jié)果校正因子報告。 若雜質(zhì)含量較大或個數(shù)較多，乘校正因子對總面積影響較大，需按峰面積乘校正因子重新計算總峰面積后再計算。（如：vcv 有關(guān)物質(zhì)2等）,峰面積響應(yīng)因子,峰面積響應(yīng)因子,100%,優(yōu)點： 快速、簡單、無

4、需考察系統(tǒng)重復(fù)性（進(jìn)樣量不嚴(yán)格）驗證時需對照品，之后無需對照品。 缺點： 同峰面積百分比法。誤差較大， 但比百分比法準(zhǔn)確。,峰面積歸一化法,外標(biāo)法,建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量： 含量（% ）=（CR/CX）(AX/AR)*100 式中CR對照溶液中待測組分濃度； CX供試品溶液中待測組分濃度； AX 供試品溶液中待測組分濃度； AR 對照溶液待測組分峰面積。 系統(tǒng)適應(yīng)性中需考察重復(fù)性。 基本原理：濃度和峰響應(yīng)成線性。（如各產(chǎn)品項下含量方法

5、，CPG BSA雜質(zhì)A、基因毒性雜質(zhì)等）,外標(biāo)法,優(yōu)點： 外標(biāo)法方法相對內(nèi)標(biāo)法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量準(zhǔn)確。對照品好找，用待測組分的純品作為對照品。 不足： 1、進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確。此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以定量環(huán)或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。 2、儀器及人員精密度要求較高。需控制實驗條件穩(wěn)定性。 3、定期校正。 4、只能每個待測組分均需進(jìn)其對照溶液。 但此外，為了降低外標(biāo)一點法的實驗誤差，應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。,雜質(zhì)檢查法,1、

6、加校正因子的主成分自身對照法 已知且有對照品雜質(zhì) 2、不加校正因子的主成分自身對照法 未知或無對照品雜質(zhì) 已知雜質(zhì)且有對照品的我們現(xiàn)在都加校正因子，未知雜質(zhì)按1.0計。 除另有規(guī)定外，校正因子大于等于1.0時，保留至小數(shù)點后1位，反之，保留至小數(shù)點后兩位；結(jié)果為0.801.2之間，通常按1.0計，反之，雜質(zhì)濃度計算時，應(yīng)乘以測試得到的校正因子。,加校正因子的主成分自身對照法,在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，或根據(jù)線性檢測結(jié)果計算。 f= 或f= 計算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用

7、于校正雜質(zhì)的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。,A雜/C雜,A樣/C樣,K樣,K雜,加校正因子的主成分自身對照法,需系統(tǒng)適應(yīng)性考察： 1、靈敏度考察：定量限最低要求在雜質(zhì)一半限度以下。（可調(diào)節(jié)進(jìn) 樣濃度或進(jìn)樣量） 2、系統(tǒng)適應(yīng)性考察：通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn) 偏差（RSD）應(yīng)小于10%；含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的 RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD 應(yīng)小于2% 3、供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，一般為主成分色譜峰保留時間的2倍。 方法確定后不調(diào)節(jié)。,加校正因子的主成分自身對

8、照法,測定雜質(zhì)含量時，進(jìn)樣自身對照溶液（自身對照溶液：供試品溶液稀釋至主成分濃度一般為雜質(zhì)限度濃度） 測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質(zhì)含量。 公式為： 雜質(zhì)含量（%）= 式中：AIM 待測雜質(zhì)峰面積； C對 自身對照溶液中供試品濃度； A對 待測雜質(zhì)峰面積； C供試品 供試品濃度； f 校正因子。,Aim*C對,A對*C供試品,*f*100,不加校正因子的主成分自身對照法,測定雜質(zhì)含量時，若沒有雜質(zhì)對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。 基本除校正因子步驟外，其余同加校正因子自身對照法,雜質(zhì)檢查法,優(yōu)點： 相對

9、較準(zhǔn)確。首次驗證時用相應(yīng)對照品確定校正因子后，樣品檢測時只要用供試品作為對照品。只需定位溶液或RRT定位。節(jié)省雜質(zhì)對照品有關(guān)物質(zhì)檢測溶液配制簡單。 缺點 同外標(biāo)法，需較高的儀器人員環(huán)境穩(wěn)定性。 若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品的色譜圖1，再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖2.色譜圖1上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖2上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計算。 即扣除空白溶劑法。,雜質(zhì)檢查法,與外標(biāo)法區(qū)別 外標(biāo)法：對照和待測組分為同一物質(zhì)，只能校正進(jìn)了對照溶液的組 分。（主成分對應(yīng)主成分對照，雜質(zhì)對應(yīng)雜質(zhì)對照） 自身對照法：對照一般為待測供試品。（所有

10、待測組分均對應(yīng)主成分 對照） 如：阿昔洛韋USP有關(guān)物質(zhì)中鳥嘌呤為外標(biāo)法。其他雜質(zhì)為自身對照法。,內(nèi)標(biāo)法,1、原理 按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子f： f= 式中：As 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；Ar 為對照品的峰面積或峰高； Cs 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度； Cr 為對照品的濃度。 f 即內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與待測樣品響應(yīng)比值。 需考察儀器響應(yīng)重復(fù)性。即校正因子重復(fù)性。,As/Cs,Ar/Cr,內(nèi)標(biāo)法,再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注

11、入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量CX： Cx=f* = * 式中：Ax 為供試品峰面積或峰高； Cx 為供試品的濃度； As 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；Cs 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度； f為校正因子。,Ax,As/Cs,As/Cs,Ar/Cr,Ax,As/Cs,內(nèi)標(biāo)法,1、優(yōu)點： 、在進(jìn)樣量不超限(色譜柱不超載)的范圍內(nèi)， 采用內(nèi)標(biāo)法（因為采用同一針比值來計算），定量結(jié)果與進(jìn)樣量的重復(fù)性無關(guān)。 、只要被測組分及內(nèi)標(biāo)物出峰，且分離度合乎要求，就可定量，與其他組分是否出峰無關(guān)。 、很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量。由于雜質(zhì)(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊，無法用歸一化法測定含量，用內(nèi)標(biāo)法則很方便。加一個與雜質(zhì)量相當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物。加大進(jìn)樣量突出雜質(zhì)峰，測定雜質(zhì)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，即可求出雜質(zhì)含量。 第1條主要針對外標(biāo)法。 2,3兩條主要針對面積歸一化法。因組分濃度太小時不能檢出，組分濃度太高時不能呈線性。,內(nèi)標(biāo)法,2、不足： 因內(nèi)標(biāo)物選擇需符合以下要求: （1）內(nèi)標(biāo)物是原樣品中不含有的組分，否則會使峰重疊而無法準(zhǔn)確測量內(nèi)標(biāo)物的峰面積； （2）化學(xué)性質(zhì)與樣品相似 （3）內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。 （4）與樣品有相似響應(yīng)值 （5）不會與樣品發(fā)生反應(yīng)