臨床PCR檢驗的室內(nèi)質(zhì)控方法

1、臨床PCR檢驗的室內(nèi)質(zhì)控方法,存在的問題,概念不清 不知道具體怎么做 不會寫室內(nèi)質(zhì)控的SOP 不知道如何選擇室內(nèi)質(zhì)控物 不會分析室內(nèi)質(zhì)控的結(jié)果,室內(nèi)質(zhì)控SOP存在的問題,責任人不清。 質(zhì)控物的來源及濃度不清或不全，并且通常沒有說明陰性質(zhì)控物的來源。有些是自制，但制備方法不規(guī)范，沒有任何的質(zhì)量檢驗，定量結(jié)果沒有溯源性。 沒有明確所選用的質(zhì)控方法。對前20次的測定的室內(nèi)質(zhì)控沒有解決方法。 沒有明確的失控判斷標準，只是做了一些失控的含糊敘述。并且一般都沒有陰性失控的判斷方法。 沒有失控后的分析及處理措施。,室內(nèi)質(zhì)量控制（Internal Quality Control,IQC)的概念,由實驗室工作人

2、員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作。 可概括為:(1)執(zhí)行者：實驗室技術(shù)人員；(2)目的：監(jiān)測實驗室測定的重復性；(3)功能：決定了當批測定的有效性，報告可否發(fā)出。是對實驗室測定的即時性評價。,室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）的基本內(nèi)容,主要包括三個方面： （1）測定前的質(zhì)量控制； （2）統(tǒng)計學質(zhì)量控制； （3）質(zhì)量控制的評價。,測定前的質(zhì)量控制,實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理 理想的試劑和操作方法 人員培訓,實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理,實驗室空間及工作流

3、程的設(shè)計 實驗室環(huán)境條件的控制：溫濕度控制設(shè)備、穩(wěn)壓或不間斷電源,理想的PCR實驗室設(shè)計A,理想的PCR實驗室設(shè)計B,臨床PCR實驗室設(shè)計的一般原則,各區(qū)獨立 注意風向 因地制宜 方便工作,“十六字口訣”,傳遞窗,傳遞窗,傳遞窗,臨床PCR實驗室質(zhì)量管理的特點,“無基因”概念 實驗室要有嚴格的人員進入限制和程序 使用合格的試劑和消耗品,PCR實驗室“污染”的主要來源,臨床標本中存在的大量待測微生物 科研中得到的質(zhì)?？寺?以前分析研究的特定微生物 大量存在于實驗環(huán)境中的特定微生物 以前擴增產(chǎn)物的殘留污染。這也是PCR實驗室最容易產(chǎn)生的將造成假陽性的“污染”。,PCR實驗室的重要防“污染”措施,實

4、驗室的嚴格分區(qū)及工作程序的嚴格遵守 化學方法：實驗臺面可使用10的次氯酸鈉（漂白劑）清洗 ；有些物品比如放置擴增反應(yīng)管的盤必須從污染區(qū)轉(zhuǎn)回到清潔區(qū)時，在轉(zhuǎn)回之前，應(yīng)將其置于210的次氯酸鈉溶液中過夜，并充分沖洗。 紫外照射：實驗臺面、儀器設(shè)備、實驗室空間 UNG,儀器設(shè)備及管理,PCR儀、離心機、加樣器、恒溫設(shè)備等應(yīng)建立技術(shù)檔案，并定期維護;PCR儀、加樣器、恒溫設(shè)備應(yīng)定期進行校準,理想的試劑:試劑的質(zhì)檢,核酸提取或標本處理方法的抗干擾能力（能否 有效地去掉PCR抑制物） 測定下限(Detection limit)（定性測定） 測定準確性和線性范圍 批內(nèi)變異和批間變異 試劑批間的一致性 有否污

5、染 其他：外包裝、試劑的完整性、有效期、說明書等,理想的操作方法,按照試劑盒說明書操作即可嗎? 操作中影響測定結(jié)果的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 寫出具有可操作性的SOP,人員培訓,培訓所涉及的范圍:儀器設(shè)備使用、維護和校準；試劑、方法原理；質(zhì)量管理體系；相關(guān)法律法規(guī)、相關(guān)領(lǐng)域的新技術(shù)、新理念和新進展；實驗操作技能等。 如何培訓：講座、討論、自學和參加培訓班等。 培訓的評估：書面考試、實驗考核、討論心得、論文、綜述等。,統(tǒng)計質(zhì)控方法,質(zhì)控物濃度的選擇 每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置 質(zhì)控規(guī)則 Levey-Jennings質(zhì)控圖方法 “即刻法”質(zhì)控方法 “假陽性”的統(tǒng)計質(zhì)控方法,質(zhì)控物濃度的選擇,定量測定：測定線

6、性范圍內(nèi)的高、中、低三種濃度 定性測定：接近方法測定下限的濃度 陰性質(zhì)控物,每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置,標本數(shù)量如小于30，弱陽性和陰性質(zhì)控各1份，標本數(shù)量增加，質(zhì)控物數(shù)量相應(yīng)按比例增加 均勻分散于臨床標本中，與臨床標本一同處理（核酸提取） 擴增時的排列順序，可排于標準品或校準品之后，臨床樣本之前。但在擴增儀中的位置，不應(yīng)永久性的固定的在一個孔，而應(yīng)在每次擴增檢測時，進行相應(yīng)的順延，以使在一定的時間內(nèi)，可以盡可能的監(jiān)測每一個孔的擴增有效性。,陰性質(zhì)控樣本的種類,陰性原血清樣本 實驗過程中帶入的空管 僅含擴增反應(yīng)混合液的管,陰性原血清樣本的功能,監(jiān)測實驗室的以前擴增產(chǎn)物的“污染” 由實驗操

7、作所致的標本間的交叉污染。具體地說，如強陽性標本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染、強陽性標本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用翻蓋離心管核酸提取時在較高溫孵育時蓋子崩開等 擴增反應(yīng)試劑的污染。,核酸提取過程中帶入的空管,監(jiān)測核酸提取過程中的實驗室“污染”的存在（在整個實驗過程中，開口放置于核酸提取的操作臺面區(qū)域內(nèi)，最后以水為基質(zhì)，進行擴增 ）,僅含擴增反應(yīng)混合液的管,監(jiān)測試劑的“污染”,質(zhì)控規(guī)則的表達方式及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達方式 質(zhì)控規(guī)則的功能 常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達方式,通常質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質(zhì)控測定中超出質(zhì)量控制限的測定值的個數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值13SD來

8、表示。 當質(zhì)控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。 常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測定值中，如果有一個測定值超出均值3s范圍，即可將該批測定判為失控。,質(zhì)控規(guī)則的功能,簡單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控。,常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義,符 號 定 義 12S 一個質(zhì)控測定值超出2s控制限。 13S 一個質(zhì)控測定值超出3s控制限。 22S 兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或2s控制限。 R4S 同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的 差值超出4s控制限。 41S 四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或1s控制限

9、。 7T 七個連續(xù)的質(zhì)控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變 化。 10X 十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（）的同一側(cè)。,Levey-Jennings質(zhì)控圖方法,也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。 二十世紀五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質(zhì)量控制 。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。,質(zhì)控圖,Levey-Jennings質(zhì)控圖基本的統(tǒng)計學含義,穩(wěn)定條件下，在20個IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結(jié)果中

10、超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個。 如以3s為失控限，假失控的概率為0.3%。,“即刻法”質(zhì)控方法,“即刻法”質(zhì)控方法的實質(zhì)是一種統(tǒng)計學方法，即Grubs異常值取舍法 ； 只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。,“假陽性”的統(tǒng)計學室內(nèi)質(zhì)控方法,基于日常檢驗的陽性率比值(呈正態(tài)分布) 直接概率計算方法（不呈正態(tài)分布）,基于日常檢驗的陽性率比值,半Levey-Jennings質(zhì)控圖法,質(zhì)控規(guī)則,當陰性質(zhì)控樣本為陽性時,不管陽性率測定比值為何，均為失控，所有陽性標本須重新測定，并增加一倍陰性質(zhì)控樣本。 如果陰性質(zhì)控樣本為陰性，某次測定陽性比值超出+3SD,則為失控,為1+3S

11、規(guī)則。本次結(jié)果陰性結(jié)果根據(jù)陽性質(zhì)控樣本的情況,決定是否可以發(fā)出,所有陽性樣本結(jié)果不能發(fā)出，需查找出現(xiàn)陽性率增高的原因，并在增加一倍陰性質(zhì)控樣本的情況下重新檢測。,可能的幾種失控表現(xiàn),曲線向上漂移：提示出現(xiàn)污染，污染可能是由于某一天操作上的失誤導致實驗室被污染如標本泄漏，產(chǎn)物泄漏，試劑被污染等 向上的趨勢性變化：可能存在累積性的產(chǎn)物污染，實驗室擴增產(chǎn)物逐漸累積，從而使病人結(jié)果的陽性率逐漸增高。此時實驗室需要進行徹底清潔。,直接概率計算法,按統(tǒng)計學規(guī)律，一個事件發(fā)生的概率小于5%被稱為小概率事件，即發(fā)生的可能性很小。 當一個小概率事件發(fā)生時，則可能有誤差存在，有必要對其發(fā)生的原因進行分析。 對每天

12、的日常病人結(jié)果中陽性率出現(xiàn)的概率進行計算，如果這種結(jié)果出現(xiàn)的概率小于5%時，則可判為失控。,根據(jù)二項式分布的概率計算,在一個實驗室中某檢測項目結(jié)果的陽性率為p,計算在n個血液樣本中有k個陽性結(jié)果的概率。根據(jù)二項式分布的概率計算公式如下： P(X=k)=n!/k!(n-k)!pk(1-p)n-k (1) 其中n為當次實驗檢測標本數(shù)，k為陽性個數(shù)，p為陽性率。 P(X=k)5%為失控。此時，陰性標本可以發(fā)出報告，所有陽性標本在查清原因后重做。,根據(jù)二項式分布的概率計算,如果一個實驗室檢測HBV DNA，平常病人結(jié)果的陽性率為10%，即p=0.1, 在某一次檢測25個樣本出現(xiàn)6個陽性結(jié)果，19個陰性

13、結(jié)果，則檢測過程中是存在污染的可能性可通過下述方法計算。即計算在25個樣本中出現(xiàn)6個或6個以上陽性結(jié)果的概率，此時的概率為1-（獲得0個或1個或2個或3個或4個或多5個陽性結(jié)果的概率）即： 1-P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=1-(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15=0.0334 則在這個實驗室一次檢測25個標本獲得6個或6個以上陽性結(jié)果的概率為3.34%，小于5%，屬于小概率事件，即發(fā)生的可能性很小，可能有污染所致假陽

14、性結(jié)果的可能。,根據(jù)泊松分布的概率計算,在血液篩查檢測中，許多實驗室或檢測項目如HCV RNA 、CT、結(jié)核桿菌、淋球菌的陽性結(jié)果率均較低，這時雖然可以使用公式（1）計算概率，但如果標本量很大，使用泊松分布來估計二項式分布是一種更為簡便的方法。根據(jù)泊松分布，可使用下式計算概率： P(X=k) =(np)ke-np/k! (2) P(X=k)5%為失控。此時，陰性標本可以發(fā)出報告，所有陽性標本在查清原因后重做。,根據(jù)泊松分布的概率計算,一個實驗室中，某項目每次檢測結(jié)果的陽性率約為2%，則在100個樣本中出現(xiàn)8個陽性結(jié)果的概率。 根據(jù)泊松分布，可使用公式（2）計算概率，此時n=100,p=0.02

15、,k=8, np=2代入公式（2）計算得 P(X=10) =28e-2/8!=0.0009。,標本間交叉污染的概率計算,如果所有陽性結(jié)果的出現(xiàn)是連續(xù)性的，則可能存在標本間的交叉污染，即陽性樣本污染了它鄰近的陰性樣本，這種情況的概率計算公式如下： P=(n-r+1)/n!/r!(n-r)! （3） 其中n為當次實驗檢測標本數(shù)，r為連續(xù)出現(xiàn)陽性的個數(shù)。 當某次實際測定標本連續(xù)陽性的概率大于所計算的概率，則判為失控。陰性標本結(jié)果可以發(fā)出，陽性標本要考慮標本間交叉污染的問題。,標本間交叉污染的概率計算,如在一次檢測100個標本的HBV DNA檢測中，所有兩個陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為： P=(100-2

16、+1)/100!/2!(100-2)!=99/4950=0.02 概率為2.0%。 因此，如在100個標本中，連續(xù)出現(xiàn)兩個為陽性次數(shù)有3次，即概率為3.0%，則為失控。 而在一次檢測100個標本，所有三個陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為： P=(100-3+1)/100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006 概率為0.06%。 因此，如果如在100個標本中，連續(xù)出現(xiàn)三個為陽性次數(shù)有1次，即概率為1.0%，為失控。,室內(nèi)質(zhì)量控制的評價,IQC是一個集體活動，不光是對實驗室一次測定的有效性的判斷，也反應(yīng)了實驗室測定趨勢的變化。 IQC的失控不能做為處罰的依據(jù)，應(yīng)建設(shè)性的找出失控的原因，針對其采取措施加以改進。 對IQC應(yīng)定期進行評價。,陽性質(zhì)控樣本失控的常見原因,核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留、所用耗材如離心管有PCR抑制物等。 儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。 試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率等。,避免假陰性的措施,純化核酸 標本重復雙份測定 稀釋標本 使用“內(nèi)質(zhì)控”（Internal Control,IC),陰性質(zhì)控樣本的常見失控原因,擴增產(chǎn)物的“污染” 臨床標本的核酸提取過程中發(fā)生的標本間的交叉 “污染”,