分枝桿菌分離培養(yǎng)作業(yè)指導(dǎo)書

1、 會理縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 作業(yè)指導(dǎo)書文件編號： jh02 分枝桿菌分離培養(yǎng)作業(yè)指導(dǎo)書第 1 頁 共 4頁第 1 版 第0次修訂頒布日期： 2015年8月1日1.目的: 規(guī)范分枝桿菌分離培養(yǎng)操作程序，提高檢驗(yàn)質(zhì)量。2.適用范圍：適用于本實(shí)驗(yàn)室工作人員，工作人員應(yīng)在二級生物安全柜內(nèi)開展分枝桿菌分離培養(yǎng)，按操作程序完成接種。3.職責(zé)：檢驗(yàn)人員按此操作執(zhí)行，科室負(fù)責(zé)人和質(zhì)量監(jiān)督員進(jìn)行監(jiān)督4.操作程序：4.1簡單法4.1.1準(zhǔn)備4.1.1.1將酸羅氏培養(yǎng)基從冷藏環(huán)境中取出，室溫下放置4.1.1.2接通生物安全柜電源預(yù)熱3分鐘4.1.1.3將病人姓名或?qū)嶒?yàn)序號標(biāo)記在前處理管上4.1.1.4待酸羅氏培養(yǎng)基恢復(fù)

2、至室溫，在培養(yǎng)基斜面的背面標(biāo)記病人的姓名、實(shí)驗(yàn)序號、接種日期4.1.2前處理堿處理直接法4%(w/v)naoh的配制：取4 gnaoh加入80ml蒸餾水中，完全溶解后補(bǔ)充蒸餾水至終積100ml。根據(jù)標(biāo)本的粘稠程度，加入12倍體積的4%naoh，渦漩振蕩器振蕩，使標(biāo)本勻化，室溫放置。自加入4%naoh到標(biāo)本接種應(yīng)在20min內(nèi)完成。4.1.3接種、培養(yǎng)與觀察 會理縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 作業(yè)指導(dǎo)書文件編號： jh02 分枝桿菌分離培養(yǎng)作業(yè)指導(dǎo)書第 2 頁 共 4頁第 1 版 第0次修訂頒布日期： 2015年8月1日 4.1.3.1取前處理后的標(biāo)本0.1ml，無菌操作接種于培養(yǎng)基斜面，每份標(biāo)本同時接種兩

3、支培養(yǎng)基上。 4.1.3.2.接種后的培養(yǎng)管在370c溫箱孵育，接種后3天、7天分別觀察結(jié)果一次，然后每周觀察結(jié)果一次。發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經(jīng)抗酸染色證實(shí)為抗酸桿菌，可報告分枝桿菌培養(yǎng)陽性。若滿8周仍無菌落生長，方可報告陰性。觀察時要注意菌落外觀和色素產(chǎn)生情況。4.2濃縮集菌法4.2.1準(zhǔn)備4.2.1.1將改良羅氏培養(yǎng)基從冷藏環(huán)境中取出，室溫下放置4.2.1.2接通生物安全柜電源預(yù)熱3分鐘4.2.1.3將病人姓名或?qū)嶒?yàn)序號標(biāo)記在50ml前處理管上4.2.1.4待改良羅氏培養(yǎng)基恢復(fù)至室溫，在培養(yǎng)基斜面的背面標(biāo)記病人的姓名、實(shí)驗(yàn)序號、接種日期4.2.2前處理4.2.2.1對照標(biāo)記，在生物安全柜內(nèi)將約2

4、ml痰標(biāo)本置于相應(yīng)的前處理管中4.2.2.2視標(biāo)本性狀，在生物安全柜內(nèi)向前處理管內(nèi)加入1-2倍體積nalc-naoh混合溶液4.2.2.3旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上震蕩30-60秒4.2.2.4將前處理管室溫靜置15分鐘4.2.2.4在生物安全柜內(nèi)打開離心管，向離心管中加入pbs緩沖液，不超過40ml，旋緊離心管4.2.2.5配平離心管，將配平的離心管放入離心筒中，3000xg離心20分鐘 縣會理縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 作業(yè)指導(dǎo)書文件編號： jh02 分枝桿菌分離培養(yǎng)性作業(yè)指導(dǎo)書第 3 頁 共 4頁第 1 版 第0次修訂頒布日期： 2015年8月1日4.2.2.6在生物安全柜中打開離心筒，棄上清，加入

5、0.5mlpbs緩沖液，混勻待用4.2.3接種、培養(yǎng)與觀察同簡單法4.3結(jié)果與報告4.3.1.接種并孵育后3天、7天各觀察一次菌落生長情況，發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經(jīng)抗酸染色證實(shí)為抗酸桿菌，可報告分枝桿菌培養(yǎng)陽性。此后每周觀察結(jié)果一次，記錄菌落生長及污染情況。生長手經(jīng)抗酸染色證實(shí)后，可報告分枝桿菌生長。培養(yǎng)陰性結(jié)果須在滿8周后未見菌落生長者方可報告。4.3.2.分枝桿菌培養(yǎng)報告方式：分枝桿菌培養(yǎng)陰性（陰）：斜面上無菌落生長。分枝桿菌培養(yǎng)陽性（1+）：菌落生長占斜面面積的1/4。分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2+）：菌落生長占斜面面積的1/2。分枝桿菌培養(yǎng)陽性（3+）：菌落生長占斜面面積的3/4。分枝桿菌培養(yǎng)陽性（

6、4+）：菌落生長布滿整個斜面。分枝桿菌培養(yǎng)陰性應(yīng)以“培養(yǎng)陰性”報告，不得以“”表示。菌落生長不足斜面面積1/4者，報實(shí)際菌落數(shù)。4.4質(zhì)量控制 4.4.1培養(yǎng)基質(zhì)量控制冷卻后的整批培養(yǎng)基或抽取其中一部分 ，置于370c孵育24h進(jìn)行無菌試驗(yàn)。 對質(zhì)量不合格的培養(yǎng)基，如氣泡、干涸、量不足及發(fā)生污染等，必須廢棄。同時，每批培養(yǎng)基應(yīng)抽取部分接種質(zhì)控菌株（h37rv標(biāo)準(zhǔn)株），觀察其生長情況，以確定培養(yǎng)基的質(zhì)量。4.4.2培養(yǎng)污染率應(yīng)在25%范圍內(nèi)，污染率過高，提示培養(yǎng)基滅菌不佳，標(biāo)本前處理、接種等到環(huán)節(jié)有誤，應(yīng)當(dāng)分析原因，采取相應(yīng)措施。 會理縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 作業(yè)指導(dǎo)書文件編號： jh02 分枝桿菌分離培養(yǎng)性作業(yè)指導(dǎo)書第 4 頁 共 4頁第 1 版 第0次修訂頒布日期： 2015年8月1日4.5 廢棄物的處置 所有標(biāo)本瓶、接種物品及培養(yǎng)管等應(yīng)盡采用一次性物品，使用后均應(yīng)就地高壓滅菌，方可處置。5.