第三章第三節(jié)再生植株【知識(shí)發(fā)現(xiàn)】

1、第三節(jié) 再生植株途徑,1,課堂優(yōu)質(zhì),再生植株途徑,懸浮培養(yǎng)途徑,脫毒苗快繁,育種材料快繁,良種、突變體、種質(zhì)、瀕危材料快繁,外植體,體細(xì)胞雜交材料快繁,融合原生質(zhì)體,各種器官組織,花藥、胚、胚胎、胚乳等,脫毒處理,目的,愈傷組織,叢生芽,胚狀體,原球莖,壯苗,生根,移栽,檢測(cè),脫毒苗檢測(cè),倍性檢測(cè),目的,細(xì)胞生產(chǎn),次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn),種質(zhì)保存,成分檢測(cè)、提取等,愈傷組織,脫分化,再分化,人工種子,2,課堂優(yōu)質(zhì),再生植株途徑 常規(guī)快速繁殖基本環(huán)節(jié) 脫毒苗組織培養(yǎng) 育種培養(yǎng) 細(xì)胞融合,3,課堂優(yōu)質(zhì),第一部分 常規(guī)快速繁殖基本環(huán)節(jié),外植體處理-愈傷組織（脫分化）-叢生芽、胚 狀體、原球莖（再分化）-增

2、值壯苗-根-移栽,4,課堂優(yōu)質(zhì),外植體,愈傷組織（脫分化培養(yǎng)基）,叢生芽（再分化培養(yǎng)基）,再生根（生根培養(yǎng)基）,再分化,脫分化,壯苗（壯苗培養(yǎng)基）,接種,5,課堂優(yōu)質(zhì),6,課堂優(yōu)質(zhì),接種材料修整方法,一、外植體處理,7,課堂優(yōu)質(zhì),接種材料修整方法,8,課堂優(yōu)質(zhì),接種材料修整與沖洗,9,課堂優(yōu)質(zhì),二、愈傷組織形成-脫分化,植物細(xì)胞只要具有一個(gè)完整的膜系統(tǒng)和一個(gè)有生命力的核，即使是已經(jīng)高度成熟和分化，也還保持著回復(fù)到分生狀態(tài)的能力。 一個(gè)細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過(guò)程所能進(jìn)行的程度，取決于它在原來(lái)所處的自然部位上已經(jīng)達(dá)到的細(xì)胞和生理狀態(tài)。,10,課堂優(yōu)質(zhì),1、愈傷組織特點(diǎn),植物細(xì)胞脫分化而不斷增殖形成的愈

3、傷組織，主要由薄壁細(xì)胞構(gòu)成的非器官化組織或不定組織 愈傷組織的顏色、質(zhì)地不同 愈傷組織具有結(jié)構(gòu)的不均一性和生理和遺傳上的不穩(wěn)定性,外植體產(chǎn)生的排列疏松而無(wú)規(guī)則且沒(méi)有發(fā)生分化的薄壁細(xì)胞。,11,課堂優(yōu)質(zhì),2、愈傷組織形成的條件,離體 培養(yǎng)條件（尤其是激素的種類(lèi)和濃度，常用的生長(zhǎng)素是2，4D，IAA和NAA，常用的細(xì)胞分裂素是KT和6BA） 外植體類(lèi)型（木本植物中的幼態(tài)或成年態(tài)） 外植體原來(lái)在植株上所處的位置（它反映了內(nèi)源激素的水平）,12,課堂優(yōu)質(zhì),3、愈傷組織形成的過(guò)程,誘導(dǎo)期 誘導(dǎo)期是外植體細(xì)胞進(jìn)行分裂準(zhǔn)備的時(shí)期。在這一時(shí)期外植體細(xì)胞大小沒(méi)有多大變化，但細(xì)胞內(nèi)合成代謝活躍，RNA含量迅速增加

4、，細(xì)胞核體積明顯增大。 分裂期 細(xì)胞分裂的速度大大超過(guò)了細(xì)胞伸展的速率，細(xì)胞體積迅速變小，逐漸回復(fù)到分生狀態(tài)。外植體細(xì)胞由原來(lái)的靜止?fàn)顟B(tài)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)期的分裂準(zhǔn)備之后進(jìn)入分裂高峰期，回復(fù)為分生狀態(tài)，這整個(gè)過(guò)程即為脫分化。脫分化細(xì)胞不斷進(jìn)行分裂，從而形成了愈傷組織。,13,課堂優(yōu)質(zhì),形成期 形成期是外植體細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)期和分裂期后形成了無(wú)序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時(shí)期。進(jìn)入形成期后，細(xì)胞的平均大小相對(duì)穩(wěn)定，不再減少，細(xì)胞分裂由原來(lái)局限在組織外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細(xì)胞的分裂。 分化期-愈傷組織增殖或形態(tài)發(fā)生： 一方面：愈傷組織增殖-增殖型愈傷組織 另一方面：形態(tài)發(fā)生期,不定芽方式 胚狀體方式-胚型愈

5、傷組織,14,課堂優(yōu)質(zhì),4、愈傷組織增殖,將誘導(dǎo)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上時(shí)，愈傷組織就會(huì)進(jìn)一步增殖生長(zhǎng)，生長(zhǎng)一段時(shí)間以后，又必須重新將愈傷組織切割成一定大小的愈傷組織塊，轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖。 轉(zhuǎn)接必須及時(shí)，因?yàn)橛鷤M織的生長(zhǎng)基本符合s形生長(zhǎng)曲線。,15,課堂優(yōu)質(zhì),1）、無(wú)菌短枝型（微型扦插）,2）、叢生芽發(fā)生型（器官型）,3）、器官發(fā)生型,4）、胚狀體型,5）、原球莖型,三、再生途徑與類(lèi)型-愈傷組織再分化,16,課堂優(yōu)質(zhì),17,課堂優(yōu)質(zhì),微型扦插,頂芽,CTK刺激,帶芽的莖切段,側(cè)芽,接種培養(yǎng),形成的莖梢節(jié)長(zhǎng)，直立向上呈小灌木叢狀,獲得較多嫩莖梢,莖段培養(yǎng)繼代擴(kuò)繁,試管苗,

6、生根培養(yǎng),無(wú)愈傷組織產(chǎn)生,初代,繼代,1、無(wú)菌短枝型（微型扦插）,18,課堂優(yōu)質(zhì),脫分化,分化,少量或無(wú)愈傷組織,芽、芽叢,切割芽叢 繼代培養(yǎng),大量芽叢,試管苗,生根培養(yǎng),外植體,初代,繼代,2、叢生芽發(fā)生型,芽生芽,19,課堂優(yōu)質(zhì),3、器官發(fā)生型,20,課堂優(yōu)質(zhì),器官發(fā)生型有3種基本方式（順序）： 先分化芽再分化根：待芽伸長(zhǎng)后在其幼莖基部長(zhǎng)根，形成完整的小植株，這種方式在木本植物組織培養(yǎng)中較為普遍，因此芽和根的誘導(dǎo)要分兩步完成 先分化根再分化芽：先分化根再在根上產(chǎn)生不定芽而形成完整植株。一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)物若先形成根，則會(huì)抑制芽的形成 愈傷組織的不同部位分別形成芽和根：然后二者的維管組織互相連接

7、，成為具有統(tǒng)一的軸狀結(jié)構(gòu)的小植株,21,課堂優(yōu)質(zhì),來(lái)源：體細(xì)胞 特點(diǎn)：直接成苗 發(fā)生：愈傷組織表面；懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或外植體表面,4、胚狀體型,22,課堂優(yōu)質(zhì),體細(xì)胞胚(somatic embryo)或胚狀體(embryoid)：指的是在植物組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞、經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程形成的具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。 定義表明: 它不同于合子胚，因?yàn)樗皇莾尚约?xì)胞融合的產(chǎn)物; 它不同于孤雌胚或孤雄胚，因?yàn)樗皇菬o(wú)融合生殖的產(chǎn)物; 它不同于組織培養(yǎng)中通過(guò)器官發(fā)生途徑形成的莖芽和根，因?yàn)樗男纬山?jīng)歷與合子胚相似的發(fā)育過(guò)程，而且成熟的胚狀體是一個(gè)雙極性結(jié)構(gòu)。,23,課堂優(yōu)質(zhì),胚狀體苗與器官發(fā)

8、生苗的區(qū)別,24,課堂優(yōu)質(zhì),25,課堂優(yōu)質(zhì),體細(xì)胞胚的應(yīng)用人工種子,人工種子: 將細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的 體細(xì)胞胚或具有發(fā)育成完整植株的分生組織（相當(dāng)于胚）包裹在一層含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的膠囊（相當(dāng)于胚乳）里，再在膠囊外包上一層 具有保護(hù)功能的外膜（相當(dāng)于種皮），形成在適宜條件下能夠發(fā)育成完整植株的人造顆粒，在外形上象石榴。 結(jié)構(gòu)：體細(xì)胞胚、人工胚乳、人工種皮,26,課堂優(yōu)質(zhì),27,課堂優(yōu)質(zhì),優(yōu)點(diǎn)：其一，可使在自然條件下不結(jié)實(shí)或種子昂貴的植物得以繁殖，如三倍體、非整倍體、基因工程植物；其二，固定雜種優(yōu)勢(shì)； 其三，節(jié)省制種用地，且不受季節(jié)限制，可以實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，同時(shí)還避免了種子攜帶病原菌的危險(xiǎn)；,28,課堂

9、優(yōu)質(zhì),其四，與利用試管苗相比，可以避免移栽困難，且可以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化操作，同時(shí)還便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。 其五，用人工種子播種可以節(jié)約糧食。 例如，一個(gè) 12 L的發(fā)酵罐在 20 d內(nèi)生產(chǎn)的胡蘿卜胚狀體，可以制成1000萬(wàn)粒人工種子，供幾千公頃農(nóng)田的種植需要，與天然種子相比，大大節(jié)約了糧食。,29,課堂優(yōu)質(zhì),人工種子利用中的問(wèn)題,（1）貯藏問(wèn)題 ； （2）體細(xì)胞無(wú)性系變異 ； （3）成本問(wèn)題 。,30,課堂優(yōu)質(zhì),短縮的、呈珠粒狀的、由胚性細(xì)胞組成的、類(lèi)似嫩莖的器官。,5、原球莖發(fā)生型,31,課堂優(yōu)質(zhì),初代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問(wèn)題及對(duì)策,污染 操作污染分為細(xì)菌污染和真菌污染 外植體自身帶菌導(dǎo)致的污染 由于表面滅菌

10、不徹底或外植體內(nèi)部帶菌所致 褐變 褐變的概念及影響因素 褐變的防止方法,32,課堂優(yōu)質(zhì),細(xì)菌污染,細(xì)菌污染 表現(xiàn)：在培養(yǎng)過(guò)程中，在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀物體、菌落或渾濁的水跡狀，有時(shí)甚至出現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀。 原因：主要是由于工作人員使用未經(jīng)充分消毒的工具、或由于呼吸排除的細(xì)菌、或操作人員用手接觸材料或器皿的邊緣，使微生物落入培養(yǎng)基中，有時(shí)也會(huì)因剪取某一帶菌材料后用具又未徹底滅菌，造成繼續(xù)污染。,33,課堂優(yōu)質(zhì),真菌污染,真菌污染 表現(xiàn)：在培養(yǎng)過(guò)程中，一般35天發(fā)現(xiàn)菌絲，既而很快出現(xiàn)灰、白、黃、綠等孢子。 原因：空氣污染以及取放瓶塞揚(yáng)起的灰塵和真菌孢子落入器皿中造成。,34,課堂優(yōu)質(zhì),褐變的

11、概念及影響因素,概念 褐變是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象。 褐化的發(fā)生是由于組織中多酚氧化酶被激活，酚類(lèi)化合物被氧化形成褐色的醌類(lèi)物質(zhì)。醌類(lèi)化合物在酪氨酸酶的作用下，與培養(yǎng)材料組織中蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，引起其它酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致代謝紊亂，生長(zhǎng)受阻。 影響因素 基因型 材料的生理狀態(tài) 培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)時(shí)間,35,課堂優(yōu)質(zhì),褐變的防止方法,選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w，掌握適宜的采芽時(shí)間 外植體用流水沖洗30分鐘以上，在接種前將外植體在無(wú)菌水中浸泡處理 降低對(duì)外植體的切割損傷，或在無(wú)菌水中切割 降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度；缺省生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)可減少酮類(lèi)物質(zhì)分泌和氧化 使用液體培

12、養(yǎng)基可以迅速稀釋外植體傷口處分泌出的有毒物質(zhì) 在培養(yǎng)基中加入活性炭 在培養(yǎng)基中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP 加入抗氧化劑如檸檬酸、維生素C、L半胱氨酸、硫脲 在培養(yǎng)基中添加氨基酸(谷酰胺、精氨酸、天冬酰胺)、芳香甙、硫代硫酸鈉 連續(xù)轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上有時(shí)可緩慢阻止色素的形成 由苗芽基部光激活引起的褐化可通過(guò)將苗芽基部處于黑暗狀態(tài)得以消除 控制光溫條件，避免過(guò)高,36,課堂優(yōu)質(zhì),四、試管苗的增殖和繼代培養(yǎng),37,課堂優(yōu)質(zhì),試管苗的增殖和繼代培養(yǎng),植物材料在容器中培養(yǎng)一段時(shí)間后，往往需要轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上去生長(zhǎng)。因?yàn)椋?培養(yǎng)基消耗盡 植物材料在培養(yǎng)容器中已占盡生長(zhǎng)空間 需進(jìn)一步增殖(轉(zhuǎn)到同樣配方的

13、培養(yǎng)基上) 植物材料轉(zhuǎn)入下一階段生長(zhǎng)或另一種器官分化(轉(zhuǎn)到不同配方的培養(yǎng)基上) 由于無(wú)機(jī)鹽和瓊脂濃度過(guò)高而導(dǎo)致培養(yǎng)基干化 由于pH值下降而引起培養(yǎng)基流體化 防止褐化現(xiàn)象發(fā)生而轉(zhuǎn)接 適應(yīng)生根培養(yǎng),38,課堂優(yōu)質(zhì),繼代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問(wèn)題 再生能力的下降 玻璃化現(xiàn)象 馴化作用,39,課堂優(yōu)質(zhì),試管苗繼代培養(yǎng)過(guò)程中分化再生能力衰退 原因：1、愈傷組織培養(yǎng)逐漸喪失了成器官中心；2、內(nèi)源激素的減少；3、染色體畸變。 解決措施：增加外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)；篩選具有形態(tài)分生能力細(xì)胞團(tuán)；縮短繼代時(shí)間；重新建立細(xì)胞系。,40,課堂優(yōu)質(zhì),玻璃化現(xiàn)象,玻璃化現(xiàn)象(vitrification) 是一種異常的生理現(xiàn)象。 玻璃化

14、苗是植物組織培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)的半透明狀、畸形的試管苗。 其解剖特點(diǎn)為：整株植物矮小腫脹，呈半透明狀。有時(shí)發(fā)育出大量短而粗的莖，節(jié)間很短或幾乎沒(méi)有節(jié)間。輸導(dǎo)組織雖可看到，但導(dǎo)管和管胞木質(zhì)化不完全。葉片厚而狹長(zhǎng)，有時(shí)基部較寬。葉片皺縮或縱向卷曲，脆弱易折碎。葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)或蠟質(zhì)發(fā)育不完全，無(wú)功能性氣孔器。玻璃化葉片不具有柵欄組織，僅有海綿組織。,41,課堂優(yōu)質(zhì),玻璃化現(xiàn)象,玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因 一般而言，培養(yǎng)條件與玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生有關(guān).培養(yǎng)條件引起試管苗碳水化合物、氮代謝和水分狀態(tài)等發(fā)生生理異常。 降低和減輕玻璃化現(xiàn)象采取的措施 增加瓊脂和(或)糖濃度 改善培養(yǎng)容器的氣體交換 改變培養(yǎng)基的大量鹽類(lèi)

15、降低BA水平 增強(qiáng)光照，適當(dāng)降低溫度 避免采用容易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象的瓊脂種類(lèi) 采用液固兩相培養(yǎng)基,42,課堂優(yōu)質(zhì),玻璃化苗發(fā)生的機(jī)理,試管苗玻璃化的產(chǎn)生是由于內(nèi)源激素乙烯在代謝調(diào)節(jié)中所起的關(guān)鍵性啟動(dòng)作用。試管苗在脅迫培養(yǎng)環(huán)境中，如水勢(shì)不當(dāng)，通氣不暢、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度過(guò)高、溫度過(guò)高等，導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生。培養(yǎng)瓶空氣中過(guò)剩的乙烯抑制了試管苗體內(nèi)乙烯的生物合成，但誘發(fā)了其它激素質(zhì)和量的改變及酶類(lèi)的變化；另外，培養(yǎng)瓶中氣體組成的改變，也影響磷酸戊糖途徑、光呼吸途徑的進(jìn)行。,43,課堂優(yōu)質(zhì),馴化作用,馴化作用是指原先依賴(lài)于某種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)而生長(zhǎng)的培養(yǎng)物，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的繼代培養(yǎng)后，不再需要這種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，即變成對(duì)

16、該生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)自養(yǎng)的培養(yǎng)物的現(xiàn)象 馴化作用一般并非是永久性變化，有時(shí)培養(yǎng)條件變化也會(huì)逆轉(zhuǎn)馴化作用，所以馴化作用是外遺傳變化。 馴化作用可在繼代培養(yǎng)中自然發(fā)生，也可人為地改變培養(yǎng)條件，可以誘導(dǎo)或逆轉(zhuǎn)這種馴化作用。 馴化作用可能是由于植物組織內(nèi)對(duì)該生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成增加所致，也可能是降解速率降低或受到保護(hù)所致，組織對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)敏感性降低也可能是一種原因，也不排除上述幾個(gè)原因共同作用的結(jié)果。,44,課堂優(yōu)質(zhì),五、 壯苗與生根,壯苗 材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流，使太細(xì)弱的材料達(dá)到壯苗的目的 生根（離體生根和活體生根）,45,課堂優(yōu)質(zhì),離體生根,壯苗后的單苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后即可生根。

17、一般來(lái)說(shuō)，多數(shù)植物的生根只需要一次培養(yǎng)，但有少部分植物的生根必須經(jīng)過(guò)多次培養(yǎng)才能達(dá)到目的。 一般認(rèn)為礦物元素濃度較高時(shí)有利于發(fā)展莖葉，而較低時(shí)有利于生根，所以多采用1/2或1/4量的MS培養(yǎng)基，全部去掉或僅用很低的細(xì)胞分裂素，并加入適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)素。,46,課堂優(yōu)質(zhì),活體生根,又稱(chēng)試管外生根：芽苗先在生長(zhǎng)素中快速浸蘸或在含有相對(duì)高濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)510天，然后在溫室中栽入培養(yǎng)基質(zhì)中，并輔以高濕度環(huán)境，即經(jīng)常噴霧，幾天后，芽苗可自行生根。,47,課堂優(yōu)質(zhì),六、馴化移栽,48,課堂優(yōu)質(zhì),試管苗的特點(diǎn) 1、根與輸導(dǎo)系統(tǒng)不通 ； 2、在高濕、弱光和異養(yǎng)條件下分化和生長(zhǎng)的葉，葉表保護(hù)組織不發(fā)達(dá)甚至完

18、全沒(méi)有，易于失水萎焉。試管苗葉光合作用能力極低。 3、組織幼嫩、結(jié)構(gòu)較松散、細(xì)胞含水率高，機(jī)械組織不發(fā)達(dá)，容易發(fā)生機(jī)械損傷，對(duì)病蟲(chóng)害特別敏感,49,課堂優(yōu)質(zhì),試管苗生態(tài)環(huán)境與自然環(huán)境的差異,高溫且恒溫 高濕 弱光 無(wú)菌,不恒溫 高濕 強(qiáng)光 有菌,50,課堂優(yōu)質(zhì),基本步驟： 煉苗（訓(xùn)化）-移栽-移栽后管理,51,課堂優(yōu)質(zhì),（一）、試管苗的馴化,目的：提高試管苗的適應(yīng)性，促其健壯，最終提高移栽成活率 原則： 從溫、光、濕度及有無(wú)雜菌等環(huán)境因素考慮。 馴化開(kāi)始數(shù)天內(nèi)，與培養(yǎng)環(huán)境條件相似；后期與預(yù)計(jì)栽培條件相似，逐步適應(yīng)。 方法：即煉苗。不開(kāi)口自然光下2-3天，然后開(kāi)口1-2天。,52,課堂優(yōu)質(zhì),1、

19、瓶煉：試管苗在移植前必須對(duì)其進(jìn)行高光強(qiáng)鍛煉，同時(shí)將瓶口包扎物打開(kāi)，使試管苗慢慢適應(yīng)外界環(huán)境，讓植株生長(zhǎng)粗壯，增強(qiáng)小苗體質(zhì)以提高移苗成活率，這個(gè)過(guò)程叫做馴化或煉苗。 關(guān)鍵技術(shù)： 1）生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)的天數(shù)； 2）生根的狀態(tài) ； 3）煉苗時(shí)的光照強(qiáng)度 ； 4）煉苗的時(shí)間 ； 5）瓶苗開(kāi)口也有技巧可言,53,課堂優(yōu)質(zhì),2、盤(pán)煉：從瓶中小心取出試管苗，在20度左右的溫水中浸泡約10min，換水兩次，將粘附于試管苗根部的培養(yǎng)基清洗干凈，迅速栽在裝有已經(jīng)過(guò)消毒處理的基質(zhì)的育苗盤(pán)中，噴淋透水，噴灑一定劑量的殺菌藥，然后放在干凈、排水良好的溫室或塑料保溫棚中，保持較高的空氣濕度，煉苗20天左右。 關(guān)鍵技術(shù)：

20、1）取苗時(shí)手要輕。如果培養(yǎng)基太干燥，可以先用清水浸泡一段時(shí)間； 2）煉苗基質(zhì)以疏松、排水性和透氣性良好者為宜，且必須經(jīng)過(guò)消毒處理； 3）植苗入盤(pán)的時(shí)間，最好選在無(wú)風(fēng)陰濕的天氣 ； 4）對(duì)于剛進(jìn)行盤(pán)煉的小苗，要特別注意掌握光照 ； 5）盤(pán)煉進(jìn)行一周后，應(yīng)該適當(dāng)葉面追肥 。,54,課堂優(yōu)質(zhì),（二）、移栽 1、大田移栽 2、容器移栽,55,課堂優(yōu)質(zhì),試管苗的移栽,移栽方法：取出試管苗，全部輕洗去培養(yǎng)基栽入基質(zhì)(事先澆透水)后，栽后輕澆薄水，移入高濕環(huán)境(90%以上)。 移栽場(chǎng)所與設(shè)施：日光溫室塑料大棚馴化室 軟塑料缽、育苗盤(pán)、苗床。 移栽時(shí)期：選擇自然出苗期 移栽基質(zhì)：要求透氣、保濕、保肥，易滅菌。

21、可選用珍珠巖、蛭石、沙子；外加草炭、腐殖土。 配比： 珍珠巖：蛭石：草炭或腐殖土=1：1：0.5； 沙子：草炭或腐 殖土=1：1,56,課堂優(yōu)質(zhì),組培馴化常用基質(zhì),57,課堂優(yōu)質(zhì),基質(zhì)配比： 珍：蛭：草( 腐殖土)=1：1：0.5 珍：草(腐殖土)=1：1,注意基質(zhì)配比并保持適當(dāng)?shù)耐庑?58,課堂優(yōu)質(zhì),保持基質(zhì)通氣性： 選顆粒狀基質(zhì)，澆水勿多。,59,課堂優(yōu)質(zhì),爐渣預(yù)處理、做畦與裝填基質(zhì),60,課堂優(yōu)質(zhì),基質(zhì)裝填后狀態(tài)與澆水,61,課堂優(yōu)質(zhì),62,課堂優(yōu)質(zhì),試管苗的移栽方法,63,課堂優(yōu)質(zhì),試管苗的移栽方法,64,課堂優(yōu)質(zhì),65,課堂優(yōu)質(zhì),（三）、試管苗移栽后的管理 1、保持小苗的水份供需平

22、衡 ； 2、控制溫度 ； 3、控制光照 ； 4、菌類(lèi)控制。,66,課堂優(yōu)質(zhì),保持小苗水分供需平衡,1周內(nèi)： 環(huán)境高濕。 1周后： 小苗生長(zhǎng)后逐漸降濕，拱棚兩端通風(fēng)。 半個(gè)月后： 揭膜，控水。,67,課堂優(yōu)質(zhì),防止菌類(lèi)滋生,基質(zhì)高壓滅菌或3h烘烤滅菌或太陽(yáng)能滅菌。 適當(dāng)使用殺菌劑、消毒劑。 移栽時(shí)少傷苗。 噴水加0.1%尿素或1/2MS大量元素液追肥，加快苗生長(zhǎng)。,68,課堂優(yōu)質(zhì),溫光條件適宜,適宜生根溫度：1820，溫度低可加地?zé)峋€。 移栽初期弱光，后逐漸加強(qiáng)光照，過(guò)渡到自然光照。,69,課堂優(yōu)質(zhì),提高試管苗質(zhì)量 及時(shí)出瓶馴化，避免試管苗老化 改善環(huán)境條件，減少蒸騰，防止葉片灼傷 選擇適宜的基

23、質(zhì) 防止菌類(lèi)滋生 保持試管苗水分供需平衡 加強(qiáng)肥水管理和病蟲(chóng)害防治,提高試管苗馴化移栽成活率的措施,70,課堂優(yōu)質(zhì),71,課堂優(yōu)質(zhì),第二部分 脫毒苗組織培養(yǎng),脫毒處理+常規(guī)快速繁殖環(huán)節(jié)+檢測(cè),72,課堂優(yōu)質(zhì),脫毒苗的獲取及繁育技術(shù),概述 脫毒材料的獲取 病毒的檢測(cè)規(guī)程 無(wú)毒體系的保持,73,課堂優(yōu)質(zhì),概述,近年來(lái)，隨著我國(guó)觀賞花卉種植面積和栽培種類(lèi)的不斷提高，病毒的發(fā)生與危害也逐年加重，病毒病已上升成為影響觀賞花卉質(zhì)量、產(chǎn)量的主要病害 受病毒侵染的觀賞花卉有可能會(huì)表現(xiàn)為花葉、碎色、褪綠、黃化等癥狀。然而，很多病毒可能不表現(xiàn)任何可見(jiàn)癥狀，但受害的植株長(zhǎng)勢(shì)下降，品質(zhì)退化，產(chǎn)量、抗逆性下降 目前獲得

24、無(wú)毒種苗常用方法主要是采用莖尖培養(yǎng)、熱處理、藥劑處理等脫毒技術(shù)來(lái)消除營(yíng)養(yǎng)體中的病源，并由這些組織再生出完整的植株，作為原原種 國(guó)內(nèi)外常用于病毒檢測(cè)鑒定方法包括生物學(xué)(如鑒別寄主)、血清學(xué)(如ELISA)、分子生物學(xué)(如PCR)三類(lèi) 本章重點(diǎn)討論脫毒材料的獲取、花卉病毒的檢測(cè)規(guī)程、無(wú)毒體系的保持等三方面的內(nèi)容,74,課堂優(yōu)質(zhì),脫毒材料的獲取,熱處理脫毒 莖尖脫毒 抗病毒藥劑處理脫毒 影響莖尖脫毒的因素,75,課堂優(yōu)質(zhì),脫毒方式： 熱處理脫毒病毒鈍化(寄主植物很少或不會(huì)受到傷害) 溫湯浸漬處理： 在50左右的溫水中浸漬 10分鐘至數(shù)小時(shí)。缺點(diǎn)：易使材料受傷。 熱空氣處理：35-40，幾十分鐘，長(zhǎng)可

25、達(dá)數(shù)月溫?zé)嶂委熓遥ㄏ洌﹥?nèi) ?？刹捎米儨靥幚?，即晝夜或隔日高低溫交替處理的方法，以提高脫毒成功率缺點(diǎn)：缺陷是并非能脫除所有病毒。熱處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成植株代謝紊亂，影響成活率，加大了品種變異的可能性 。 熱處理需與其他方法配合應(yīng)用才可獲得良好的效果。,76,課堂優(yōu)質(zhì),生長(zhǎng)點(diǎn)（約0.1-1MM區(qū)域）幾乎不含或含病毒很少.,莖尖培養(yǎng)脫毒,77,課堂優(yōu)質(zhì),莖尖脫毒： 分生組織中不含病毒可能跟以下幾點(diǎn)有關(guān) 代謝活性高 病毒的增殖依賴(lài)于寄主的代謝，由于分生組織具有很高的代謝活性，病毒無(wú)法控制寄主的代謝機(jī)制 無(wú)維管組織 病毒是通過(guò)維管組織在寄主的組織中進(jìn)行快速擴(kuò)散的，由于分生組織中無(wú)細(xì)胞分化，那些存在于韌皮

26、部的病毒(如PLRV)就不可能侵染分生組織，而侵染非韌皮部病毒也只能通過(guò)胞間連絲進(jìn)行細(xì)胞間傳播，但它的速度很慢，難以侵染快速分裂的莖尖細(xì)胞 高激素濃度 植物的分生組織比其他組織的植物激素濃度高，可以抑制病毒的增殖,78,課堂優(yōu)質(zhì),影響莖尖脫毒的因素,培養(yǎng)基 選擇正確培養(yǎng)基，可以顯著提高獲得完整植株的成功率 莖尖剝離體的大小 在最適培養(yǎng)基條件下，莖尖剝離體的大小對(duì)其存活率的影響較大。一般被剝?nèi)〉那o尖越大，越容易產(chǎn)生再生植株。但植株莖尖的脫毒效率與其大小呈負(fù)相關(guān)，因此被剝?nèi)〉那o尖應(yīng)該小到足以能夠脫除病毒，但又能夠發(fā)育成為一個(gè)完整的植株,79,課堂優(yōu)質(zhì),培養(yǎng)條件 莖尖的生理狀態(tài) 莖尖最好要從活躍生長(zhǎng)

27、的芽上切取 取芽的時(shí)間,80,課堂優(yōu)質(zhì),其他途徑脫毒 愈傷組織培養(yǎng)脫毒僅有部分單個(gè)細(xì)胞含有病毒病毒的復(fù)制速度趕不上細(xì)胞的增殖速度或有些細(xì)胞通過(guò)突變獲得了抗病毒的抗性。缺陷植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會(huì)產(chǎn)生變異植株，并且一些作物的愈傷組織尚不能產(chǎn)生再生植株。抗病毒藥劑處理脫毒：尖培養(yǎng)結(jié)合抗病毒劑處理，是觀賞花卉脫毒種苗規(guī)模化生產(chǎn)的較好選擇,81,課堂優(yōu)質(zhì),脫毒效果檢測(cè) 抗血清(antiserum)鑒定：已知植物病毒核蛋白（抗原）制備抗體；抗血清+未知的病毒植物可見(jiàn)的沉淀（試管） 酶聯(lián)免疫吸收鑒定（ELISA）：已知植物病毒（抗原）+一抗（已制備）二抗（酶）酶的顯色底物溶液 酶標(biāo)儀檢測(cè) 電子顯微鏡（el

28、ectric microscope)檢查法：直接觀察病毒 的有無(wú)或種類(lèi) 指示植物法(indicating plant) ：被鑒定植物 的汁液接種指示植物或嫁接接種法 （指示植物作為砧木，被鑒定植物作接穗 ）,82,課堂優(yōu)質(zhì),無(wú)毒體系的保持,原原種的無(wú)毒保持 原原種的保持與擴(kuò)繁可通過(guò)組培方式 也可通過(guò)栽培方式進(jìn)行 原種的無(wú)毒保持 采穗圃的無(wú)毒保持 無(wú)毒優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)程序,83,課堂優(yōu)質(zhì),原原種的無(wú)毒保持,通過(guò)栽培方式進(jìn)行應(yīng)注意 防蟲(chóng)溫室 單盆定植 器具消毒 清潔衛(wèi)生 定期噴藥 病毒檢測(cè),84,課堂優(yōu)質(zhì),原種的無(wú)毒保持,原種在保持條件上，與原原種基本相同 (如仍需防蟲(chóng)溫室、基質(zhì)滅菌、器具消毒、清潔衛(wèi)

29、生、定期藥劑防除等) 仍有不同之處 單系種植 病毒抽測(cè) 注：原種的繁殖不能無(wú)限制地進(jìn)行，否則會(huì)造成植株退化，生活力下降,85,課堂優(yōu)質(zhì),采穗圃的無(wú)毒保持,采穗圃是整個(gè)無(wú)毒體系的主體之一，也是實(shí)現(xiàn)商品價(jià)值的重要環(huán)節(jié) 離地栽培 適當(dāng)稀植 母本植株更新與基質(zhì)消毒 定期噴藥 病毒抽測(cè),86,課堂優(yōu)質(zhì),第三部分 育種培養(yǎng),花藥和花粉培養(yǎng)：外植體+常規(guī)培養(yǎng)+倍性檢測(cè)-單倍體培養(yǎng) 胚胎培養(yǎng)：胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、 胚乳培養(yǎng)-克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性 細(xì)胞融合及融合細(xì)胞培養(yǎng),87,課堂優(yōu)質(zhì),（一）、花藥及花粉培養(yǎng),1、概念與意義 花藥培養(yǎng)：花藥培養(yǎng)是把花粉發(fā)育到一定階段的花藥接種到培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育

30、程序，使其分裂形成細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而分化成胚狀體，產(chǎn)生再生植株，或形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。,88,課堂優(yōu)質(zhì),89,課堂優(yōu)質(zhì),1.4.2 花藥及 花粉培養(yǎng),花藥培養(yǎng)的基本程序是：外植體選擇外植體(花蕾)預(yù)處理外植體消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導(dǎo)培養(yǎng)分化培養(yǎng),90,課堂優(yōu)質(zhì),花藥培養(yǎng)前給予一定的低溫處理是十分必要的。 煙草、茄子 35 72小時(shí) 水稻 10 1014天 柑橘 3 510天 馬鈴薯 4 48小時(shí) 低溫處理的作用： 可以激發(fā)花粉母細(xì)胞產(chǎn)生兩個(gè)相等核:一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核一個(gè)生殖核；保持高比例的強(qiáng)生活力花粉，同時(shí)延緩體細(xì)胞組織的衰老； 激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚；促使細(xì)胞同步分裂。,1.4.2 花藥及 花粉培

31、養(yǎng),91,課堂優(yōu)質(zhì),花藥培養(yǎng)中單倍體形成的途徑 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑: 生殖核退化,營(yíng)養(yǎng)核發(fā)育 生殖細(xì)胞發(fā)育途徑: 營(yíng)養(yǎng)核退化，生殖核發(fā)育 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞同時(shí)發(fā)育的途徑: 花粉均等分裂途徑:,1.4.2 花藥及 花粉培養(yǎng),92,課堂優(yōu)質(zhì),花粉及小孢子培養(yǎng):花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來(lái)，以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。由于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的植株都是單倍體植株。 花粉培養(yǎng)的基本程序是：取材時(shí)期的確定外植體(花蕾)預(yù)處理外植體消毒花粉或小孢子的分離接種培養(yǎng) 取材時(shí)期的確定 四分體單核早期單核晚期雙核早期雙核晚期三核期 預(yù)處理有利于改變正常的發(fā)育途徑，

32、而且還可以促進(jìn)花粉植株的形成,93,課堂優(yōu)質(zhì),花粉或小孢子的分離: 花藥小燒杯(有基本培養(yǎng)基)擠壓花藥(注射器內(nèi)管) 花粉釋放過(guò)濾(尼龍篩)低速離心（100-160r/min)吸管吸掉碎片加入新鮮培養(yǎng)基連續(xù)進(jìn)行兩次過(guò)濾，到每毫升含103-104個(gè)花粉/mL 培養(yǎng)方法 花藥看護(hù)培養(yǎng)花粉懸浮培養(yǎng)（微室培養(yǎng)）,94,課堂優(yōu)質(zhì),單倍體植株的鑒定與二倍化 鑒定方法：形態(tài)學(xué)鑒定 染色體分析 單倍體植株的二倍化：秋水仙素處理加倍,95,課堂優(yōu)質(zhì),優(yōu)點(diǎn)：不受花藥的藥隔，藥壁、花絲等體細(xì)胞的干擾；缺點(diǎn)是較比花粉培養(yǎng)難度大。為何更多的要花藥培養(yǎng)? (藥壁提供激素) 共同的目的：花粉細(xì)胞單倍體(haploid)細(xì)胞

33、單倍體植株（但不是最終目的但具應(yīng)用潛力，為什么？）經(jīng)染色體加倍正常結(jié)實(shí)二倍體植株。,96,課堂優(yōu)質(zhì),單倍體植物三個(gè)明顯的特點(diǎn)： 體細(xì)胞染色體數(shù)減半； 生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??； 雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮械纳踔敛荒苓M(jìn)入有性世代。 加倍后的二倍體特點(diǎn)： 屬于真正的純系。和常規(guī)多代自交純化方法相比，可節(jié)省大量的時(shí)間和勞力。,97,課堂優(yōu)質(zhì),單倍體植株的二倍體化,試管小苗期間用0.20.4%秋水仙溶液浸泡處理2448小時(shí)； 用同樣濃度的秋水仙素溶液處理已移栽土壤的單倍體植株的生長(zhǎng)錐 利用組織培養(yǎng)過(guò)程中，植物細(xì)胞易于自發(fā)加倍的特點(diǎn)，培養(yǎng)從單倍體植物上切取的外植體，誘導(dǎo)形成愈傷組織后再使之分化，通常

34、可得到很高比例的二倍體。,98,課堂優(yōu)質(zhì),（二）、植物胚胎培養(yǎng) 植物胚胎培養(yǎng)包括胚培養(yǎng)、 胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、 胚乳培養(yǎng)。 1、植物胚培養(yǎng)(embryo culture of plants) 克服雜交育種中雜種胚的 早期夭折 胚培養(yǎng)包括成熟胚 (mature embryo)培養(yǎng)； 幼胚(immature embryo)培養(yǎng),99,課堂優(yōu)質(zhì),2、 子房培養(yǎng) 子房培養(yǎng)包括授粉前和授粉后的子房培養(yǎng)。 材料的選擇 品種間的差異 胚囊發(fā)育時(shí)期與花粉發(fā)育時(shí)期的相關(guān)性（大麥） 花粉發(fā)育時(shí)期 胚囊發(fā)育時(shí)期 單核中期 大孢子四分體 單核靠邊期 單核至四核胚囊 二核花粉期 八核胚囊 三核花粉期 成熟胚囊,100,

35、課堂優(yōu)質(zhì),3、 胚乳培養(yǎng) 胚乳細(xì)胞的全能性？被子植物與裸子植物胚乳（三倍體或單倍體？） （在離體培養(yǎng)條件下，胚乳細(xì)胞是否與其它體細(xì)胞和花粉一樣，具有全能性而再生植株。） 大多數(shù)被子植物的胚乳是三倍體，能否通過(guò)胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株而得到無(wú)籽結(jié)實(shí)；通過(guò)胚乳培養(yǎng)技術(shù)，探索改良農(nóng)、林及園藝植物三倍體育種技術(shù)的可能性。 到目前為止，已有40多種植物的胚乳進(jìn)行了培養(yǎng)。其中蘋(píng)果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等的胚乳培養(yǎng)得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、葉等或得到愈傷組織。,101,課堂優(yōu)質(zhì),裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳為配子體的一部

36、分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此它是單倍體組織。 在被子植物中胚乳是雙受精的產(chǎn)物，在倍性上屬于三倍體，事實(shí)上我們培養(yǎng)胚乳的首要目的也是為了直接獲得三倍體植株。,102,課堂優(yōu)質(zhì),幾個(gè)概念： 什么是原生質(zhì)體：？ 原生質(zhì)體培養(yǎng)是將植物原生質(zhì)體在一定條件下培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)細(xì)胞壁再生而形成細(xì)胞，再分裂成細(xì)胞團(tuán)的過(guò)程。,第四部分 細(xì)胞融合,103,課堂優(yōu)質(zhì),104,課堂優(yōu)質(zhì),植物原生質(zhì)體的特點(diǎn)（與植物細(xì)胞比）： 仍然具細(xì)胞全能性 吸收能力增強(qiáng) 分泌能力增強(qiáng) 穩(wěn)定性較差,105,課堂優(yōu)質(zhì),原生質(zhì)體融合，即體細(xì)胞雜交。用人工的方法，把分離的不同品種或不同種的原生質(zhì)體誘導(dǎo)成融合細(xì)胞，再經(jīng)離體培養(yǎng)誘導(dǎo)分化和再生完整

37、植株的整個(gè)過(guò)程。若取材為體細(xì)胞，則成為體細(xì)胞雜交。 原生質(zhì)體制備和培養(yǎng)是原生質(zhì)體融合的先導(dǎo)技術(shù),106,課堂優(yōu)質(zhì),4.1 基本程序： 原生質(zhì)體制備（材料的選擇、酶的使用、滲透壓的調(diào)控、原生質(zhì)體的收集與純化、原生質(zhì)體活力的測(cè)定 ）原生質(zhì)體融合（過(guò)程/方法：自發(fā)融合、誘導(dǎo)融合/方式：對(duì)稱(chēng)融合、不對(duì)稱(chēng)融合；自體融合、異體融合）雜種細(xì)胞選擇雜種細(xì)胞培養(yǎng)由雜種組織再生植株雜種或胞質(zhì)雜種植株的鑒定 4.2細(xì)胞融合的意義,107,課堂優(yōu)質(zhì),原生質(zhì)體制備：將旺盛生長(zhǎng)的植物細(xì)胞懸浮在含滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中，加入適量的細(xì)胞壁水解酶，在一定條件下作用一段時(shí)間，使細(xì)胞壁破壞。除去細(xì)胞壁碎片、未作用的細(xì)胞等，即得

38、。,質(zhì)壁分離,使相對(duì)穩(wěn)定,復(fù)合酶（緩沖液+滲透壓穩(wěn)定劑+細(xì)胞膜保護(hù)劑+表面活性劑）,材料差異,25-30 ,108,課堂優(yōu)質(zhì),取材與除菌,取材與除菌,取材與除菌,酶解,為何？,分離,洗滌,鑒定P61后保存,109,課堂優(yōu)質(zhì),融合的過(guò)程：三階段 1、凝聚作用：因胞間連絲的作用，2個(gè)或2個(gè)以上的原生質(zhì)體質(zhì)膜彼此靠近 2、連接“橋”的形成：質(zhì)膜緊密粘連，細(xì)胞質(zhì)間呈連續(xù)狀態(tài)。 3、異核體或同核體的形成：細(xì)胞質(zhì)橋的擴(kuò)展，融合完成。,異體融合：不同種的雙親原生質(zhì)體發(fā)生融合得到“異核體”,自體融合：發(fā)生在同一個(gè)親本原生質(zhì)體之間的融合得到“同核體”,110,課堂優(yōu)質(zhì),一、融合方法：自發(fā)融合和誘導(dǎo)融合 誘導(dǎo)融合

39、的方法： 1、物理方法電融合法 原理 （1）交流電的作用原生質(zhì)體靠近，串珠狀 （2）直流電的作用破壞細(xì)胞膜，使融合 優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，但設(shè)備昂貴,111,課堂優(yōu)質(zhì),具體操作： （1）加樣：融合培養(yǎng)基（葡萄糖15%+NaCl6%）2d +親本原生質(zhì)體懸浮液各1d混合，放置10-20 min （2）倒置觀察 （3）通交流電1s（50Hz. 3040V）放置10-20min （4）直流電 （5）洗脫：洗脫液（CaCl2.2H2O2%+甘露醇5%）搖1h （6）離心（80g）3-5min，去上清液 （7）培養(yǎng),112,課堂優(yōu)質(zhì),融合成功與否的影響因素 （1）基因型-不同材料融合條件不同。 （2）原生質(zhì)

40、體的濃度105/ml。大于105/ml，連珠長(zhǎng)，易多核融合；小于105/ml，接觸疏松，不易融合。 （3）親本混合的比例與自體融合的難易有關(guān) A B自體融合難易接近，則1：1；如A更易自體融合，則A：B=1:5-10 （4）交變電的強(qiáng)度：影響成串的速度和質(zhì)量。 （5）直流高電壓脈沖：影響異質(zhì)融合率。,113,課堂優(yōu)質(zhì),2、PEG-高鈣高pH法： 原理： PEG促形成異核體。 高鈣離子是原生質(zhì)體間的聯(lián)系者，可促原生質(zhì)體間的粘合，使更易融合，且維持原生質(zhì)體與融合體的穩(wěn)定性，防破裂。 高pH使質(zhì)膜表面特性發(fā)生改變從而促進(jìn)融合。,水溶性高分子化合物，可做蛋白質(zhì)的脫水和植物的水分脅迫實(shí)驗(yàn)；PEG4000

41、，6000，10000等；重復(fù)性好、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒,114,課堂優(yōu)質(zhì),操作：試管中進(jìn)行 （1）加樣 （2）低速離心：原生質(zhì)體聚集在一起 （3）加2mL促融劑（甘氨酸-NaOH+ CaCl2.2H2O+甘露醇PEG）37水浴10-30 min （4）洗滌：甘露醇+ CaCl2.2H2O，反復(fù)兩次 （5）培養(yǎng),克服原生質(zhì)體之間的排斥作用,115,課堂優(yōu)質(zhì),影響因素： （1）原生質(zhì)體密度 4%-5% （2）PEG種類(lèi)和濃度：南瓜+黃瓜：PEG6000 25-35%的濃度；馬鈴薯栽培種+野生種： PEG4000 20-30% （3）Ca2+ pH （4）融合液的滲透壓、保溫時(shí)間 （5）培養(yǎng)時(shí)間,116,課

42、堂優(yōu)質(zhì),二、融合方式： 對(duì)稱(chēng)融合：完整原生質(zhì)體的融合核與核融合，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)融合形成對(duì)稱(chēng)雜種，可發(fā)育成遺傳穩(wěn)定的異源雙二倍體。,異源四倍體中,由于兩個(gè)種的染色體各具有兩套,染色體數(shù)為雙親之和；外型：中間類(lèi)型；自交可正常結(jié)實(shí),結(jié)果：導(dǎo)入有用基因的同時(shí)，也帶入了不利基因,117,課堂優(yōu)質(zhì),非對(duì)稱(chēng)融合：利用某種外界因素x射線射線對(duì)親本之一的原生質(zhì)體選擇性地破壞其細(xì)胞核（A），由用碘乙酰胺等處理在細(xì)胞核中含優(yōu)良基因的另一種親本的原生質(zhì)體，選擇性地使細(xì)胞質(zhì)失活(B)，二者的原生質(zhì)體融合實(shí)現(xiàn)性狀的優(yōu)化組合形成不對(duì)稱(chēng)雜種,染色體達(dá)不到雙親之和；外型呈中間型或偏一方；雄性器官退化，正?；ǚ哿Ｉ?，育性低,118,課堂優(yōu)質(zhì),對(duì)稱(chēng)雜種：親本雙方原生質(zhì)體完全融合在一起，相互之間未發(fā)生排斥。 不對(duì)稱(chēng)雜種：親本雙方原生質(zhì)體部分融合或在融合體在分裂過(guò)程中一方的部分核或質(zhì)被排斥。,119,課堂優(yōu)質(zhì),雜種細(xì)胞選擇,1、借助于精巧的顯微操作技術(shù)將融合體和雜種細(xì)胞直接挑選出來(lái)。 可見(jiàn)標(biāo)記法：雙親及雜種的大小、顏色差異（大豆與煙草；荔枝和龍眼）； 缺點(diǎn)：有時(shí)不能讓人信服，改進(jìn)：自動(dòng)細(xì)胞檢測(cè)儀,120,課堂優(yōu)質(zhì),大豆下胚軸原生