重組人干擾素α2a

1、注射用重組人干擾素1b從干擾素最初發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已經(jīng)過(guò)去50年，當(dāng)年英國(guó)科學(xué)家isaacs和lindenmann發(fā)現(xiàn)用加熱滅活的流感病毒孵育小雞尿囊絨膜會(huì)產(chǎn)生一種物質(zhì)，它能對(duì)肝病毒的感染產(chǎn)生抵抗。1957年,proc r soc lond b biol sci刊登了他們的論文,在這篇論文中,isaacs和lindenmann將這種因子命名為干擾素(interferon)。從1980年代后期開(kāi)始,借助分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家們對(duì)干擾素的研究更加深入,各型干擾素、干擾素亞型及其功能逐漸為人們所認(rèn)識(shí),目前已經(jīng)確認(rèn)干擾素三種主要生物學(xué)作用為抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí),由于dna重組技術(shù)應(yīng)用,干

2、擾素制備技術(shù)也得到很大提高, 干擾素的研制經(jīng)歷了人白細(xì)胞干擾素、重組技術(shù)干擾素等階段。但在重組dna技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用以前，分離純化工藝的收率較低，而且有潛在病毒污染的危險(xiǎn)。1981年重組dna技術(shù)的成功,提供了一種經(jīng)濟(jì)的方法得以產(chǎn)生大量純化的重組人干擾素?！?】干擾素是一組多功能的細(xì)胞因子，根據(jù)其氨基酸結(jié)構(gòu)、抗原性和細(xì)胞來(lái)源，可將其分為三類：ifn-, ifn-和ifn-。干擾素為多基因產(chǎn)物，分為許多亞型，其中ifn-1b主要用于抗病毒治療、抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞以及免疫調(diào)節(jié)。中國(guó)生物制品規(guī)程1995年版開(kāi)始收載細(xì)胞因子類制品，分別是 “凍干精制人白細(xì)胞干擾素”，“凍干基因工程干擾素1b”, “凍干

3、基因工程干擾素2a”。 “凍干精制人白細(xì)胞干擾素”是用特定的誘生劑誘導(dǎo)健康人白細(xì)胞，經(jīng)提取后制成的凍干干擾素。由于該制品生產(chǎn)原料來(lái)源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴，并且具有血源性病毒污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，隨著基因工程干擾素的出現(xiàn)已被淘汰，中國(guó)生物制品規(guī)程2000年版不再收載該制品。從中國(guó)生物制品規(guī)程2000年版起，采用重組dna技術(shù)生產(chǎn)的干擾素1b制品命名為“重組人干擾素1b”?；蚬こ谈蓴_素1b是通過(guò)重組dna技術(shù)將人干擾素1b的編碼基因引入某種工程菌（大腸桿菌）后，高效地表達(dá)該基因產(chǎn)物，再經(jīng)分離、純化、凍干制得。重組人干擾素1b（rhifn-1b）是一種高度純化的水溶性蛋白質(zhì)，分子相對(duì)質(zhì)量約為

4、19kd，半衰期為412小時(shí)。由于干擾素在體內(nèi)半衰期短，且長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生抗體，影響藥效的發(fā)揮，目前國(guó)外已有聚乙二醇化干擾素上市，并已在我國(guó)注冊(cè)上市。聚乙二醇是一個(gè)以-ch2ch2o-為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的大分子的線性多聚體，常用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的修飾，該物質(zhì)與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合，即聚乙二醇化可以改變干擾素生物物理特性，包括分子大小、疏水性及電荷等，提高干擾素分子量，并降低免疫原性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，在臨床上能更好地發(fā)揮治療作用?！?】【3】 【制造概要】注射用重組人干擾素1b（注射用無(wú)菌粉末）系由高效表達(dá)人干擾素ifn-1b基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、菌體分離和蛋白質(zhì)純化后制成（或經(jīng)過(guò)凍干制成），含適宜穩(wěn)

5、定劑，不含防腐劑和抗生素?！?】1工程菌菌種1.1 工程菌菌種名稱及來(lái)源【5】以微生物為操作對(duì)象，將目的基因?qū)胨拗骶?，是生產(chǎn)重組人干擾素1b的基礎(chǔ)。工程菌的構(gòu)建包括目的基因克隆、表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化與篩選等階段，其間涉及了pcr、dna文庫(kù)、化學(xué)合成、酶切、連接外源基因、基因?qū)肱c微生物培養(yǎng)等技術(shù)。宿主菌和載體的名稱是工程菌的基本信息。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)的特點(diǎn)；但是，不能用于加工修飾（糖基化、酰胺化）蛋白質(zhì)的表達(dá)；細(xì)胞死亡后，易形成內(nèi)毒素；n末端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反應(yīng)；一般以包涵體的形式表達(dá)目的基因。在藥品標(biāo)準(zhǔn)中注明工程菌

6、的種類以及載體是十分必要的。1.2 種子批建立及保存重組人干擾素1b的生產(chǎn)采用三級(jí)種子庫(kù)的形式，包括：原始種子批、主種子批和工作種子批，應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定和要求。原始種子批建立后，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增傳代而建立主細(xì)胞批，然后再傳代建立工作種子批。三級(jí)種子批之間的傳代代次、保存方式應(yīng)相對(duì)固定，以保證制品的穩(wěn)定性和均一性。生產(chǎn)單位將種子批以一定濃度的甘油保存于甘油管中，并置于液氮罐中保存；或者將菌種加入保護(hù)劑凍干后置于-80冰箱中保存。1.3 菌種檢定菌種的檢定包括菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性等方面。菌種特性方面的檢定包括（以大腸桿菌為例）：集落形態(tài)、革蘭氏染色特征、生化特性、

7、電鏡檢查特征、對(duì)抗生素的抗性等。生產(chǎn)能力方面的檢定包括：目的蛋白的表達(dá)量、型別等，其中，每批菌種的表達(dá)量應(yīng)均一穩(wěn)定，不應(yīng)有明顯的表達(dá)量的降低。質(zhì)粒的穩(wěn)定性以質(zhì)粒的酶切圖譜作為依據(jù)。為加強(qiáng)對(duì)菌種的控制，中國(guó)藥典2010年版三部增加了目的基因核苷酸序列檢查。由于基因重組產(chǎn)品的目的基因是通過(guò)基因工程技術(shù)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的，在多次傳代或長(zhǎng)期保存過(guò)程中，有可能導(dǎo)致目的基因中個(gè)別核苷酸的突變，當(dāng)突變發(fā)生在目的蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)時(shí)，有可能導(dǎo)致目的蛋白的性質(zhì)發(fā)生變化。因此，增加這項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目，從基因水平確保了目的蛋白的準(zhǔn)確性。2 原液原液的制備是生產(chǎn)工藝中最為重要的技術(shù)步驟，包括發(fā)酵、純化等工藝過(guò)程。2.1 種子液制

8、備將工作種子批菌種復(fù)蘇、擴(kuò)增至一定數(shù)量制備種子液，用于發(fā)酵罐培養(yǎng)。2.2 發(fā)酵用培養(yǎng)基培養(yǎng)基的控制是發(fā)酵工藝的基本要素。培養(yǎng)基的成分包括：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、選擇劑、誘導(dǎo)物等。大腸桿菌以蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源和氮源；為了維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性，根據(jù)質(zhì)粒上的選擇性標(biāo)記基因，在發(fā)酵初期的種子液制備過(guò)程中可添加選擇劑。大腸桿菌以卡那霉素、氨芐青霉素等抗生素作為選擇劑。在工程菌生長(zhǎng)到一定階段，可通過(guò)添加誘導(dǎo)物或改變培養(yǎng)溫度，以解除目的基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物，一般在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期或稍后階段進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。以lac啟動(dòng)子為表達(dá)系統(tǒng)的工程菌用異丙基-d-硫代半乳

9、糖苷（iptg）作誘導(dǎo)劑。本版藥典對(duì)殘留的iptg誘導(dǎo)劑還沒(méi)有靈敏的檢測(cè)方法，在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制iptg的使用量。為了避免微生物對(duì)菌種的污染，制備種子液的培養(yǎng)基可以加適量抗生素。在干擾素工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，種子液所占體積較小，加入發(fā)酵液后，因高倍數(shù)的稀釋作用，使抗生素的水平大大降低，再經(jīng)過(guò)后續(xù)的純化過(guò)程，抗生素的含量降低到可忽略的程度，但是在生產(chǎn)用培養(yǎng)基中禁止加入抗生素，以控制終產(chǎn)品中殘留抗生素的含量。2.3種子液接種和發(fā)酵培養(yǎng)溫度、ph、溶解氧、補(bǔ)料、罐壓、通氣量、發(fā)酵時(shí)間是發(fā)酵工藝及工藝控制的重要元素，生產(chǎn)單位應(yīng)嚴(yán)格按照批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行。不同工程菌對(duì)溫度的要求不同：大腸桿菌生長(zhǎng)最適溫度

10、為37，最高溫度為45。為了達(dá)到不同的目的，在工程菌的不同生長(zhǎng)階段，發(fā)酵工藝設(shè)置的溫度也不同。發(fā)酵過(guò)程中ph值的調(diào)節(jié)應(yīng)兼顧工程菌生產(chǎn)狀況和表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。研究發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)階段適宜的ph值后，需要進(jìn)一步分階段控制ph，設(shè)法使其在合適的范圍內(nèi)，達(dá)到最佳生產(chǎn)水平。大腸桿菌為需氧微生物，生長(zhǎng)過(guò)程需要大量氧，且溶氧量對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性也有一定的影響，可以通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對(duì)其進(jìn)行控制。為了加強(qiáng)對(duì)制品穩(wěn)定性的控制，在2005年版藥典中，增加了對(duì)發(fā)酵液中菌體質(zhì)粒丟失率檢查的項(xiàng)目。在實(shí)際檢測(cè)中，取一定量的發(fā)酵菌體，經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后涂布在不含抗生素的培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)成后，挑取100個(gè)或以上菌落，分別接種到含

11、抗生素和不含抗生素的培養(yǎng)皿中，比較二者差別，計(jì)算質(zhì)粒丟失率。質(zhì)粒丟失率超出規(guī)定的范圍的，表明菌種的穩(wěn)定性較差，亦會(huì)影響目的蛋白的表達(dá)量。在發(fā)酵生產(chǎn)中,應(yīng)注重發(fā)酵工藝的優(yōu)化，可采用多種方法的結(jié)合。如增加誘導(dǎo)表達(dá)前菌體的總量、適當(dāng)提高溶氧量、延長(zhǎng)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間等方法均是優(yōu)化發(fā)酵工藝的常規(guī)手段。2.4 發(fā)酵液處理發(fā)酵工藝結(jié)束后，采用高速連續(xù)離心機(jī)離心收集菌體，如果目的蛋白在胞內(nèi)表達(dá)，離心后的上清液經(jīng)滅菌后棄去。菌體的破碎主要采用超聲破碎、高壓均質(zhì)破碎等方法。菌體破碎的效果與收獲的目的蛋白量成正相關(guān)。2.5初步純化初步純化工藝主要對(duì)目的蛋白的初步捕獲，一般采用離心、透析、鹽析、層析、超濾等技術(shù)。在干擾素

12、1b的生產(chǎn)過(guò)程中，采用包涵體形式表達(dá)目的蛋白，則收獲菌體后，需要進(jìn)行破菌（超聲波或高壓勻漿法破菌）、離心后得到粗制包涵體，再將包涵體溶解在鹽酸胍-二硫蘇糖醇溶液中，即為干擾素的粗提物。采用可溶性蛋白形式表達(dá)目的蛋白，則收集的菌體經(jīng)裂解、收集上清、鹽析、收集沉淀物、溶解沉淀物、脫鹽等步驟制得干擾素的粗提物。干擾素粗體物經(jīng)進(jìn)一步復(fù)性、透析等步驟，即為復(fù)性好的干擾素原液，進(jìn)入高度純化工藝。收集的菌體經(jīng)裂解、收集上清、鹽析、收集沉淀物、溶解沉淀物、脫鹽等步驟得到干擾素的粗提物?！?】2.6 高度純化重組蛋白在菌體中與許多不同的蛋白質(zhì)、核酸及多糖以復(fù)雜的混合物形式存在，因此蛋白質(zhì)的分離和純化工藝的選擇非

13、常重要，不同生產(chǎn)單位應(yīng)根據(jù)自身產(chǎn)品的理化和生物學(xué)特點(diǎn)，選擇不同的層析技術(shù)來(lái)分離目的蛋白。高度純化工藝一般是采用各種色譜技術(shù)，包括凝膠過(guò)濾層析、離子交換（deae）層析、疏水層析、親和層析及分子篩柱(s100)層析等。經(jīng)過(guò)初步、高度純化后得到的原液加入適宜穩(wěn)定劑（人血白蛋白），即為干擾素原液。在制品中加入人血白蛋白作為穩(wěn)定劑是許多基因重組產(chǎn)品的通常做法，這是由于高分子化合物的優(yōu)先吸附作用，可對(duì)重組蛋白的生物活性起保護(hù)作用。但是，同時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮人血白蛋白本身可能帶來(lái)的潛在病毒污染風(fēng)險(xiǎn)，以及加入的白蛋白與目的蛋白形成結(jié)合物，影響成品中目的蛋白含量的測(cè)定，導(dǎo)致難以對(duì)產(chǎn)品的比活性進(jìn)行評(píng)價(jià)的不足，因此，以非

14、人血白蛋白作為穩(wěn)定劑是該制品發(fā)展的方向。 3 半成品將檢定合格的加穩(wěn)定劑的干擾素原液，用稀釋液稀釋至所需濃度，用0.22m的膜除菌過(guò)濾后即為半成品。半成品配制一般采用注射用水或0.9%氯化鈉溶液為溶劑，以白蛋白作為支架及穩(wěn)定劑。4 成品半成品經(jīng)過(guò)分裝、凍干、包裝等工藝后，即得成品。由于不同保護(hù)劑的作用原理不盡相同，例如：糖、多元醇等通過(guò)影響水分子構(gòu)象而加強(qiáng)與蛋白質(zhì)的疏水相互作用,以抵抗熱變性,使溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象得以穩(wěn)定；多羥基化合物是常用的冷凍保護(hù)劑,可以減輕低溫對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞作用，因此，應(yīng)根據(jù)各種可能的影響因素，如制品的成分、加入穩(wěn)定劑的種類和配比量、性質(zhì)、濃度、裝量以及升華面積和共熔

15、點(diǎn)、熱傳導(dǎo)的介質(zhì)和方式、凝結(jié)器溫度、冷凝器面積和制冷能力、系統(tǒng)真空度和設(shè)備性能等，確定最佳凍干曲線。7,8，9 【檢定概要】原液檢定重組蛋白制品的檢定著重于對(duì)分子結(jié)構(gòu)的確認(rèn)，主要包括鑒別、分子量、等電點(diǎn)、特征光譜、肽圖、n端氨基酸序列等項(xiàng)，此外，還包括生物學(xué)活性、蛋白質(zhì)含量、純度檢測(cè)等內(nèi)容。1生物學(xué)活性干擾素的活性測(cè)定采用的是細(xì)胞病變抑制法。依據(jù)干擾素可以保護(hù)人羊膜細(xì)胞（wish）免受水泡性口炎病毒（vsv）破壞的作用，用結(jié)晶紫對(duì)存活的wish細(xì)胞染色，在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定其吸光度，可得到干擾素對(duì)wish細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)曲線，以此測(cè)定干擾素生物學(xué)活性。在生物學(xué)活性測(cè)定過(guò)程中，wish細(xì)胞的生長(zhǎng)

16、狀態(tài)、vsv病毒的毒力、攻毒后的培養(yǎng)環(huán)境以及染色反應(yīng)的溫度和時(shí)間均可對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此，應(yīng)對(duì)各種檢測(cè)條件進(jìn)行控制，盡可能減少對(duì)試驗(yàn)的影響。中國(guó)生物制品規(guī)程1995版系采用顯微鏡下肉眼觀察細(xì)胞病變并計(jì)數(shù)的方法判定結(jié)果；自中國(guó)生物制品規(guī)程2000版起，修訂為采用細(xì)胞染色法測(cè)定吸光度，使結(jié)果判定更加客觀、準(zhǔn)確。在生物活性測(cè)定中，歐洲藥典采用的受試細(xì)胞和攻擊病毒與中國(guó)藥典不同，采用人喉癌細(xì)胞株（hep2c）和腦心肌炎病毒（emcv）。2純度（1）電泳法采用非還原型sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法。檢測(cè)時(shí)除了注意分離膠的濃度、加樣量等因素，還應(yīng)使制備供試品的方法、電泳膠的厚度、樣品池的體積、電壓或電流

17、等實(shí)驗(yàn)條件保持一致。（2）hplc法本版藥典采用的是分子篩層析法對(duì)制品的純度進(jìn)行分析，該方法的原理是基于分子大小的差異對(duì)不同蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。建議逐步開(kāi)展采用反相高效液相法測(cè)定純度的研究工作；采用兩種不同原理的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以互相補(bǔ)充，可以更準(zhǔn)確的測(cè)定制品的純度。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)包括理論塔板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等。3外源dna殘留量從2000年版中國(guó)生物制品規(guī)程收載了dna探針雜交法，2010年版藥典三部新增了熒光染色法。dna探針雜交法是較為經(jīng)典的方法，但是操作較為復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)；熒光染色法操作簡(jiǎn)便快捷，準(zhǔn)確靈敏。應(yīng)根據(jù)品種特性及限度要求等具體情況，選擇適宜方法。4宿主菌蛋白質(zhì)殘留

18、量采用elisa法對(duì)宿主菌蛋白質(zhì)殘留量進(jìn)行測(cè)定。5殘余抗生素活性采用培養(yǎng)法。該方法的靈敏度較低，耗時(shí)長(zhǎng)。以相應(yīng)抗生素的單克隆抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法檢測(cè)殘余抗生素活性已得到廣泛應(yīng)用，該法更為方便、準(zhǔn)確和靈敏。6、分子量、等電點(diǎn)、紫外光譜、肽圖、n端氨基酸序列以上檢測(cè)是對(duì)重組蛋白分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)的重要指標(biāo)。分子量采用還原型sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定制品的分子量。以-巰基乙醇（或二硫蘇糖醇）作為還原劑處理供試品，使其二硫鍵斷裂。在分子相對(duì)質(zhì)量為15kd-200kd范圍內(nèi)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。等電點(diǎn)等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)所屬的特殊性質(zhì)。當(dāng)氨基酸的各種帶電離子所帶正電荷數(shù)與負(fù)電荷數(shù)相等

19、時(shí)，此時(shí)溶液的ph就是這種氨基酸的等電點(diǎn)。從理論上講，一種蛋白質(zhì)只有一個(gè)等電點(diǎn)，但等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果受實(shí)驗(yàn)方法和條件（溶劑性質(zhì)、離子強(qiáng)度等）影響較大。等電點(diǎn)應(yīng)為4.0-6.5。紫外光譜200-400nm范圍稱為近紫外區(qū)，許多化合物在這一區(qū)域產(chǎn)生特征吸收。紫外光譜是指分子中的某些價(jià)電子吸引一定波長(zhǎng)的紫外光，由低能級(jí)躍遷到高能級(jí)而產(chǎn)生的吸收光譜。在波長(zhǎng)為230-360nm下進(jìn)行掃描，干擾素1b的最大吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)為275-281nm。肽圖通過(guò)蛋白酶（胰蛋白酶）或化學(xué)物質(zhì)（溴化氰）裂解蛋白質(zhì)后，采用高效液相法對(duì)其進(jìn)行分離，將得到的供試品圖譜與對(duì)照品圖譜進(jìn)行比較，分析鑒定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。自2

20、010年版藥典起，原液肽圖檢查由每半年檢測(cè)一次修訂為每批進(jìn)行檢查，以控制產(chǎn)品批間穩(wěn)定性。n端氨基酸序列分析氨基酸序列測(cè)定是通過(guò)控制蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，保證蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。歷版藥典采用氨基酸序列分析儀測(cè)定法，對(duì)n端的15個(gè)氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定。從2010年版藥典起要求對(duì)n端的16個(gè)氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定。由于aug不僅是原核細(xì)胞表達(dá)載體的起始密碼子，還編碼甲硫氨酸，因此干擾素1bn端的起始氨基酸為甲硫氨酸。但是，有些采用可溶性蛋白表達(dá)的干擾素1b 的n端甲硫氨酸隨前導(dǎo)肽的切除而被切除。歐洲藥典收載的同類產(chǎn)品（如ifn-2a、ifn-1b）原液檢測(cè)項(xiàng)目與中國(guó)藥典的差別主要在相關(guān)蛋白檢測(cè)及雜質(zhì)分析等

21、方面。歐洲藥典采用還原、非還原電泳法測(cè)定雜質(zhì)成分；采用高效液相色譜法對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行分析【10】。三種檢測(cè)方法側(cè)重點(diǎn)有所不同，還原電泳主要測(cè)定目的蛋白的含量及分子量，非還原電泳主要測(cè)定蛋白聚體及雜蛋白的含量，高效液相色譜法除能測(cè)定雜蛋白含量外，還可測(cè)出目的蛋白的異構(gòu)體，同時(shí)對(duì)非蛋白類雜質(zhì)也可有效檢出。因此這三種方法聯(lián)合使用，可對(duì)制品的純度進(jìn)行有效控制。半成品檢定包括細(xì)菌內(nèi)毒素含量、無(wú)菌檢查、生物學(xué)活性檢測(cè)等項(xiàng)目。成品檢定包括鑒別試驗(yàn)、外觀、可見(jiàn)異物、裝量、ph值、滲透壓摩爾濃度、生物學(xué)活性測(cè)定、殘余抗生素活性、無(wú)菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、異常毒性檢查等項(xiàng)目。中國(guó)藥典2010年版的鑒別試驗(yàn)收載了免疫印跡、免疫斑點(diǎn)兩種方法。其原理均采用供試品與特異抗體結(jié)合后，抗體再與酶標(biāo)抗體特異性結(jié)合，通過(guò)酶學(xué)反應(yīng)的顯色，對(duì)供試品的抗原特異性進(jìn)行檢查。免疫印跡法與免疫斑點(diǎn)法相比，增加了電泳技術(shù)，可以對(duì)供試品起到濃縮和分離的作用。在免疫印跡法檢