前列腺免疫組化

1、材料和方法實(shí)驗(yàn)材料(一) 研究對(duì)象收集前列腺癌標(biāo)本。選取同時(shí)期前列腺增生標(biāo)本，標(biāo)本均經(jīng)病理科專家確 診，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或激素治療，且各組年齡間無顯著性差 異。(二) 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑1、主要實(shí)驗(yàn)儀器電熱恒溫水浴箱微波爐微量進(jìn)樣器冰箱電磁爐電光分析天平切片機(jī)光學(xué)XX及XX系統(tǒng)2、主要試劑(1) HIF-la鼠抗人單克隆抗體，購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(2) SP超敏試劑盒，購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(3) DAB酶底物顯色劑試劑盒，購(gòu)于上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司二、實(shí)驗(yàn)方法及步驟本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶連接 (streptavidin peroxi

2、dase, SP法，即S-P法。在一位經(jīng)驗(yàn)豐富實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的指導(dǎo)下進(jìn)行。具 體實(shí)驗(yàn)過程及操作方法如下 :(一)免疫組化切片制備將干凈載玻片浸入硫酸重鉻酸鉀混合液中過夜，自來水沖洗后用蒸餾水反 復(fù)清洗三遍，烘干 ;置 50%的乙醇中過夜，再次用蒸餾水清洗三遍，烘干 ;將烘干 玻片在 1:50 的明膠海綿中浸蘸，烘干后備用。將石蠟包埋的組織標(biāo)本連續(xù)定向切片三張，厚度 4gm, 1張HE染色，2張?zhí)?理后用于免疫組化染色，附于處理的載玻片中央，于60C烘箱處理后備用。(二)免疫組化SPxx染色步驟常規(guī)SP法染色檢測(cè)HIF-la按試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行：(1) 梯度酒精常規(guī)脫蠟水化(2) PBS沖中

3、洗 5min,共 3 次(3) 微波處理修復(fù)抗原 ：將切片放入有構(gòu)椽酸緩中液容器中,置微波爐中加熱,溫度保持92-98C,水開沸騰 10分鐘,自然冷卻至室溫 ;(4) 每張切片加一滴或 50u1 過氧化氫阻斷溶液,以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活 性,室溫孵育 10 分鐘 ;(5) PBS沖中洗 5min,共 3 次；(6) 每張切片加一滴或 50u1 非免疫性動(dòng)物血清,室溫孵育 10分鐘;(7) 每張切片加一滴或 50u1 的鼠抗人 HIF-1 a；(8) 4 C冰箱孵育，次日復(fù)溫一小時(shí)；(9) PBS沖中洗 5min,共 3 次；(10) 每張切片加一滴或 50u1 生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育 3

4、0min;(11) PBS沖中洗 5min,共 3 次；(12) 每張切片加一滴或 50u1 鏈霉素抗生物素一過氧化酶溶液，室溫孵育 30min；(13) PBS沖中洗 5min,共 3 次；(14) 每張切片加2滴或1 OOul新鮮配置的DAB溶液，室溫下避光顯色3-1 Omi n,顯微鏡下控制發(fā)應(yīng)時(shí)間，流水沖洗，終止反應(yīng)；(15) 蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化,自來水中洗藍(lán)化 ；(16) 梯度酒精常規(guī)脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。(三) 對(duì)照觀察(1)陰性對(duì)照 :以PBS代替一抗作空白對(duì)照。(2)陽(yáng)性對(duì)照:己知肝癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照。(四) 結(jié)果判定HIF-la陽(yáng)性染色主要表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒；先按染色強(qiáng)度打分:無色 0 分,淺黃色 1 分,棕黃色 2 分,棕褐色 3 分；再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分 比打分:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 76%為 4 分。每張切片以陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色程度兩項(xiàng)得分乘積作為最 后得分:0-1分為陰性一” ,2-3分為弱陽(yáng)性“+,45分為中等陽(yáng)性“ +,(分以上為 強(qiáng)陽(yáng)性“+ +”