甘草甜素類藥對(duì)化學(xué)損傷人肝細(xì)胞的保護(hù)作用比較

1、甘草甜素類藥對(duì)化學(xué)損傷人肝細(xì)胞的保護(hù)作用比較重慶醫(yī)科大學(xué)2009年第34卷第11期(journalofchongqingmedicaluniversity2009.vo1.34no.11)一1491一文章編號(hào):02533626(2009)11-149104甘草甜素類藥對(duì)化學(xué)損傷人肝細(xì)胞的保護(hù)作用比較張群,張麗峰2,陳鵬3,孫華麗s,張建軍(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院感染病科,南京210009;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院血管外科,成都610072;3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染病科,瀘州646000)【摘要】目的:研究4種(3類)甘草甜素藥物對(duì)半乳糖胺(dgain)和四氯化碳(cc1)損傷培養(yǎng)人肝細(xì)胞

2、(l一02)的保護(hù)作用及差異,篩選出療效好的藥物,指導(dǎo)臨床應(yīng)用.方法:培養(yǎng)l一02,用復(fù)方甘草酸單銨(compoundammoniumglycyrrhizin,cag),復(fù)方甘草酸苷(compoundglyeyrrhizin,cg),甘草酸二銨(diammoniumglycyrrihizinate,dg)和異甘草酸鎂(magnesiumisoglycyrrhizinate,mi)分別進(jìn)行保護(hù),再經(jīng)dgain或cc14處理.觀察肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),測(cè)定ast及l(fā)dh酶活力,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(gsh)含量.從而評(píng)價(jià)cag,cg,dg和mi對(duì)dgaln和cch損傷l一02細(xì)胞的保護(hù)作用.結(jié)果:濃度為1

3、mg/ml時(shí),cag,cg,dg和mi均能顯著抑制dgain和cc1所致的ast及l(fā)dh釋放,提高細(xì)胞的存活率.其中cag抑制dgain所致的ast效果顯著優(yōu)于cg,dg和mi(p<0.05);cag抑制cc14所致的ast及l(fā)dh釋放的效果顯著好于dg和mi;cg抑制dgain所致的ast和ldh釋放效果顯著(尸<0.05)好于mi.濃度為1mg/ml的cag,cg,dg和mi4種藥物均能顯著抑制2種化學(xué)損傷細(xì)胞內(nèi)的gsh降低,其中cag效果最明顯(p<0.05).結(jié)論:1mg/ml的cag,cg,dg和mi4種藥物對(duì)dgain和cch致人肝細(xì)胞損傷均有保護(hù)作用,其機(jī)制可能

4、與抑制gsh降低相關(guān).4種甘草甜素藥物,cag保護(hù)肝細(xì)胞效果最為顯著,cg,dg和mi作用依次減低.【關(guān)鍵詞】半乳糖胺;四氯化碳;甘草甜素;肝細(xì)胞;藥物作用【中國(guó)圖書分類法分類號(hào)】r965.1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【收稿日期】20090818comparisonofprotectiveeffectofglycyrrhizindrugsonhumanhepatocytesinjuredbyd-galactosamineandcarbontetrachloridezhangoun,etal(departmentofinfectiousdiseases,feaffiliatedzhongdahospita

5、l,southeastuniversity)【abstractojective:toinvestigatetheeffectsandthedifferencesofthefour(3categories)glycyrrhizindrugsinprotectinghumanhepatocytes(l-02)fromtheinjuryofgalactosamine(dgain)andcarbontetrachloride(ccl),andtoscreenabetteroneforclinicalapplication.methods:theculturedl-02werepre-treatedwi

6、thcompoundammoniumglycyrrhizin(cag),compoundglyeyrrhizin(cg),diammoniumglyeyrrihizinate(dg)andmagnesiumisoglycyrrhizinate(mi),respectively,forprotectingthesecellsfromtheinjurymadewithcci4ord-gain.then,thelivercellgrowthstatuswereobserved,andtheastandldhenzymeactivityintheculturalsupernatantweredeter

7、mined,andcellularglutathione(gsh)contentintheculturalsupernatantweretested.allthevaluesabovewereanalyzedtocomparetheprotectiveeffectsofthefourglycyrrhizindrugs.results:attheconcentrationoflmg/ml,thefourglycyrrhizindrugscouldimprovethesurvivalrateofcells,andsignificantlyinhibitreleaseofastandldhinduc

8、edbyd-gainorcch.moreover,theinhibitioneffectofcagonastreleaseinducedbydgainwassignificantly(p<0.05)betterthanthatofcg,dgandmi,andtheinhibitioneffectsofcagonastandldhreleaseinducedbycchweresignificantly(p<0.05)betterthanthoseofcg,dgandmi.theinhibitioneffectsofcgonastandldhreleaseinducedbyd-gain

9、weresignificantly(p<0.05)betterthanthatofmi.attheconcentrationof1mg/ml,thefourglyeyrrhizindrugscouldincreasethedecreasedcellmitochondrialmembranepotentialcausedbydgainorcch.thesefourglycyrrhizindrugscouldsignificantlyinhibittheintracellulargshabatementinducedbyd-gainorcc14.ofwhich,caghadthemostsi

10、gnificanteffect(p<0.05),andcgwasbetterthanmi(p<0.05).conclusions:attheconcentrationof1mg/m1.thefourglyeyrrhizindrugshaveprotectiveeffectsonthedgainorcchinjuredhumanhepatocytes.themechanismoftheseprotectiveeffectsmaybeincreasingoftheintracellulargshabatement.amongthefourglycyrrhizindrugs,caghas

11、themostsignificanteffectforhepatocytes,andtheeffectswerereducedintheorderofcg.dg.andmi.作者介紹:張群(1976一),女,碩士,研究方向:感染病學(xué).通訊作者:張建軍,男,教授,email:zhangjianjun2535163.corn.【keywords】galactosamine;carbontetrachloride;glycyrrhizin;hepatocyte;drugeffects一1492一重慶醫(yī)科大學(xué)2009年第34卷第l1期(journalofchongqingmedicaluniversi

12、ty2009.vo1.34no.11)甘草甜素類藥物是目前臨床常用的保肝藥.其具有抗炎,抗氧化,抗肝臟毒物,穩(wěn)定細(xì)胞膜,抗肝纖維化,調(diào)節(jié)免疫,抑制ca內(nèi)流,防止細(xì)胞凋亡以及增加內(nèi)源性類固醇產(chǎn)生等多種功效,是其肝細(xì)胞保護(hù)作用的重要機(jī)制【1-4.目前臨床使用于護(hù)肝的甘草甜素類藥物種類和制劑有多種,但缺乏相同條件下效果的比較研究.本研究以體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞(l一02)作為護(hù)肝藥物研究體系,比較不同甘草甜素類藥物對(duì)半乳糖胺(dgain)或四氯化碳(cci)損傷人肝細(xì)胞(l一02)的保護(hù)作用之間差別.1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器l一02株購(gòu)自川i大華西醫(yī)院;cag為赤峰蒙欣藥業(yè)公司產(chǎn)品,cg購(gòu)自日本米

13、諾發(fā)源制藥株式會(huì)社,dg,mi為正大天晴公司產(chǎn)品;胎牛血清和rpmi一1640培養(yǎng)基為hyclone產(chǎn)品,dgain為biobasicinc產(chǎn)品,cci為重慶博藝化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;全自動(dòng)生化儀(et立7600),酶標(biāo)儀(biotekelx800),熒光分光光度計(jì)(leicawetzar).1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1甘草甜素藥物的配制和處理參照甘草甜素研究文獻(xiàn)51,藥物濃度在1mg/ml至10mg/ml護(hù)肝效果最佳.本研究取4種甘草甜素藥物原液和胎牛血清,按9:1的劑量加入細(xì)胞上清中,使甘草甜素藥的終濃度分別為0.01,0.1,1mg/ml3組,用于構(gòu)建肝細(xì)胞保護(hù)體系.不同終濃度(見上述)的cag

14、,cg,dg,mi于細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)24h后加入.1.2.2l一02細(xì)胞培養(yǎng)和dgain和cc14處理用含10%胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度為2xl0s個(gè)/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,置5%co:孵箱中培養(yǎng)24h后分別加入cag,cg,dg,mi并形成不同藥物的終濃度(見上述),再用以dgain2mmol/l濃度共培養(yǎng)24h;或cc1410mmol/l濃度共培養(yǎng)2h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè).此損傷模型條件經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定.1.2.3甘草甜素藥物護(hù)肝作用評(píng)價(jià)倒置顯微鏡觀察肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài);全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ast和ldh酶活性;參照hadley方法測(cè)定gsh含量.1-3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理此實(shí)驗(yàn)為3復(fù)孔設(shè)計(jì),所有

15、數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示.采用spss16.0forwindows中的anova對(duì)組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.14種甘草甜素藥物對(duì)dgaln損傷l一02的保護(hù)作用及差異dgaln與l一02細(xì)胞共同培養(yǎng)后,ast和ldh釋放增加.用cag,cg,dg和mi處理后,細(xì)胞貼壁率增加.呈條索狀,提示4種藥物均改善了l一02的生長(zhǎng)狀態(tài).cag,cg,dg和mi濃度在1ms/m明顯抑制ast(p<0.05)和ldh(p<0.05)釋放.且以cag效果最顯著(p<0.05).4種甘草甜素藥濃度在0.1,0.0lmg/ml時(shí)與模型組比較無(wú)明顯肝細(xì)胞保護(hù)作

16、用(見表1).表14種甘草甜素藥對(duì)dga1n損傷l一02ast和ldh釋放作用注:+與模型dgain組比較p<0.05,p<0.01與溶劑對(duì)照組比較p<0.05,p<o.01重慶醫(yī)科大學(xué)21109年第34卷第l1期(journalofchongqingmedicaluniversity2009.vo1.34no.11)一14932.24種甘草甜素藥物對(duì)cc1損傷l一02的保護(hù)作用及差異cc4與lo2共同培養(yǎng)后.細(xì)胞活性顯著降低,ast和u)h釋放增加.用cag,cg,dg和mi處理后,死亡細(xì)胞減少,細(xì)胞貼壁率增加,改善了細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),1mg/ml濃度的4種甘草甜素藥均顯

17、著降低ast(p<0.05)釋放和ldh(p<0.05)釋放,cag效果最明顯(p<0.05);而cg,dg和mi3者之間兩兩比較,無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表2).2-34種甘草甜素藥物對(duì)gsh的影響及差異濃度為1mg/ml的cag,cg,dg和mi均能顯著抑制cci和dgain所致l一02的gsh降低(p<0.05),觀察4種藥物的相互比較統(tǒng)計(jì)表及均數(shù)圖,示cag效果最明顯(p<0.05),cg次之,且護(hù)肝效果明顯好于dg和mi(p<0.05),dg與mi比較,護(hù)肝作用無(wú)顯著差異(見表3).表24種甘草甜素藥對(duì)cc1損傷l一02ast和ldh釋放作用n藥物濃度

18、(mg/m1)gshccl,dgaln注:與模型組比較p<0.05,p<o.01與溶劑對(duì)照組比較p<0.05,aap<o.01重慶醫(yī)科大學(xué)2009年第34卷第11期(journalofchongqingmedicaluniversity2009.vo1.34no.11)3討論本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了dgaln6和cci71處理l一02細(xì)胞活性,alt和ast的時(shí),量效特征.dgaln2mmol/l處理24h,cc110mmolfl處理2h對(duì)細(xì)胞活性抑制率接近5o%,aijt和ldh釋放顯著增加.以此構(gòu)建l一022種化學(xué)損傷模型,用于藥物護(hù)肝作用的研究.肝臟是物質(zhì)代謝的中心,當(dāng)肝功能

19、受損時(shí),物質(zhì)代謝過程受到障礙,很多酶就會(huì)從肝臟逸出8l.本研究結(jié)果表明,濃度為1mg/ml的cag,cg,dg,mi4種藥物均可顯著抑制兩種損傷模型ast和ldh升高,證明甘草甜素類藥物在抗氧化,抗肝臟毒性,穩(wěn)定細(xì)胞膜方面功效顯著翻,其中以cag護(hù)肝效果最為明顯.肝細(xì)胞內(nèi)gsh減少,提示肝細(xì)胞損傷伴隨氧化還原態(tài)被破壞.細(xì)胞內(nèi)恒定的gsh濃度是保持細(xì)胞穩(wěn)定氧還原電位的前提,與細(xì)胞生命活動(dòng)正常進(jìn)行密切相關(guān),氧還原電位降低將觸發(fā)細(xì)胞凋亡】01,本研究結(jié)果證明了4種藥物可改善細(xì)胞內(nèi)gsh降低,提高細(xì)胞存活率.上述4種藥物對(duì)損傷l一02保護(hù)作用,以cag最為顯著.綜上所述,4種甘草甜素藥均能顯著改善肝功

20、能,從不同層面起到肝細(xì)胞的保護(hù)作用,以cag對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)制劑最為顯著,cg,dg,mi作用依次減低.4種甘草甜素藥物差異主要為有效成分甘草酸分子結(jié)構(gòu)式的不同,以及甘氨酸,鹽酸半胱氨酸的含量不同.第二代甘草甜素藥cag和cg是以b體甘草酸單銨為主要成分,還含有甘氨酸和鹽酸半胱氨酸,第三代甘草甜素藥dg是o【體甘草酸二銨鹽,不含有甘氨酸和鹽酸半胱氨酸,第四代甘草甜素藥mi為單一18一僅異構(gòu)體,也不含有甘氨酸和鹽酸半胱氨酸.甘氨酸主要用以對(duì)抗甘草酸單銨的水鈉潴留作用,近年來(lái)研究顯示,甘氨酸具有抗炎,免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞保護(hù)等作用,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,它在缺血再灌注損傷,休克,酒精性肝炎,肝硬化,關(guān)節(jié)炎,急性壞

21、死性胰腺炎,腫瘤和藥物中毒等多種疾病中發(fā)揮有效的治療作用,目前其作用機(jī)制尚不明確,可能通過抑制鈣離子信號(hào)的傳導(dǎo),阻止炎性細(xì)胞的激活,減少氧自由基和其他毒性因子的合成,降低腫脹細(xì)胞胞膜的通透性等多種機(jī)制發(fā)揮輔助性或協(xié)同性的保護(hù)作用;鹽酸半胱氨酸具有解毒功能,參與細(xì)胞的還原過程和肝臟內(nèi)的磷脂代謝,能保護(hù)肝細(xì)胞不受損害.cag因含有甘氨酸和鹽酸半胱氨酸比例較高,可能使其較cg,dg,mi具有更好的肝細(xì)胞保護(hù)作用.至于是否因甘草酸分子結(jié)構(gòu)式不同,導(dǎo)致四種甘草甜素藥護(hù)肝作用存在差異,目前尚不能定論,需要進(jìn)一步深入研究.參考文獻(xiàn)1姜兆金,雷明君.甘草酸二銨聯(lián)合復(fù)方丹參治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床研究肝臟,2007,12(2):159160.2祖紅梅.甘草酸二銨治療抗