膽道閉鎖中T細(xì)胞ERK通路調(diào)控甲基化敏感基因IFNγ高表達(dá)的研究

1、膽道閉鎖中t細(xì)胞erk通路調(diào)控甲基化敏感基因ifn高表達(dá)的研究 復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文膽道閉鎖中t細(xì)胞erk通路調(diào)控甲基化敏感基因ifn-高表達(dá)的研究姓名:董瑞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:博士專業(yè):兒科學(xué)(外科)指導(dǎo)教師:鄭珊2012-05-07膽道團(tuán)鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因離表達(dá)的研究膽道閉鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因高表達(dá)的研究中文摘要,是新生兒膽汁淤積的常見(jiàn)病因,亦是兒童最膽道閉鎖常見(jiàn)的嚴(yán)重肝臟疾病,以肝內(nèi)和肝外膽管的進(jìn)行性炎癥和纖維性梗阻為特征,從而導(dǎo)致膽汁淤積以及進(jìn)行性的肝纖維化和肝硬化,不手術(shù)治療很少能活過(guò)歲。即使成功進(jìn)行了手術(shù)并重建膽汁流出道,仍然有%膽道閉鎖患兒在手術(shù)后因?yàn)楦骷?jí)膽管進(jìn)行

2、性梗阻及炎癥損傷,導(dǎo)致膽汁淤積和肝纖維化加重,進(jìn)展為肝功能衰竭,最終需要接受肝臟移植。肝內(nèi)膽道上皮細(xì)胞炎癥損傷、凋亡和肝纖維化、肝硬化是膽道閉鎖的主要病理改變,其發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚不明確。一般認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制涉及病毒感染、自身免疫介導(dǎo)的膽管破壞及膽道發(fā)育異常:是一種病毒介導(dǎo)的自身免疫性疾病,主要是介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)過(guò)程。同卵雙胎兒并沒(méi)有同時(shí)發(fā)展為,說(shuō)明非遺傳性因素在發(fā)病中起著重要作用。為進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制,本研究借助全基因組甲基化芯片及生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞中全基因甲基化狀態(tài)及相互關(guān)系進(jìn)行研究;然后對(duì)甲基化敏感免疫相關(guān)基因吖在膽道閉鎖中的表達(dá)情況進(jìn)行研究,并探討信號(hào)通路在膽道閉鎖中

3、的表達(dá)情況以及與甲基化異常的關(guān)系。瞧道閉鐨中細(xì)胞通路調(diào)控串基化敏感基函離表達(dá)的研究第一部分膽道閉鎖患周血單個(gè)核細(xì)胞全基因組甲基化狀態(tài)目的利用全基因組甲基化芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法對(duì)膽道閉鎖患周血單個(gè)核細(xì)胞的全基因組甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究,以進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制。方法采集膽道閉鎖患兒和正常健康兒外周靜脈血,淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞,提取,經(jīng)甲基化修飾試劑盒處理后,采用人類全基因組甲基化芯片對(duì)全基因組中大于的島或位點(diǎn)進(jìn)行差異甲基化分析。每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩個(gè)探針:甲基化和去甲基化探針。對(duì)所得差異基因甲基化位點(diǎn)進(jìn)行校正方法及差異分析。結(jié)果在膽道閉鎖患兒的中共篩選出個(gè)差異甲基化位點(diǎn),其中個(gè)發(fā)生低甲基化,

4、個(gè)發(fā)生高甲基化,分別代表和個(gè)基因,差異均有顯著性意義.。根據(jù)基因的功能不同,再進(jìn)一步增加限定條件后,篩選出免疫相關(guān)基因的差異甲基化位點(diǎn)個(gè),其中低甲基化位點(diǎn)個(gè),高甲基化位點(diǎn)個(gè),分別代表和個(gè)基因,差異均有顯著性意義.。而在膽道閉鎖免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用的甲基化敏感基因干擾素吖亦具有明顯的低甲基化趨勢(shì)。結(jié)論膽道閉鎖患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞全基因中低甲基化的位點(diǎn)占據(jù)明顯優(yōu)勢(shì),免疫相關(guān)基因的低甲基化位點(diǎn)明顯增多,其中甲基化敏感免疫相關(guān)基因吖處于低甲基化狀態(tài)。本部分研究為膽道閉鎖發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的切入點(diǎn)。關(guān)鍵詞膽道閉鎖;全基因組甲基化芯片;甲基化;吖膽道閉鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因.高表達(dá)的研究第二

5、部分膽道閉鎖患兒外周血淋巴細(xì)胞的整體甲基化狀態(tài)及甲基化敏感基因的表達(dá)研究目的研究膽道閉鎖患周血淋巴細(xì)胞的整體甲基化狀態(tài)和干擾素吖.基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài),并觀察吖基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。方法選取例膽道閉鎖及例健康對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比研究;提取外周血淋巴細(xì)胞的和;采用通用甲基化定量試劑盒檢測(cè)整體甲基化胞嘧啶表達(dá)水平;實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng). 檢測(cè)甲基化轉(zhuǎn)移酶、甲基化結(jié)合蛋白和的表達(dá)水平。亞硫酸氫鈉.測(cè)序法檢測(cè)吖啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。結(jié)果膽道閉鎖組淋巴細(xì)胞中的整體平均甲基化水平明顯低于對(duì)照組.。與對(duì)照組相比,膽道閉鎖組細(xì)胞中和在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯降低值分別為.和.。膽道閉鎖組細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯低于

6、對(duì)照組.,而轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯升高矽.;、和在膽道閉鎖組與對(duì)照組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膽道閉鎖組細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)與整體甲基化水平呈正性相關(guān),.,.。與對(duì)照組相比,吖在膽道閉鎖組細(xì)胞中表達(dá)明顯升高.,其啟動(dòng)子區(qū)域處于低甲基化狀態(tài),并與整體甲基化水平呈負(fù)性相關(guān).,.。結(jié)論膽道閉鎖患周血細(xì)胞中整體平均甲基化水平低下:在膽道閉鎖細(xì)胞中,吖基因啟動(dòng)子區(qū)域亦處于低甲基化狀態(tài),與整體甲基化水平呈負(fù)性相關(guān),該現(xiàn)象可能與膽道閉鎖發(fā)病有一定關(guān)系。關(guān)鍵詞膽道閉鎖;淋巴細(xì)胞;甲基化;叫疆道閉鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因.高表達(dá)的研究第三部分膽道閉鎖患兒外周血淋巴細(xì)胞信號(hào)通路的狀態(tài)及與甲基化轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系目的研究膽道閉

7、鎖患兒外周血淋巴細(xì)胞中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路的狀態(tài),探討其與甲基化轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系;并在體外細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。方法選取例膽道閉鎖患兒及例健康對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比研究;提取外周血淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì),采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù).檢測(cè)信號(hào)通路關(guān)鍵分子/及其磷酸化水平./,并檢測(cè)的表達(dá)情況;用的 處理細(xì)胞,提取蛋白質(zhì),.檢測(cè)處理前后/、/的蛋白水平以及的表達(dá)情況。結(jié)果與對(duì)照組相比較,膽道閉鎖中/和/蛋白表達(dá)水平均明顯下降,的蛋白表達(dá)水平亦明顯下降值均小于.。相對(duì)于未處理組,處理的細(xì)胞中/、/蛋白表達(dá)水均明顯下降,的蛋白表達(dá)水平亦明顯下降值均小于.。結(jié)論膽道閉鎖中信號(hào)通路關(guān)鍵分子/和/蛋白表達(dá)水平下降可能是導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平

8、下降的原因,并可能使膽道閉鎖患兒外周血淋巴細(xì)胞基因組發(fā)生整體低甲基化。關(guān)鍵詞膽道閉鎖;信號(hào)通路;甲基化轉(zhuǎn)移酶;細(xì)胞中圖分類號(hào)膽道閉鎖中糊通路調(diào)控甲基化敏感基因.高表達(dá)的研究 ., ,. ./,? .、,. , .、析 . , . 疆道閉錟中細(xì)跑通路調(diào)控甲基純敏感基因高表達(dá)的研究 . ,?謝. . . , :. ., , . . .:, ,.,”. , .,“”. ., , ? 一丫.; ;疆遒閉鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因.高表達(dá)韻研究 . .,麗. .,吖. .,.,. , . .,.,.,.吖 吖., ., ,吖,瞻道閉錟中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因高表達(dá)的研究, , ,. . . ,

9、. .,/,., , . / /, ?. /,?晰謝 ., / /, ./,. ? . ; ; ;疆道閉鎖中細(xì)咆通路調(diào)控甲基化敏感基因離表達(dá)的研究英文縮寫(xiě)索引堿性磷酸酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶 過(guò)硫酸銨丙烯酰胺谷草轉(zhuǎn)氨酶膽道閉鎖 直接膽紅素二甲基亞砜甲基轉(zhuǎn)移酶溴化乙錠乙二胺四乙酸 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶? 胎牛血清,一谷酰轉(zhuǎn)肽酶 干擾素吖吖甲又雙丙烯酞胺甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域 甲基化結(jié)合蛋白 光密度值 磷酸鈉鹽緩沖液植物血凝素聚偏氟乙烯 十二烷基磺酸鈉 總膽紅素 翻 .硼酸四甲基二乙胺阻道閉鎖中綴瞻通路調(diào)控甲基化敏惑基因離表達(dá)的研究前言,是新生兒阻塞性黃疸最常見(jiàn)的病因,亦是兒膽道閉鎖童最常見(jiàn)的嚴(yán)重肝臟疾病,以肝內(nèi)和肝

10、外膽管的進(jìn)行性炎癥和纖維性梗阻為特征,從而導(dǎo)致膽汁淤積以及進(jìn)行性的肝纖維化和肝硬化,不手術(shù)治療很少能活過(guò)歲【】。手術(shù)雖明顯改善預(yù)后,但多數(shù)仍需肝移植才能長(zhǎng)期存活。膽道閉鎖在我國(guó)更是明顯高發(fā),危害巨大,占兒童期肝移植總數(shù)的.%】。絕大多數(shù)的膽道閉鎖療效欠佳,費(fèi)用花費(fèi)巨大,不少家長(zhǎng)最終放棄治療,對(duì)家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)和傷害。因此,明確膽道閉鎖的發(fā)病機(jī)制,尋找積極有效的治療手段至關(guān)重要。膽道閉鎖病因目前尚未明確,可能與以下幾方面有關(guān):遺傳、免疫系統(tǒng)異常、病毒感染、母體接觸毒物等【。近年有關(guān)膽道閉鎖的病因研究進(jìn)一步表明該病是一類病毒誘導(dǎo)的自身免疫性疾病。病毒感染能特異性破壞膽管上皮細(xì)胞,引起細(xì)胞壞

11、死和凋亡,即使病毒被清除,膽管上皮細(xì)胞炎癥和損傷仍持續(xù)存在。受損的膽管上皮細(xì)胞可能將原來(lái)隱匿的自身抗原當(dāng)成外來(lái)抗原呈遞,誘發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)直接攻擊膽管上皮細(xì)胞造成進(jìn)一步損傷【川。其中、細(xì)胞亞群均參與對(duì)膽道上皮的損害:細(xì)胞在毛細(xì)膽管局部大量聚集并分泌細(xì)胞因子【】;去除效應(yīng)性細(xì)胞后膽道的炎癥及梗阻程度明顯減輕;將致敏淋巴細(xì)胞回輸體內(nèi)后,細(xì)胞既可以向膽道局部特異性聚集,又可以導(dǎo)致膽道上皮損傷【】。因此,膽道閉鎖不但存在淋巴細(xì)胞的功能異常,而且可能正是由于識(shí)別膽道特異性抗原的淋巴細(xì)胞被自身抗原激活,產(chǎn)生自身免疫,最終導(dǎo)致膽道損傷和閉鎖。淋巴細(xì)胞功能異常的機(jī)制至今未被闡明。近來(lái),在一些自身免疫病

12、中,人們發(fā)現(xiàn)低甲基化導(dǎo)致甲基化敏感基因表達(dá)升高,與淋巴細(xì)胞功能異常密切相關(guān)【。甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最深入的一種機(jī)制,是一種酶介導(dǎo)的化學(xué)修飾過(guò)程,亦是哺乳動(dòng)物最常見(jiàn)的一種復(fù)制后調(diào)節(jié)方式【。近年研究表明當(dāng)各種原因引起淋巴細(xì)胞甲基化降低后,對(duì)自身免疫有潛在作用的基因表達(dá)增加,通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。其中與甲基化,其啟動(dòng)子區(qū)域存敏感免疫相關(guān)的基因是干擾素吖 丫【在大量的島和位點(diǎn),可以受到甲基化調(diào)控;而且,作為核心區(qū)域的.位點(diǎn)正是位于此區(qū)域中,可以在表觀調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著主要的作用【 ;另外,與吖表達(dá)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、活化轉(zhuǎn)錄因子和活化蛋白.均位于此區(qū)域【瞞

13、。干擾素是一類具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用的重要的細(xì)胞因子。其中膽道閉鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基億敏感基因.高表達(dá)的研究吖具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能和抗細(xì)胞增殖效應(yīng),又稱為免疫干擾素,主要由抗原和細(xì)胞產(chǎn)生。吖高表達(dá)可以降低淋巴細(xì)胞激活所需的抗原閾值,促進(jìn)淋巴細(xì)胞自身反應(yīng)性激活,促使其向類細(xì)胞分化【】。研究表明一丫在膽道閉鎖淋巴細(xì)胞功能異常的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用,有人發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖患兒肝組織及膽道閉鎖小鼠模型肝和淋巴組織中,?表達(dá)增加,通過(guò)調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)起作用.。甲基化與胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控密切相關(guān)。是絲裂活化原蛋白激酶家族中重要的一員,它所涉及的信號(hào)通路不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的

14、多種生理功能如基因的表達(dá)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡,而且參與了多種疾病的發(fā)病機(jī)理過(guò)程如癌癥、免疫和炎癥等疾病。該信號(hào)通路的主要成員包括/,其中是上游激活蛋白,通過(guò)激活,后者具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性,正常定位于胞漿,激活后轉(zhuǎn)移致胞核,調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性。在輪狀病毒膽道閉鎖小鼠模型中發(fā)現(xiàn)該信號(hào)通路可以被輪狀病毒干擾,并可介導(dǎo)病毒對(duì)膽道上皮的直接損傷【。但是由于膽道閉鎖中膽道上皮的損傷主要是由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷,故目前針對(duì)通路的研究尚不能完全揭示膽道閉鎖的發(fā)病機(jī)制,而該通路對(duì)淋巴細(xì)胞功能的影響尚不十分明了,迫切需要進(jìn)一步研究。近來(lái),人們發(fā)現(xiàn)甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)在很大程度上受,信號(hào)通路調(diào)控,】。甲基

15、化轉(zhuǎn)移酶包括、 和它可以使位于結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)未甲基化的島甲基化,阻遏轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行,關(guān)閉相關(guān)基因的表達(dá)【】。研究發(fā)現(xiàn)在一些自身免疫病中信號(hào)通路異常,表達(dá)降低,甲基化程度降低,進(jìn)而引起甲基化敏感的免疫相關(guān)基因表達(dá)升高,從而誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞自身反應(yīng)性增強(qiáng),導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展【,。綜上,既然膽道閉鎖是由病毒誘導(dǎo)的自身免疫病,且與淋巴細(xì)胞功能異常有關(guān),甲基化敏感免疫相關(guān)基因.高表達(dá)又誘導(dǎo)了淋巴細(xì)胞功能異常;而信號(hào)通路又調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),那么有理由推測(cè)膽道閉鎖中.的高表達(dá)可能是信號(hào)通路所調(diào)控的基因甲基化狀態(tài)改變,進(jìn)而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞對(duì)自身膽道抗原產(chǎn)生反應(yīng)性,在其他因素的協(xié)同作用

16、下最終發(fā)生膽道炎癥損傷和閉鎖。因此,本研究擬以?作為切入點(diǎn),從表觀遺傳學(xué)角度進(jìn)一步揭示膽道閉鎖中淋巴細(xì)胞功能異常的機(jī)制,并探索甲基化敏感基因吖與信號(hào)通路之間的關(guān)系,從而為明確膽道閉鎖的發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)。疆道閉錟中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化刪高表達(dá)的研究第一部分膽道閉鎖患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞全基因組甲基化狀態(tài),是新生兒膽汁淤積的常見(jiàn)病因,亦是兒童最膽道閉鎖常見(jiàn)的嚴(yán)重肝臟疾病,以肝內(nèi)和肝外膽管的進(jìn)行性炎癥和纖維性梗阻為特征,從而導(dǎo)致膽汁淤積以及進(jìn)行性的肝纖維化和肝硬化,不手術(shù)治療很少能活過(guò)歲,造成極大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)【】。本病病因至今未明,一般認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制涉及病毒感染、自身免疫介導(dǎo)的膽管破壞及膽道發(fā)育

17、異常,是一種病毒介導(dǎo)的自身免疫性疾病。隨著對(duì)自身免疫性疾病的深入研究,發(fā)現(xiàn)其與甲基化有著密切的關(guān)系。甲基化在維持淋巴細(xì)胞功能方面起著重要作用,甲基化異常。由于甲基化涉及到的會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞體外自身反應(yīng)和體內(nèi)自身免疫【基因以及相關(guān)的島和位點(diǎn)的復(fù)雜性,同時(shí)不同基因間又存在著復(fù)雜的相互作用,研究起來(lái)比較困難;然而,目前全基因組甲基化芯片技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展,為研究基因組甲基化的表達(dá)以及基因間的相互作用提供了更好的方法。鑒于此,本研究借助全基因組甲基化芯片及生物信息學(xué)技術(shù)在全基因組水平對(duì)基因甲基化狀態(tài)及基因間的相互關(guān)系進(jìn)行初步篩選及研究。疆道闞鎖中細(xì)瞻通路調(diào)控甲基億敏感基因.高表達(dá)的研究.材料和方法.

18、研究對(duì)象的選擇本研究選取我院年月到年月所收治的例膽道閉鎖患兒和例健康體檢兒的外周靜脈血標(biāo)本。.納入標(biāo)準(zhǔn).膽道閉鎖病例納入標(biāo)準(zhǔn):我院初診而未治療,均經(jīng)我院外科手術(shù)后病理切片診斷;日齡 ;無(wú)明顯肝外合并畸形。.對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):我院門(mén)診健康體檢兒;日齡;肝腎功能正常。.本研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對(duì)象依據(jù)知情同意原則,充分告知家長(zhǎng),簽署知情同意書(shū)。.分組標(biāo)準(zhǔn)為了使芯片的使用效率達(dá)到最高,并且充分反映不同個(gè)體間的全基因組甲基化差異表達(dá)的特點(diǎn),本研究共分為膽道閉鎖和健康對(duì)照組,且每個(gè)個(gè)體作為獨(dú)立的樣本,具體臨床資料如下表。表疾病組和對(duì)照組的臨床資料編號(hào) 分組 性別 日齡 / / /序列 病理

19、類型 / / / 女 / / /女 / / / 男 女 ./. / /./. / / 女./. / / 男注:.:膽道閉鎖;:健康對(duì)照;/:總膽紅素;/:直接膽紅素;/:丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶:/:天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶:/:堿性磷酸酶;/:丫.谷酰轉(zhuǎn)肽酶。.膽道閉鎖型:常見(jiàn),占%以上,主要表現(xiàn)為肝門(mén)部膽管阻塞,近端肝管腔內(nèi)無(wú)膽汁。膽道閉鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因高表達(dá)的研究.試劑與材料.主要實(shí)驗(yàn)試劑及配制%乙醇國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?甲酰胺 國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭﹪?guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┕?美國(guó)國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┑聡?guó)公司德國(guó)公司磷酸緩沖液 國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┉傊?美國(guó)公司人淋巴細(xì)胞分離液 天津公司.主要實(shí)驗(yàn)儀器抗凝管 公司 美國(guó)德國(guó)

20、公司 美國(guó)美國(guó)美國(guó)芯片美國(guó)美國(guó)美國(guó). 美國(guó)低溫離心機(jī) 公司 德國(guó)電泳儀 .公司 美國(guó)德國(guó)公司電子分析天平美國(guó)離心管公司德國(guó)普通高速離心機(jī)公司全溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)科教儀器廠.公司 美國(guó)微量加樣槍公司 美國(guó)移液器美國(guó)雜交爐美國(guó)真空泵紫外分光光度計(jì)公司美國(guó).公司 美國(guó)凝膠成像系統(tǒng)瞪道閉鎖中細(xì)瞻通路調(diào)控甲基億敏感基因.高表達(dá)的研究.實(shí)驗(yàn)方法.人外周靜脈血的采集及單個(gè)核細(xì)胞的分離采集疾病組和對(duì)照組外周靜脈血各約,置于抗凝管內(nèi),輕輕充分混勻,保存,并在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)完成后續(xù)操作。取新鮮抗凝血,與液:混勻后,小心加于的細(xì)胞分離液之液面上,離心轉(zhuǎn),分鐘。上述步驟離心后,離心管中由上至下細(xì)胞分四層。第一層:為血漿液

21、層;第二層:為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞層;第三層:為透明分離液層;第四層:為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞,沉淀經(jīng)液反復(fù)洗次即得所需細(xì)胞外周血單個(gè)核細(xì)胞。將收集的細(xì)胞放入凍存管內(nèi),置于液氮中保存?zhèn)溆谩?外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因組的提取及質(zhì)檢試劑盒提取外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組.采用,移入的離心管內(nèi),充分混勻。取出液氮保存的細(xì)胞加入“加入 ,蛋白酶,充分混勻,溫育至細(xì)胞充分裂解必要時(shí)過(guò)夜。加入 /,混勻,室溫溫育分鐘。,混勻,溫育分鐘,短暫離心。加入加入無(wú)水乙醇,混勻秒,短暫離心,加入 中,肛樣本:“無(wú)水乙醇,離心,轉(zhuǎn),分鐘,棄廢液。加入 ,離心轉(zhuǎn),分鐘,棄廢液。加入 ,離心,轉(zhuǎn),分鐘,棄廢液。管離心,

22、最高速,分鐘。加入 于硅膠膜中央,室溫孵育分鐘,離心轉(zhuǎn),分鐘,洗脫,為提高得率可以重復(fù)一次洗脫。.采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)基因組樣品準(zhǔn)備:吸取肛 樣品移入試管中,加滅菌水至混勻后,注入分光光度計(jì)的比色杯中待測(cè)。樣品測(cè)定:一支比色杯為空白對(duì)照,分別測(cè)定另一比色杯加中稀釋樣品在波長(zhǎng)為和時(shí)的值。結(jié)果判定:.樣品的濃度:每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。雙鏈濃度樣品稀釋倍數(shù)/。單鏈濃度樣品稀釋倍數(shù)/。膽道閉鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因高表達(dá)的研究.樣品的純度:/比值大于.,說(shuō)明仍存在,可以考慮用酶處理樣品;/比值小于.,說(shuō)明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚,應(yīng)再用酚/氯仿抽提后,以乙醇沉淀純化。.采用

23、瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)基因組凝膠制備:中配制成%的瓊脂糖溶液,加熱熔解。.取瓊脂糖.,加入.灌制凝膠:將梳子安插在制膠模具上,將溫度降至左右的瓊脂糖溶液倒入模具中,室溫凝固.分鐘。輕輕拔去梳子。將模具置于電泳槽中,向電泳槽中加入.電泳緩沖液,沒(méi)過(guò)凝膠約。加樣電泳:.將樣品與上樣緩沖液按:比例混合后,取加入凝膠加樣槽中。.取一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品與指示劑混合后,加入樣品槽中。.按/的電壓進(jìn)行電泳,根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置判定電泳的距離。染色顯譜:將凝膠小心剝離模具,浸泡在./的染液中染色約分鐘。在紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果判定:比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度,計(jì)算出待測(cè)樣品濃度。.甲基化試劑盒 預(yù)處理基因組

24、試劑準(zhǔn)備:. 在試劑盒里是固體混合物,在初次使用前必須準(zhǔn)備好,按下面方法準(zhǔn)備:在的管中加入水和的. 。室溫振蕩混勻 分鐘。. 濃:使用前加 %的無(wú)水乙醇到含有縮液的試劑瓶中。操作步驟:.在樣本中加“的. ,用水補(bǔ)足體積,輕彈混勻或者用移液器上下吹打混勻。如:在.的樣本中加斗的和 的水。.孵育分鐘。.每個(gè)樣本中加 ,混勻。.暗箱孵育.小時(shí)。.或冰上放置分鐘。眶道閉錟中細(xì)瞻通路調(diào)控單基化敏感基園強(qiáng).高表達(dá)桷研究到套在中的.添加的.中。中。.將樣本步驟移置含有. 的蓋上蓋子顛倒幾次來(lái)混合。.在耋,的速度下全速離心秒。去除濾出液。.到柱中。全速離心秒.添加.到柱中并在室溫下.放置.添加的.分鐘。孵育后

25、,全速離心秒。到柱中。全速離心秒,再添加的.添加“的.缸到柱中,全速離心秒。到柱基質(zhì).將柱子放置在.的離心管中。直接添加.的.中。全速離心秒來(lái)洗脫。刪嬲乒丁觸膦塑絲型型墜蘭翌塑墮芯片掃描.人類全基因組甲基化芯片 及數(shù)據(jù)分析.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖圖:圖人類全基因組甲基化芯片實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案掣, 、囊垂翻矗.:柏:褂糖.:一巾.畦;:兩生魄如。:;蟹 聊婚瞳曹白置 幅乜?,由【捧群 哺朋舊掣噓一甜缸;:啪囊冀、., 、. ,時(shí)艟”?出 騶日柏啦口一叩。:岔。雩 研?,一,孽曲褂伯 二腳如,:艄;,爿?士.掛. 虻蠡矗:.?憎; 、 虻眥/蟹了椰婚餓柏匕啪螄出明刪牮協(xié) 刪?異:醇暇越呵一基稍啦剮拋盤(pán)、 慷艏:

26、拍?斟蚺畦鉑口脯越瞻: .即瓣 甜掣黯幽;尹。 帕、豫飛同懿恥 . 盞出自:苫粕住瞰鼉:冀“?冉嘩。:蠢掣鏟、耆名?譬芝:囂:?！?品”士翻;四一 口 掣托母。科艟道閉錟中細(xì)瞻通路謠控甲基化敏感基因離表達(dá)的研究.具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:第一天:亞硫氫酸鹽處理做標(biāo)記。.將每個(gè)新孔 粘貼.根據(jù)要求,將變性,然后加入。.中過(guò)夜孵育,以下條件下,個(gè)循環(huán):一一一秒。一小時(shí).循環(huán)結(jié)束后,溫度保持在,放置于其中待用。第二天.:制備.洗滌去除。分鐘。中孵育.室溫下。.洗滌去除。加入 。.離心洗脫。將亞硫氫酸鹽處理的轉(zhuǎn)移入 中。.封閉的凍存待用,.?.。.配置 ,分裝后.凍存待用。每次使用前解凍,倍稀釋為.。打開(kāi)雜交

27、爐,預(yù)熱至。取出、解凍,融為液體后離心待用。.取出亞硫氫酸鹽處理的解凍。做標(biāo)記。將新粘貼。加入“ ,在“亞硫氫酸鹽處理的 加入上記錄 中對(duì)應(yīng)的樣品。. 注意覆蓋時(shí)的加入,蓋上孔板字母方向正確,蓋緊,防止飛濺揮發(fā)和污染。. 振蕩器上轉(zhuǎn),混勻分鐘:離心機(jī)中,離心分鐘。室溫孵育,靜置分鐘。. 。加入肛 。加入“. 。重新蓋上疆道閉鎖中黝通路調(diào)控甲基化敏感基因高表達(dá)的研究.將蓋好的上下顛倒翻轉(zhuǎn)至少次,充分混勻。.離心機(jī)中離心分鐘。,雜交爐中孵育,小時(shí)過(guò)夜.小時(shí)。第二天:斷裂沉淀一重懸一雜交第一步,斷裂:.打開(kāi) ,預(yù)熱至。.取出,晶體難溶解解凍,融為液體后離心待用。.取出,離心分鐘。. 。加入,重新蓋上

28、.振蕩器上轉(zhuǎn),混勻分鐘;離心機(jī)中,離心分鐘。. 中孵育,小時(shí)。.封閉的凍存待用,.?.。第二步,沉淀:.打開(kāi) ,預(yù)熱至。;準(zhǔn)備好。離心機(jī)待用。.取出置于室溫,離心待用,取出%異丙醇。.取出解凍凍存的,離心。加入 ,重新蓋上。.掀開(kāi)的 ,斗 .振蕩器上轉(zhuǎn),混勻分鐘。. 中孵育,分鐘。.離心機(jī)中離心分鐘。,重新蓋上新的干燥.山%異丙醇加入 .將蓋好的上下顛倒翻轉(zhuǎn)至少次,充分混勻。.冰箱孵育分鐘。.離心機(jī)中離心分鐘;然后立即將取出離心機(jī),棄除,立即翻轉(zhuǎn)去除上清液,水平倒扣在吸水紙上方輕叩至沒(méi)有水印,時(shí)間約即可,不要使藍(lán)色沉淀移動(dòng),一直保持倒扣狀態(tài)。若是離心結(jié)束后有時(shí)間延誤未能及時(shí)去除上清,則需要重新

29、離心分鐘。上,小時(shí)空氣干燥。.保持倒扣狀態(tài)放置于.封閉好凍存待用,.?.。第三步,重懸:。.打開(kāi)雜交爐,預(yù)熱至;打開(kāi).觀察是否透明,沒(méi)有晶體存在。,使用完畢即凍存。.山加入下作用秒,然后將上下順序改變后.金屬箔覆蓋后,疆道閉錟中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因高表達(dá)的研究再作用秒,繼而將金屬箔稍微掀起驗(yàn)證封口的效果。.將封口的放入雜交爐,孵育小時(shí)。振蕩器上轉(zhuǎn),混勻分鐘;離心機(jī)中離心分鐘。若是凍存的,則需要反復(fù)振蕩離心直到藍(lán)色沉淀徹底重懸。.封閉的凍存待用,.?.,若要超過(guò)小時(shí)使用,則.凍存。第四步,雜交:.打開(kāi) ,預(yù)熱至;打開(kāi)雜交爐,預(yù)熱至,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為。.準(zhǔn)備雜交盒,雜交盒襯墊,.打開(kāi)雜交盒,雜交盒

30、襯墊放入雜交盒中, 加入雜交盒上下小凹槽中上下小凹槽對(duì)應(yīng)一張芯片,馬上關(guān)閉雜交盒防止揮發(fā),按照對(duì)角線方向扣住,室溫放置待用。.重懸后封口的,放入 中變性分鐘。.取出芯片放置室溫,不要打開(kāi)。.變性后的室溫冷卻分鐘,然后離心機(jī)中離心分鐘。.將芯片在盒中取出,小心將其取出包裝,不能碰到芯片加樣品的位置,對(duì)應(yīng)中。位置放于樣品按照芯片樣品區(qū)順序加入芯片加樣區(qū),注意緩緩流入過(guò)程中不.“要產(chǎn)生氣泡,同時(shí)記錄樣品和芯片對(duì)應(yīng)號(hào)。對(duì)應(yīng)位置放于雜交盒中,并關(guān)閉。.將帶有芯片的小時(shí)過(guò)夜.小時(shí)。.雜交爐中孵育,. %乙醇加入中,劇烈混勻秒,室溫過(guò)夜待用。第三天.:洗滌延伸一染色一掃描.在雜交爐中取出雜交盒,不要打開(kāi),雜

31、交盒室溫冷卻分鐘。.加入個(gè)共個(gè)。充滿。.準(zhǔn)備和 ,安裝好.取出、解凍,離心分鐘待用。:配置%甲酰胺/ /張芯片。.打開(kāi).,驅(qū)趕氣泡,調(diào)節(jié)溫度并且穩(wěn)定在。.放置于第一個(gè) 中,并且完全被浸沒(méi)。.在雜交盒中取出帶有芯片的 ,將芯片取出,掀掉,立刻將芯片放置于 中。.將帶有芯片的上下提拉分鐘,注意緩慢輕柔,每次都要離開(kāi)液面。將帶有芯片的 放置于第二個(gè)中,同上步上下提拉分鐘。膽道閉鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基化敏感基因高表達(dá)的研究:將.裝配 放置于 中,將芯片放置于 中注意芯片完全被浸沒(méi),然后正確放置置于上方,然后正確放置干凈,再將的 斜面對(duì)應(yīng)芯片,并且和芯片之間沒(méi)有氣泡,再將正確放置于兩端,和上下邊緣相差分鐘

32、。.取出,剪掉多余的,水平放置直到進(jìn)行下一步。.溫度穩(wěn)定在,將正確放置于上,芯片在上方。. 的斜面中按照以下順序依次加入:,孵育秒,重復(fù)次?！?,孵育分鐘。,孵育分鐘?！?,孵育分鐘。%甲酰胺/ ,孵育分鐘,重復(fù)次?！霸俜跤昼姟?溫度調(diào)節(jié)在與要求溫度一致。,孵育分鐘,重復(fù)次。“等待.溫度穩(wěn)定在。.打開(kāi)。的斜面中按照以下順序依次加入:,孵育分鐘。,孵育分鐘,重復(fù)次,再孵育分鐘。 ,孵育分鐘。,孵育分鐘,重復(fù)次,再孵育分鐘。,孵育分鐘。,孵育分鐘,重復(fù)次,再孵育分鐘。,孵育分鐘。,孵育分鐘,重復(fù)次,再孵育分鐘。,孵育分鐘?！? ,孵育分鐘,重復(fù)次,再孵育分鐘。在 上取出,水平放置。.將. 加入第

33、個(gè) 置于其中。,將中。.拆除 ,取出芯片,放置于上下提拉次,注意緩慢輕柔,每次都要離開(kāi)液面,.將帶有芯片的然后浸泡分鐘。疆道閾鎖中緬魄通路調(diào)控甲基化敏感基因.高表達(dá)的研究.劇烈振搖后, 加入第個(gè) 在第,將個(gè) 中取出再置于第個(gè) 。.將帶有芯片的 上下提拉次,注意非常緩慢輕柔,每次都要離開(kāi)液面,然后浸泡分鐘。上。取出后,立刻芯片正面向上水平放置于.將帶有芯片的中取出,芯片正面向上水平放置于 上。.將芯片在.真空泵中干燥芯片.分鐘。.將芯片背面及兩側(cè)干燥的擦干凈,保證芯片背面平整。.將芯片放置于原包裝中,室溫條件下放置于真空泵中,小時(shí)之內(nèi)掃描。.啟動(dòng)軟件掃描芯片:預(yù)先下載芯片解碼文件.。預(yù)先下載芯片

34、文件.。掃描約需要時(shí)間:小時(shí)。.人類全基因組甲基化芯片校正方法及差異分析兩種校正方法校正方法目的是去除非生物因素對(duì)信號(hào)值造成的影響。但對(duì)于表達(dá)譜芯片的校正分析中多數(shù)是基于多數(shù)的基因是沒(méi)有差異表達(dá)的,我們?cè)谧黾谆瘮?shù)據(jù)分析時(shí),不需要基于這樣的假設(shè),因此甲基化芯片的校正方法比起表達(dá)譜芯片而言相對(duì)比較簡(jiǎn)單。.背景去除法背景值是微珠芯片上點(diǎn)的陰性對(duì)照的平均強(qiáng)度值。背景值校正法能將微陣列之間背景信號(hào)的差異最小化。由于陰性對(duì)照點(diǎn)特性在熱力學(xué)性質(zhì)方面和一般的探針相同,但在所研究的基因組中并沒(méi)有特異性的結(jié)合靶點(diǎn),可以用陰性對(duì)照信號(hào)值來(lái)進(jìn)行背景校正。陰性對(duì)照能用來(lái)估計(jì)沒(méi)有雜交靶基因的點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度水平。探針強(qiáng)度值

35、會(huì)減去陰性對(duì)照點(diǎn)平均強(qiáng)度值。結(jié)果,不表達(dá)基因的強(qiáng)度值理論上應(yīng)該為,這樣一半不表達(dá)基因的信號(hào)強(qiáng)度值可能為負(fù)。.平均法平均值校正主要用于芯片,目的是為了減小不同芯片間的系統(tǒng)誤差。例如:、號(hào)芯片的平均信號(hào)值是、。則個(gè)芯片的平均信號(hào)值計(jì)算為/。以/做為校正因子與每個(gè)板的平均信號(hào)值相乘,即每個(gè)板的信號(hào)值進(jìn)行校正。最終每個(gè)平均得到相等的平均信號(hào)值。甲基化程度算法疆遭閉錟中細(xì)瞻通路調(diào)控甲基化敏感基因高表達(dá)的研究值用于計(jì)算位點(diǎn)的甲基化程度。甲基化芯片針對(duì)每一個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩種探針,用雙色熒光信號(hào)和來(lái)檢測(cè)甲基化和非甲基化的等位基因。和的比值為該位點(diǎn)甲基化水平。.矽.矽.糾根據(jù)原始數(shù)據(jù)的表現(xiàn)選擇歸一化方法可選擇的歸一

36、化方法有如下種:和。本實(shí)驗(yàn)選擇的歸一化方法為:。通過(guò)芯片圖像分析軟件對(duì)芯片灰度掃描圖進(jìn)行分析,可以得到芯片上每個(gè)基因點(diǎn)的原始信號(hào)值,即所有有效重復(fù)點(diǎn)的前景信號(hào)值減去背景信號(hào)值的平均信號(hào),等。值差異甲基化基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組其中任何一組中為有效基因.;且實(shí)驗(yàn)組樣本值小于一或大于;且?大于.或小于.,即為差異甲基化基因。 值的計(jì)算,即為與相差的結(jié)果,即實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在每個(gè)位點(diǎn)的甲基化的差異組程度。疆道河鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基純敏感基因贏表達(dá)的硯究.結(jié)果.人外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組的質(zhì)檢結(jié)果.紫外分光光度計(jì)法質(zhì)檢結(jié)果表表基因組紫外分光光度計(jì)法質(zhì)檢結(jié)果/ /序列 分組 體積/ 總量 . . .

37、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .注:.共選取個(gè)樣本,其中和質(zhì)量欠佳,不考慮采用;.疾病組為膽道閉鎖,選取、三個(gè)樣本;.對(duì)照組為健康兒,選取、三個(gè)樣本。膽道閉鎖中細(xì)胞通路調(diào)控甲基佬敏感基因高表達(dá)的研究.瓊脂糖凝膠電泳法質(zhì)檢結(jié)果圖圖基因組瓊脂糖凝膠電泳法質(zhì)檢結(jié)果注:.共選取個(gè)樣本,其中和質(zhì)量欠佳,不考慮采用;.疾病組為膽道閉鎖,選取、三個(gè)樣本;.對(duì)照組為健康兒,選取、三個(gè)樣本。.本研究中采集到膽道閉鎖外周血例,健康對(duì)照組例,提和兩取基因組,經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)編號(hào)個(gè)標(biāo)本質(zhì)檢結(jié)果欠滿意

38、,遂決定棄去。最后選取膽道閉鎖和健康對(duì)照組各三例進(jìn)行甲基化芯片篩選。.人類全基因組甲基化芯片篩選結(jié)果.通過(guò)校正方法及差異分析,膽道閉鎖中共篩選出個(gè)差異甲基化位點(diǎn);其中個(gè)發(fā)生低甲基化,個(gè)發(fā)生高甲基化,分別代表和個(gè)基因,差異均有顯著性意義.。.根據(jù)基因的功能不同,進(jìn)一步限定條件,篩選出免疫相關(guān)基因的差異甲基化位點(diǎn)為個(gè);其中發(fā)生低甲基化的個(gè),發(fā)生高甲基化的個(gè),分別代表和個(gè)基因,差異均有顯著性意義.。表,圖疆道閉鐨中細(xì)瞻通路調(diào)控甲基純敏感基因高表達(dá)的研究圖全基因組甲基化芯片篩選出的免疫相關(guān)基因差異甲基化聚類分析圖.疾病組為膽道閉鎖,共例,編號(hào)為:、;.對(duì)照組為健康兒,共例,編號(hào)為:、;.綠色代表相對(duì)低

39、甲基化,顏色越深表示甲基化程度越低;.紅色代表相對(duì)高甲基化,顏色越深表示甲基化程度越高。暄道闋錟中細(xì)瞻通路調(diào)控甲基化敏感基因.高表達(dá)的研究表全基因組甲基化芯片篩選出的部分免疫相關(guān)基因差異甲基化位點(diǎn). . . . .黼. 匝 . . . . . . . . . . . , ,. . . . , ,. . . . , ,. . . . , ,. . . . , ,. . . . , ,. . . . ,. . . . , ,. . . . , ,. . . . . . . . . . . . . . . . . . , ,. . . . , , . . . .;. . . . . . . .瞧道闋

40、鎖中細(xì)魄通路調(diào)控甲基化敏感基因高表達(dá)的研究. . . .冰 歸 . . . . . ., ,. . . . , ,. . . . . . ?., ,. . . . . . . .,. . . . . . ?. . . . . . . . . . . . . . . . . ?. . . . . . . . . ?. . ?. ?. . ?. ?. . . . . . . . .印. . . . .】 .】. ?.疆道閱錟中細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控甲基化敏感基因叫高表達(dá)的分子機(jī)翩研究.甲基化敏感免疫相關(guān)基因干擾素吖亦具有明顯的低甲基化趨勢(shì)。見(jiàn)表.。.干擾素吖基因問(wèn)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析根據(jù)基因表達(dá)的相似性,分

41、析基因產(chǎn)物可能的相互作用關(guān)系。通過(guò)計(jì)算分析得到干擾素吖基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。圖圖干擾素一基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖未喪,、 ,翻吣暄道閉鎖中細(xì)魄信號(hào)通路調(diào)控平基化敏感基因商表達(dá)的分子視鏹磅究附件:表中相關(guān)內(nèi)容說(shuō)明 ? ?. 附件:圖中相關(guān)內(nèi)容及圖示說(shuō)明自二 。點(diǎn) .,罅 、。?毒呻?！啊ｊ?yáng)鴕, 三, 湖恤,?一。一一? ?拿冀。: .廠, /疆道閉錟中細(xì)魄信號(hào)通路調(diào)控甲基純敏感基因騷高表達(dá)的分子機(jī)翻研究.討論,是一種病毒介導(dǎo)的自身免疫性疾本研究結(jié)合膽道閉鎖病以及同卵雙胎兒并沒(méi)有同時(shí)發(fā)病這一特點(diǎn),認(rèn)為非遺傳性因素在的形成中起著重要作用【,這也將研究方向轉(zhuǎn)向表觀遺傳學(xué)。作為一種自身免疫相關(guān)疾病,我們首先從外

42、周血單個(gè)核細(xì)胞著手開(kāi)始研究,探討外周血單個(gè)核細(xì)胞在中的情況;采用全基因組甲基化芯片進(jìn)行甲基化位點(diǎn)的初步篩選,為下一步工作奠定初步基礎(chǔ)。觚人類全基因組甲基化芯片是公司研發(fā)出的全新的甲基化芯片技術(shù);其中芯片是采用亞硫酸鹽處理的,。芯片技術(shù)重復(fù)性效果比較好,技術(shù)重復(fù)性相關(guān)系數(shù)可以高達(dá)%以上【。的數(shù)據(jù)容量比較大,包括:大于島或 位點(diǎn),島外的位點(diǎn),在人類干細(xì)胞中觀察到的非島甲基化位點(diǎn),腫瘤與正常細(xì)胞相異的甲基化位點(diǎn),包括多種腫瘤及不同的組織類型,非編碼區(qū)島位點(diǎn),啟動(dòng)子區(qū)域,由項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)的疾病相關(guān)區(qū)域位點(diǎn)。主要實(shí)驗(yàn)原理為:用亞硫酸鹽處理基因組;將胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶;甲基化的不反應(yīng),保持不變;針對(duì)轉(zhuǎn)化后的序列

43、設(shè)計(jì)芯片探針處理后上下鏈不再互補(bǔ);處理后的與芯片雜交掃描后,甲基化狀態(tài)可通過(guò)計(jì)算熒光信號(hào)比例來(lái)確定。另外,甲基化芯片位點(diǎn)的選擇及探針設(shè)計(jì)來(lái)自于人類表觀基因組先導(dǎo)計(jì)劃的研究成果,所有的位點(diǎn)均選用的是具有代表性的位點(diǎn)類似于研究中的標(biāo)簽位點(diǎn),即所選擇的這些位點(diǎn)即可反映其所在的島的甲基化狀態(tài),并且這些位點(diǎn)在研發(fā)這款芯和片過(guò)程中均經(jīng)驗(yàn)證。甲基化芯片的結(jié)果與其他低通量的甲基化方法的結(jié)果有較好的一致性,主要技術(shù)原理類似于已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可的的檢測(cè)原理,這說(shuō)明甲基化芯片檢測(cè)的化學(xué)原理是準(zhǔn)確可靠的。目前甲基化芯片在基礎(chǔ)和臨床研究領(lǐng)域中應(yīng)用越來(lái)越廣泛,如腫瘤相關(guān)疾病卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等,克羅恩病,出生

44、缺陷疾病先天性心臟病、.綜合征】,骨髓增生異常綜合征【,糖尿病【,創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙【,免疫細(xì)胞發(fā)育】等等;這些研究結(jié)果能夠進(jìn)一步指導(dǎo)臨床及基礎(chǔ)研究,甚至可以作為疾病的初步診斷。本部分研究中,我們第一次將甲基化芯片應(yīng)用于中,通過(guò)全基因組甲基化位點(diǎn)的篩選,同時(shí)輔助校正方法及差異分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖中共篩選出個(gè)差異甲基化位點(diǎn):其中個(gè)發(fā)生低甲基化,個(gè)發(fā)生高甲基化,分別代表和個(gè)基因,差異均有顯著性意義;鑒于,是自身免疫相關(guān)疾病,我們進(jìn)一步限定篩選條膽道閉鎖中細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控平基化敏感基因琢贏表達(dá)的分子機(jī)鈉研究件,篩選出免疫相關(guān)基因的差異甲基化位點(diǎn)為個(gè);其中發(fā)生低甲基化的個(gè),發(fā)生高甲基化的個(gè),分別代表和個(gè)

45、基因,差異均有顯著性意義。通過(guò)結(jié)果分析,我們認(rèn)為外周血單個(gè)核細(xì)胞的全基因組甲基化位點(diǎn)中,相對(duì)低甲基化位點(diǎn)數(shù)量占有一定優(yōu)勢(shì);同時(shí)相對(duì)高甲基化位點(diǎn)也占有一定的份額。甲基化是一種重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳機(jī)制,在維持正常細(xì)胞的生理活動(dòng)中起著重要的作用,其模式發(fā)生改變有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展;甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián),非甲基化一般與基因的活化相關(guān)聯(lián),去甲基化一般與一個(gè)基因的重新激活相關(guān)聯(lián);基因組的甲基化狀態(tài)改變會(huì)造成機(jī)體染色體不穩(wěn)定或基因表達(dá)異常;異常的甲基化可分為高甲基化和低甲基化,前者指正常組織中不發(fā)生甲基化的位點(diǎn)被甲基化,后者是指在正常組織中發(fā)生甲基化的。位點(diǎn)去甲基化【,本部分研究中,我們發(fā)現(xiàn)中

46、存在相當(dāng)多的基因和位點(diǎn)發(fā)生低甲基化;而有些基因在的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。如,人類主要組織相容性復(fù)合體類分子 。甲基化芯片篩選結(jié),果提示類分子啟動(dòng)子區(qū)域絕大部分位點(diǎn)處于低甲基化狀態(tài)。人類分子是人類白細(xì)胞抗原 ,與自身免疫密切相關(guān)。 類分子分布比較局限,主要表達(dá)于細(xì)胞、單核一巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞上,精子細(xì)胞和某些活化的細(xì)胞上也有表達(dá)。一些在正常情況下不表達(dá) 類分子的細(xì)胞,在免疫應(yīng)答過(guò)程中亦可受細(xì)胞因子的誘導(dǎo)表達(dá)類分子,因此 類分子的表達(dá)被看成是抗原遞呈能力的標(biāo)志。白介素,.、.和丫.干擾素吖在體內(nèi)外均能增強(qiáng)類分子的表達(dá)。其功能主要是在免疫應(yīng)答的始動(dòng)階段將經(jīng)過(guò)處理的抗原片段遞呈給

47、 淋巴細(xì)胞;主要參與外源性抗原的遞里,在一些條件下也可遞內(nèi)源性抗原。在免疫應(yīng)答中, 類抗原主要是協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞間的相互作用,調(diào)控體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。的發(fā)生與特殊的單倍體或與受損器官上 類抗原異常表達(dá)有關(guān)【。研究指出患者存在膽管上皮.分子突變亦有研究指出與.基因及.連鎖不平衡高度相關(guān)【引。本課題組前期利用基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)的基因表達(dá)譜進(jìn)行研究,結(jié)果提示的發(fā)生與 類分子介導(dǎo)免疫反應(yīng)密切相關(guān)【。結(jié)合本部分研究中 類分子啟動(dòng)子區(qū)域處于低甲基化狀態(tài)以及中 類分子異常高表達(dá),這可能預(yù)示著兩者具有一定的相關(guān)性;同時(shí),?對(duì) 類分子調(diào)控作用可能在這一現(xiàn)象中也發(fā)揮著一定作用,仍需后續(xù)深入研究。另外,

48、本部分研究結(jié)果提示中也存在著一定量的基因和位點(diǎn)發(fā)生高甲基疆道閉錟中./信號(hào)通路調(diào)控甲基化敏感基因唧高表達(dá)的分孑機(jī)鋤研究化。如,其啟動(dòng)子區(qū)域,特別是距離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)內(nèi)存在著相當(dāng)多的高甲基化位點(diǎn)。是從牛胃分泌物中提取并純化出的孤兒蛋白偶聯(lián)受體,是血管緊張素受體相關(guān)的受體蛋白 ,的天然配體。及其受體在體內(nèi)分布廣泛,以內(nèi)分泌、旁/自分泌的方式調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、水鹽平衡等,是一種重要的生理調(diào)節(jié)肽。有意義的是,還是一種免疫調(diào)節(jié)肽,可通過(guò)與其受體結(jié)合抵抗病毒的入侵,抑制淋巴細(xì)胞膽堿能活性,參與免疫缺陷疾病和獲得性免疫缺陷綜合征免疫反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫炎癥因子生成,在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起一定。雖作用?？梢砸种萍?xì)胞產(chǎn)生、

49、.、.,從而調(diào)劑免疫反應(yīng)【然目前尚不清楚在中的作用如何,但是其啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化可能與基因的沉默有關(guān),進(jìn)而喪失了抑制細(xì)胞分泌吖的功能,這也可以部分解釋中吖異常高表達(dá)的原因。啟動(dòng)子是決定基因能否啟動(dòng)并生效的生物開(kāi)關(guān),該區(qū)域的甲基化狀態(tài)將直接影響到基因的表達(dá)和功能【 。作為一種甲基化敏感免疫相關(guān)的基因,其啟動(dòng)子區(qū)域存在低甲基化位點(diǎn),可以作為甲基化作用位點(diǎn)起到調(diào)控作用。干擾素是一類具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用的重要的細(xì)胞因子;其中吖具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能和抗細(xì)胞增殖效應(yīng),又稱為免疫干擾素,主要由抗原和細(xì)胞所產(chǎn)生【。高表達(dá)可以降低淋巴細(xì)胞激活所需的抗原閾值,促進(jìn)淋巴細(xì)胞自身反應(yīng)性激活,并促使其向類細(xì)胞分化【。在外周血單個(gè)核細(xì)胞中,甲基化芯片篩選結(jié)果提示吖基因啟動(dòng)子區(qū)域存在低甲基化位點(diǎn);研究指出基因啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化位點(diǎn)可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平高表達(dá),特別是處于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)區(qū)域發(fā)生低甲基化,可以介導(dǎo)吖的異常表達(dá)【;而且,作為核心區(qū)域的.位點(diǎn)在表觀調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著主要作用【,】;另外,與.表達(dá)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、活化轉(zhuǎn)錄因子和活化蛋白.均位于此區(qū)域【,】。鑒于吖在中發(fā)揮著重要作用以及一定程度上可能是貫穿低甲基化和高甲基化基因的樞紐,本研究后續(xù)部分將會(huì)著重探討。由于芯片結(jié)果提示的信息量