蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)

1、蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù),一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)作用的特異性、空間結(jié)構(gòu)的差異性和生物學(xué)功能多樣性的基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中除肽鍵外，有些還含有二硫鍵。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu) 測(cè)定的原理,1.氨基酸組成的分析 (1) 蛋白質(zhì)樣品的純化; (2) 蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目測(cè)定 (3) 氨基酸組成的分析,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,測(cè)定多肽鏈的數(shù)目,蛋白質(zhì)測(cè)序 的步驟,拆分多肽鏈,斷開(kāi)多肽鏈內(nèi)的二硫鍵,測(cè)定每一肽鏈的氨基酸組成,鑒定多肽鏈的n-末端和c-末端,裂解多肽鏈為較小的肽段,測(cè)定各肽段的氨基酸序列,利用重疊肽重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu),確定二硫鍵的位置,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定基本原則,1.確

2、定蛋白質(zhì)的純度在97%以上。 2.測(cè)定多肽鏈的數(shù)目。 3.拆分多肽鏈。 4.分析每一條多肽鏈的氨基酸組成。 5.鑒定多肽鏈的n末端和c末端氨基酸殘基。 6.用兩種以上方法裂解多肽鏈成較小的肽段。 7.測(cè)定各肽段的氨基酸序列。 8.拼接各肽段成完整的多肽鏈。 9.確定二硫鍵的位置。,.多肽鏈數(shù)目的測(cè)定 根據(jù)蛋白質(zhì)n端和c端殘基的摩爾數(shù)和蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量可確定分子中的多肽鏈數(shù)目。若含一條多肽鏈，蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)與末端基的摩爾數(shù)相等；如果后者是前者的倍數(shù)，說(shuō)明該蛋白質(zhì)分子是由多條多肽鏈組成。如果檢測(cè)到的末端基多于一種，表明蛋白質(zhì)由兩條或多條不同的多肽鏈組成，即樣品是雜多聚蛋白質(zhì)（heteromul

3、timeric protein）。,.拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈 寡聚蛋白質(zhì)的亞基必須拆分?？捎米冃詣┤? mol/l尿素、6 mol/l鹽酸胍或高濃度鹽處理。若亞基間通過(guò)二硫橋（s-s）交聯(lián)，如胰島素（含兩條多肽鏈）和-胰凝乳蛋白酶（含3條多肽鏈）則可用氧化劑或還原劑將二硫鍵斷開(kāi)。 拆開(kāi)后的單個(gè)多肽鏈可根據(jù)它們的大小或/和電荷的不同進(jìn)行分離、純化。 .拆開(kāi)多肽鏈內(nèi)的二硫橋 多肽鏈內(nèi)半胱氨酸殘基之間的s-s橋必須在進(jìn)行第4步前予以斷裂。,.測(cè)定每一條多肽鏈的氨基酸組成 分離純化的多肽鏈一部分樣品完全水解，測(cè)定氨基酸組成，計(jì)算氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。 .鑒定多肽鏈的n端和c端殘基 多肽鏈的另

4、一部分樣品進(jìn)行末端殘基的鑒定，以便建立兩個(gè)重要的氨基酸序列參考點(diǎn)。 .裂解多肽鏈成較小的片段 用兩種或幾種不同的斷裂方法（指斷裂點(diǎn)不一樣）將每條多肽鏈樣品降解成兩套或幾套重疊的肽段或稱肽碎片。每套肽段進(jìn)行分離、純化，并對(duì)每一純化了的肽段進(jìn)行氨基酸組成和末端殘基的分析。,.測(cè)定各肽斷的氨基酸序列 最常用edman降解法，并有自動(dòng)序列分析儀可供利用，此外尚有酶解法和質(zhì)譜法等。 .建立完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu) 利用兩套或多套肽段的氨基酸序列彼此間有交錯(cuò)重疊可以拼湊出原來(lái)的完整多肽鏈的氨基酸序列。 .確定半胱氨酸殘基間形成的s-s交聯(lián)橋的位置 氨基酸序列測(cè)定中不包括輔基成分分析，但是它應(yīng)屬于蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)

5、內(nèi)容。,2.n-末端氨基酸組成的分析 (1)與2，4-二硝基氟苯的反應(yīng) (sanger反應(yīng)） 在弱堿性溶液中，氨基酸的- 氨基很容易與 2，4-二硝基氟苯（dnfb）作用，生成穩(wěn)定的黃 色2，4-二硝基苯基氨基酸（簡(jiǎn)寫為dnp-氨基 酸）。,sanger法 dnfb （二硝基氟苯）反應(yīng),黃色:根據(jù)它在薄層層析或紙電泳中的遷移特性進(jìn)行鑒定,（2）與丹磺酰氯反應(yīng)（dns-ci） 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡(jiǎn)稱,+,hci,有熒光,（3）. 與異硫氰酸苯酯反應(yīng)（edman反應(yīng)） 這個(gè)反應(yīng)首先被edman用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的n-末端氨基酸。 在弱堿性條件下，氨基酸中的-氨基還可以與異硫氰酸苯酯（p

6、itc）反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的苯氨基硫甲酰氨基酸（ptc-氨基酸）。在無(wú)水酸中，ptc-氨基酸即環(huán)化為苯硫乙內(nèi)酰脲（pth），后者在酸中極穩(wěn)定，此法最大優(yōu)點(diǎn)是水解除去末端標(biāo)記的氨基酸產(chǎn)基時(shí)不會(huì)破壞余下的多肽鏈。,+,pitc,苯硫乙內(nèi)酰脲(pth-aa),苯氨基硫甲酰氨基酸（ptc-氨基酸）,（edman反應(yīng)）,.,.,2021/4/17,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,16,（4）氨肽酶法 從多肽鏈的n未端依次向內(nèi)切 nh2 -aa-aa-aa-aa. 據(jù)一定時(shí)間內(nèi)釋放出的aa的數(shù)量和種類來(lái)推測(cè).,3. c-未端的測(cè)定方法 肼解法 多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，c-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸

7、則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與c-端氨基酸分離。 注:末端若為半胱氨酸或胱氨酸就不能用此法，必須烷基化后再肼解。,用自動(dòng)序列分析儀測(cè)序 儀器原理：edman法。 1967液相測(cè)序儀 自旋反應(yīng)器，適于大肽段。 1971固相測(cè)序儀 表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的端。 1981氣相測(cè)序儀 用polybrene反應(yīng)器。 （聚陽(yáng)離子）四級(jí)銨鹽聚合物 液相：5nmol 20-40肽 97% 氣相：5pmol 60 肽 98%,蛋白質(zhì)序列儀的結(jié)構(gòu)示意圖,序列儀反應(yīng)室的結(jié)構(gòu),20 種pth氨基酸hplc圖譜,二硫鍵、酰胺及其他修飾基團(tuán)的確定 1、 二硫鍵的確定（對(duì)角線電泳法

8、） 碘乙酰胺封閉-sh 胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì) 第一向電泳 過(guò)甲酸氧化ss生成-so3h 第二向電泳 分離出含二硫鍵的兩條短肽，測(cè)序 與拼接出的肽鏈比較，定出二硫鍵的位置。,樣品蛋白質(zhì)經(jīng)硫氧還蛋白處理后，利用熒光巰基探針標(biāo)記巰基，目標(biāo)蛋白會(huì)帶上熒光探針。再進(jìn)行對(duì)角線電泳時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白存在分子內(nèi)二硫鍵，則經(jīng)處理后所得的點(diǎn)位于對(duì)角線的上方；如果目標(biāo)蛋白存在分子間二硫鍵，則經(jīng)處理后得到的點(diǎn)位于對(duì)角線的下方。,2、 酰胺的確定 asp（天冬氨酸） asn（天冬酰胺）、glu（谷氨酸）-gln 酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個(gè)asx或glx的肽，用電泳法確定是asp還是asn 舉例：leu-glx-pro-val

9、肽在ph=6.0 時(shí)，電荷量是 leu+ pro0 val- 此肽除glx外，凈電荷為0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是glu或是gln。,3、 糖、脂、磷酸基位置的確定 糖類通過(guò)asn、ser與蛋白質(zhì)連接，-n-糖苷 -c-糖苷 脂類：ser、 thr（蘇氨酸）、cys（半胱氨酸） 磷酸：ser、 thr、his 經(jīng)驗(yàn)性序列： lys(arg)-ser-asn-ser(po4) arg-thr-leu-ser(po4) lys(arg) ala-ser(po4),序列測(cè)試時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題,一、與樣品相關(guān)的因素 （1）樣品純度：90%, 鹽含量在mmol/l內(nèi)，不含變性劑（如sds)等雜質(zhì)，其n-端

10、必須是均一的高純樣品。例如樣品中含2個(gè)混合物，只有含量相差4-5倍以上才能對(duì)主序列和次序列進(jìn)行分析。,純度鑒定方法： a：質(zhì)譜 b ：sds-page c ：hplc d ：hpce 一般采用2種以上的方法加以驗(yàn)證。,（2）樣品量： 至少需要10pmol,例如標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測(cè)定：10pmol樣品可以測(cè)定20氨基酸殘基。 一般樣品量大于50pmol或者更多測(cè)定序列越長(zhǎng)。如分子量為20000的蛋白質(zhì)，50pmol約為1微克。所以蛋白質(zhì)n-端測(cè)序?qū)儆诔Ｒ?guī)測(cè)定。,（）樣品存在狀態(tài) a 液體：液體樣品中不能含有蛋白酶以防降解，同時(shí)樣品測(cè)試前不能放置太久，在20以下保存，最好盡早測(cè)試。 b 轉(zhuǎn)膜樣品：樣品經(jīng)凝

11、膠電泳分離后，應(yīng)馬上進(jìn)行電轉(zhuǎn)移至pvdf膜上面，轉(zhuǎn)膜前不能放置很久以防止樣品擴(kuò)散。 含有樣品的pvdf可以用濾紙夾住保持在密封塑料袋中，可以在冰箱保存3-6個(gè)月。,（）如果樣品沒(méi)有任何信號(hào)峰，要考慮蛋白n-端封閉。具報(bào)道約50%天然蛋白質(zhì)n-端被修飾如乙?；柞；?，焦谷氨酸化，須經(jīng)蛋白質(zhì)化學(xué)降解或酶切后分離后分析。 有時(shí)樣品在分離純化中也會(huì)產(chǎn)生n-端封閉，主要由于溶液中去垢劑或化學(xué)物質(zhì)與蛋白樣品n-端功能基團(tuán)反應(yīng)，或者分離純化中ph過(guò)高（ph9-10）,轉(zhuǎn)膜樣品要求： （）為防止部分蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程被膠內(nèi)雜質(zhì)而封閉末端，請(qǐng)預(yù)先自做預(yù)電泳。即用低電壓跑空膠2.5h再上樣電泳分離。 （）電泳過(guò)程

12、中，用盡量避免條帶拖尾現(xiàn)象，用于測(cè)序的條帶用狹窄清晰。而且必須保證一定的量，測(cè)定20個(gè)氨基酸以上的蛋白質(zhì)，至少需要2-3條明亮，清晰的條帶。 （)樣品轉(zhuǎn)膜后請(qǐng)用coomassier250染色分鐘，避免使用coomassieg250. ( 4 ) 含樣品的pvdf膜夾在濾紙間保存在密封塑料袋中，冰箱內(nèi)可以放置-6月（），電泳緩沖液建議使用緩沖液，而不要使用ris-甘氨酸緩沖液。,二、edman降解與儀器有關(guān)的因素,（1）由于各種氨基酸殘基化學(xué)或物理性質(zhì)不同，因此判斷其含量時(shí)pth信號(hào)的強(qiáng)弱會(huì)發(fā)生變化。如：絲氨酸和蘇氨酸因發(fā)生脫羥基而破壞，半胱氨酸被修飾很難有信號(hào)，組氨酸和精氨酸由于極性而難以萃取

13、，蛋氨酸極易氧化而收率低。 （2）修飾殘基在檢測(cè)時(shí)接近或覆蓋已知氨基酸時(shí)會(huì)造成氨基酸識(shí)別錯(cuò)誤。 （3）測(cè)序用的化學(xué)試劑必須具有高的純度，消除一切可能導(dǎo)致在pth色譜中產(chǎn)生的假峰，所有試劑和溶劑均保證測(cè)序級(jí)。,二、二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,圓二色光譜法（cd） 肽鍵是高度有規(guī)律排列的，其排列的方向性決定了肽鍵能級(jí)躍遷的分裂情況。具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生cd譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同。 因此，根據(jù)所測(cè)得蛋白質(zhì) 或多肽的遠(yuǎn)紫外cd譜， 能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈 二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，從而揭 示蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。,2021/4/17,35,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,2. 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 傅立葉紅

14、外光譜法 原理：紅外光譜的形成是以分子的振動(dòng)為基礎(chǔ)，在生物大分子中，這些振動(dòng)（化學(xué)鍵的伸縮、扭曲、旋轉(zhuǎn)等）能定位到分子中特殊的鍵和基團(tuán)，有關(guān)的鍵和基團(tuán) 主要包括c=o，-cooh， coo-，o-h，s-h等。故可 以通過(guò)紅外光譜推知蛋白質(zhì) 的相關(guān)結(jié)構(gòu)信息。,2021/4/17,36,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,蛋白質(zhì)的各種二級(jí)結(jié)構(gòu)在紅外光譜酰胺i區(qū)的特征吸收。,3. 三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 x射線衍射法 原理：當(dāng)一束x射線照射到晶體上，首先被電子所散射，每個(gè)電子都是一個(gè)新的輻射波源，向空間輻射出與入射波同頻率的電磁波。由于這些散射波之間的干涉作用，使得空間某些方向上的波始終保持相互疊加，于是在這個(gè)方

15、向上可以觀測(cè)到衍射線，而另一些方向上的波則始終互相抵消，于是就沒(méi)有衍射線產(chǎn)生。x射線在晶體中的衍射現(xiàn)象，實(shí)質(zhì)上是大量的原子散射波互相干涉的結(jié)果。 晶體所產(chǎn)生的衍射花樣都反映出晶體內(nèi)部的原子分布規(guī)律。一個(gè)衍射花樣的特征，可以認(rèn)為由兩個(gè)方面的內(nèi)容組成： 衍射線在空間的分布規(guī)律，稱之為衍射幾何，衍射線的分布規(guī)律是晶胞的大小、形狀和位向決定。 衍射線束的強(qiáng)度，衍射線的強(qiáng)度則取決于原子的品種和它們?cè)诰О械奈恢谩?2021/4/17,37,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 三維電鏡重構(gòu)技術(shù) 原理：在電鏡下觀察生物大分子時(shí)，觀察的對(duì)象是三維結(jié)構(gòu)，電鏡圖像是這些三維結(jié)構(gòu)的二維投影。由生物結(jié)構(gòu)的二維

16、電鏡圖像推知其三維結(jié)構(gòu)的方法稱為三維電鏡方法。 優(yōu)點(diǎn)：可以直接獲得分子的形貌信息；適于解析那些難以結(jié)晶的膜蛋白，大分子復(fù)合體等；適于捕捉動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化信息；易同其他技術(shù)相結(jié)合得到分子復(fù)合體的高分辨率的結(jié)構(gòu)信息；電鏡圖像中包含相位信息，所以在相位確定上要比x射線晶體學(xué)直接和方便。 不足：由于生物樣品易受輻照損傷、圖像襯度低、信噪比低的特點(diǎn)，它對(duì)生物大分子的高分辨率結(jié)構(gòu)解析非常困難。,2021/4/17,38,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,三、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),1、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)概述 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的基本依據(jù)是： 每一段相鄰的氨基酸殘基具有形成一定二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向。 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)問(wèn)題是模式分類問(wèn)題

17、 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的目標(biāo)： 判斷每一段中心的殘基是否處于螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角（或其它狀態(tài)）之一的二級(jí)結(jié)構(gòu)態(tài)，即三態(tài)。,基本策略（1）相似序列相似結(jié)構(gòu),qlmgerirarrkklk,qlmgaerirarrkklk,結(jié)構(gòu)？,基本策略（2）分類分析,螺旋,提取樣本,聚類分析,學(xué)習(xí)分類規(guī)則,預(yù)測(cè).-gly-ala-glu-phe-.,二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法大體分為三代： 第一代是基于單個(gè)氨基酸殘基統(tǒng)計(jì)分析 從有限的數(shù)據(jù)集中提取各種殘基形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向，以此作為二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的依據(jù)。 第二代預(yù)測(cè)方法是基于氨基酸片段的統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)的對(duì)象是氨基酸片段 片段的長(zhǎng)度通常為11-21 片段體現(xiàn)了中心殘基所處的環(huán)境

18、在預(yù)測(cè)中心殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，以殘基在特定環(huán)境形成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向作為預(yù)測(cè)依據(jù),這些算法可以歸為幾類： （1）基于統(tǒng)計(jì)信息 （2）基于物理化學(xué)性質(zhì) （3）基于序列模式 （4）基于多層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) （5）基于多元統(tǒng)計(jì) （6）基于機(jī)器學(xué)習(xí)的專家規(guī)則 （7）最鄰近算法,第一代和第二代預(yù)測(cè)方法對(duì)三態(tài)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率都小于70%，而對(duì)折疊預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率僅為2848% 其主要原因是只利用局部信息 第三代方法（考慮多條序列） 運(yùn)用長(zhǎng)程信息和蛋白質(zhì)序列的進(jìn)化信息 準(zhǔn)確度有了比較大的提高,2、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法,經(jīng)驗(yàn)參數(shù)法 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成規(guī)律性比較強(qiáng) 三種基本二級(jí)結(jié)構(gòu)平均占氨基酸殘基的85% 各種二級(jí)結(jié)構(gòu)非均勻

19、地分布在蛋白質(zhì)中,螺旋的形成規(guī)律： 在一段序列中發(fā)現(xiàn)第i、i+3、i+4位（如1、4、5）是疏水殘基時(shí)，這一片段就被預(yù)測(cè)為螺旋； 當(dāng)發(fā)現(xiàn)第i、i+1、i+4位（如7，8，11）為疏水殘基時(shí)，這一片段也被預(yù)測(cè)為螺旋。,對(duì)于折疊的形成規(guī)律： 對(duì)于折疊，也存在著一些特征的親疏水殘基間隔模式，埋藏的折疊通常由連續(xù)的疏水殘基組成，一側(cè)暴露的折疊則通常具有親水-疏水的兩殘基重復(fù)模式。 原則上，通過(guò)在序列中搜尋特殊的親疏水殘基間隔模式，就可以預(yù)測(cè)螺旋和折疊。,點(diǎn)模式方法： 將20種氨基酸殘基分為親水、疏水以及兩性殘基三類 用八殘基片段表征親疏水間隔模式 以一個(gè)二進(jìn)制位代表一個(gè)殘基，疏水為1，親水為0，共八位。 這樣，八殘基片段的親疏水模式可用0255的數(shù)值來(lái)表示,螺旋的特征模式對(duì)應(yīng)的值為： 9，12，13，17，201，205，217，219，237。 折疊的特征模式： 由連續(xù)的1或交替的01構(gòu)成。,疏水性定量計(jì)算,(4)