MTT實(shí)驗(yàn)法測(cè)定細(xì)胞增殖1

1、mtt實(shí)驗(yàn)法測(cè)定細(xì)胞增殖1.實(shí)驗(yàn)材料 1.1. 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 癌細(xì)胞株用含有10%新生小牛滅活血清rpmi-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)在37、飽和濕度、5%co2的無(wú)菌培養(yǎng)箱中，每隔23天進(jìn)行一次細(xì)胞傳代。 1.2 藥物與試劑 rpmi-1640 培養(yǎng)基 dmso 胰蛋白酶粉 1-甲基乙內(nèi)酰脲 5-氟尿嘧啶 mtt 粉 甘油 碘化丙啶(pi) 新生小牛血清 1.3 儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)（sw-cj-2fd 型） 超低溫電冰箱 恒溫水浴箱 低溫高速離心機(jī) 恒溫震蕩搖動(dòng)床 -20電冰箱 光學(xué)顯微鏡 電子天平 eppendorf 移液槍?zhuān)?0、100、1000ul） 去離子純水儀 流式細(xì)胞儀 低溫?cái)?shù)控高速離

2、心機(jī) 普通離心機(jī) 1.4 主要試劑配方 1.4.1 pbs 溶液 磷酸二氫鉀(kh2po4)0.24g、氯化鈉(nacl)8.0g、磷酸氫二鈉（na2hpo4）1.44g、氯化鉀(kcl)0.2g，用去離子水(ddh2o)溶解，然后將其定容使總體積為 1.0l。再使用鹽酸將 ph 值調(diào)至 7.4，用無(wú)菌鹽水瓶分裝好，高壓消毒滅菌，4內(nèi)保存。臨用前要在 37水浴加熱。 1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)基 稱(chēng)取 ripm-1640 培養(yǎng)基粉 10.4g，用 1.0l ddh2o 溶解，再往溶液中加入 2g nahco3，再用鹽酸將 ph 值調(diào)整至 7.0，采用抽濾法除菌，無(wú)菌鹽水瓶分裝，置于 4冰箱中保存，使

3、用前往瓶中加入滅活新生小牛血清，使每瓶培養(yǎng)基中滅活新生小牛血清的濃度為 10%。每次臨用前要將含有 10%滅活新生小牛血清的rpmi-1640 培養(yǎng)基置于 37水浴箱中加熱。 1.4.3 新生小牛血清 臨用前，將新生小牛血清置于 56水浴中滅活 30min，之后用無(wú)菌鹽水瓶分裝密封，再置于-20冰箱中保存。 1.4.4 胰蛋白酶 在 100ml 的 pbs 溶液中加入胰蛋白酶粉 0.25g，置于 4冰箱中過(guò)夜，用直徑為 0.22m 微孔濾膜除菌器除菌后分裝、密封，置于 4冰箱中保存。 1.4.5 mtt 溶液(5mg/ml) 往 50ml 無(wú)菌 pbs 中加入 250mg mtt 粉，輕輕搖勻

4、，使 mtt 粉充分溶解，予用直徑為 0.22m 微孔濾膜除菌后分裝、密封，錫箔紙避光，置于 4冰箱中臨時(shí)保存（7 天），置于-20冰箱中短期保存（1 月）。 1.4.6 4%多聚甲醛 稱(chēng)取多聚甲醛 4g 溶于 50ml 蒸餾水中，然后加熱至 70左右，用玻璃棒攪拌溶液使多聚甲醛充分溶解，然后往溶液中逐滴加入濃度為 1mol/l 的 na0h 至溶液澄清，冷卻，蒸餾水定容至 100ml，用鹽酸將 ph 調(diào)至 7.2，錫箔紙避光，置于 4冰箱中保存。 1.4.7 蘇木精染液 蒸餾水 700ml，甘油 300ml，蘇木精 5g，碘酸鈉 0.5g，冰醋酸 20ml，硫酸鋁鉀 500g。 1.4.8

5、伊紅染液 蒸餾水 100ml，伊紅 0.5g，氯化鈣 0.5g。 1.4.9 1-甲基乙內(nèi)酰脲溶液的配制 1-甲基乙內(nèi)酰脲（m）分子式為 c4h6n2o2，分子量為 114.10，純度99.0%，吸取適量該藥物，加入少量 pbs 或生理鹽水（ph7.4），配制成 500 mgl-1的母液。-20保存，臨用時(shí)稀釋。 1.4.10 5-fu 溶液的配制 5- 氟尿嘧啶（ 5-fu ）分子量為 130.08 ，分子式為 c4h3fn2o2，規(guī)格為250mg/10ml，ph 值為 8.49.2，吸取適量該藥物，加入少量 pbs 或生理鹽水（ph7.4），配置成 100mgl的母液。-20保存，臨用時(shí)稀

6、釋。 2.實(shí)驗(yàn)方法. 2.1.細(xì)胞培養(yǎng)2.1.1.細(xì)胞復(fù)蘇 (1)從-80冰箱迅速取出凍存人結(jié)腸癌 sw480 細(xì)胞的凍存管，然后迅速投入37水浴箱中，輕輕搖動(dòng)凍存管，使凍存管內(nèi)容物迅速融化，取出后用 75%酒精消毒，放入無(wú)菌操作臺(tái)，在操作臺(tái)中開(kāi)啟凍存管。用 1000ul 的移液槍吸出溶解的細(xì)胞懸液，注入離心管，同時(shí)往離心管中加入 10 倍 10%滅活新生小牛血清rpmi-1640 培養(yǎng)基，準(zhǔn)備離心。 (2) 室溫下，1000 rpm，離心 5min，用移液槍吸取離心管中上清液、棄去，然后用細(xì)胞培養(yǎng)液洗 12 次，棄去上清培養(yǎng)液后，加入 1ml 培養(yǎng)液，用吹打管輕輕吹打，使離心管底部的細(xì)胞懸于

7、培養(yǎng)基中，形成懸浮液。 (3)用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋?xiě)腋∫汉?，用移液槍將?xì)胞懸液接種到 100ml 的無(wú)菌培養(yǎng)瓶，蓋好瓶蓋，將接種有人結(jié)腸癌 sw480 細(xì)胞的培養(yǎng)瓶放入飽和濕度、5%co2、溫度為 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h 后更換培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)基本恢復(fù)正常后，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2.1.2.細(xì)胞傳代 (1) 在普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶貼壁面生長(zhǎng)融合達(dá) 70%80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，然后用 pbs 液洗 12 遍。(2) (2)用 0.25%胰酶細(xì)胞消化液，于室溫或 37下消化鐵壁細(xì)胞數(shù)分鐘，邊消化邊在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞

8、的形態(tài)變化，當(dāng) 70%細(xì)胞的胞膜發(fā)生皺縮，細(xì)胞體積變小、細(xì)胞變圓時(shí)，往培養(yǎng)瓶中加入 10%滅活新生小牛血清的 rpmi-1640 培養(yǎng)基45ml，終止消化。 (3)用彎頭吸管反復(fù)吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)面，吹打時(shí)確保培養(yǎng)瓶底部各個(gè)部位都要吹打到，動(dòng)作輕柔，幅度不要太大，使貼壁細(xì)胞脫落形成細(xì)胞懸液。 (4)按實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞濃度接種，分成 23 個(gè)培養(yǎng)瓶，置于飽和濕度、5%co2、溫度為 37培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 2.1.3.細(xì)胞收集 (1) 在室溫或 37下，用 0.25%胰酶消化液消化貼壁細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。 (2)用移液槍將培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液移入 10ml 離心管，常溫下 1000r

9、pm，離心5min，棄去上清液，再加入 5ml pbs 洗滌 23 次。 2.1.4.細(xì)胞計(jì)數(shù) (1) 在室溫或者 37下，用胰酶消化液消化貼壁細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。 (2)取蓋玻片、計(jì)數(shù)載玻片各一塊，先用 pbs 清洗干凈，再用 75%酒精反復(fù)擦拭計(jì)數(shù)載玻片和蓋玻片，然后風(fēng)干，蓋上蓋玻片，用 10ul 移液槍吸取細(xì)胞懸液 5l 由蓋玻片一側(cè)緩慢的滴入計(jì)數(shù)載玻片中，使載玻片和蓋玻片之間均勻的充滿(mǎn)細(xì)胞懸液體。 (3)在用 10物鏡顯微鏡下，觀(guān)察計(jì)數(shù)載玻片上四角計(jì)數(shù)格內(nèi)所含細(xì)胞的總數(shù)x。計(jì)數(shù)原則：細(xì)胞壓中線(xiàn)時(shí)，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，細(xì)胞團(tuán)塊合計(jì)為一個(gè)細(xì)胞。 (4)將計(jì)數(shù)所得細(xì)胞總數(shù)代入公式，得出細(xì)

10、胞密度x/4104個(gè)/ml（細(xì)胞數(shù)/毫升原液）。 2.1.5.細(xì)胞凍存 (1)選擇對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞凍存，用濃度為 0.25%胰蛋白酶消化液把培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞消化下來(lái)，把已經(jīng)消化好的細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞傳代的方法收集起來(lái)，同時(shí)細(xì)胞計(jì)算，之后將收集的細(xì)胞加到離心管，1000rpm，離心 5min，去上清液。 (2)往離心管中加入凍存液，將細(xì)胞密度調(diào)整為(510)106個(gè)/ml。凍存液的配制：甘油、胎牛血清按體積比 1:9 的比例均勻混合。 (3) 將離心管中含有細(xì)胞的凍存液分裝到凍存管，每個(gè)凍存管加 11.5ml含細(xì)胞液， 在 4冰箱中放置 30 分鐘，轉(zhuǎn)入-20的冰箱中放置 2h 后，再放入-80冰箱

11、 24h，最后轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。 2.2 mtt 比色法檢測(cè) 1-甲基乙內(nèi)酰脲、5-fu 及兩者聯(lián)合對(duì) sw480 細(xì)胞增值的抑制作用 2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：分為四大組：對(duì)照組（等量pbs）、1-甲基乙內(nèi)酰脲組(m)、5-fu-、 甲基乙內(nèi)酰脲與5-氟尿嘧啶聯(lián)合組(mfu)。 2.2.2 1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì) sw480 細(xì)胞的增值抑制作用 根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和預(yù)實(shí)驗(yàn)，將 1-甲基乙內(nèi)酰脲組設(shè)八個(gè)濃度組：m0.5mgl-1、m5mgl-1、m10mgl-1、m20mgl-1、m50mgl-1、m100mgl-1、m200mgl-1、m500mgl-1。各組分別干預(yù)人結(jié)腸癌 sw480 細(xì)胞 24、48

12、、72h，mtt 法檢測(cè)1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì) sw480 細(xì)胞增殖抑制作用。 以上實(shí)驗(yàn)各組設(shè)置 6 個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，分析比較各組細(xì)胞增殖抑制率有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.2.3 檢測(cè) 1-甲基乙內(nèi)酰脲及 5-fu 分別對(duì) sw480 細(xì)胞增殖的抑制作用 根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將 1-甲基乙內(nèi)酰脲和 5-fu 各設(shè)四個(gè)濃度組。1-甲基乙內(nèi)酰脲為 m 10mgl-1、m20 mgl-1、m50mgl-1、m100mgl-1四個(gè)濃度，5-fu 為 fu 10mgl-1、fu20mgl-1、fu50mgl-1、fu100mgl-1四個(gè)濃度。1-甲基乙內(nèi)酰脲和 5-fu 各設(shè)的四個(gè)濃度組藥物濃度相同

13、，有利于兩者效果比較分析。根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇各組藥物干預(yù) 48 小時(shí)后，進(jìn)行 mtt 法檢測(cè) 1-甲基乙內(nèi)酰脲、5-fu 對(duì) sw480 細(xì)胞增殖抑制作用。 以上實(shí)驗(yàn)分組中各組設(shè)置 6 個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，分析比較各組細(xì)胞增殖抑制率有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.2.4 檢測(cè) 1-甲基乙內(nèi)酰脲與 5-fu 聯(lián)合應(yīng)用對(duì) sw480 細(xì)胞增殖的抑制作用 1-甲基乙內(nèi)酰脲與 5-fu 聯(lián)合用藥設(shè)四個(gè)組：m10mgl-1fu10mgl-1、m 20mgl-1fu 20mgl-1、m50mgl-1fu50mgl-1、m100mgl-1fu100mgl-1。各組分別干預(yù)人結(jié)腸癌 sw480 細(xì)胞

14、48h 后，mtt 法檢測(cè)各組對(duì) sw480 細(xì)胞增殖的抑制作用，并與單獨(dú)應(yīng)用 5-fu 作用效果進(jìn)行比較。以上實(shí)驗(yàn)分組中各組設(shè)置 6 個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，分析比較各組對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響，差異有無(wú)顯著性。2.2.5 mtt比色法基本原理噻唑藍(lán)(mtt)比色實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)研究中用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活的方法之一。mtt的基本原理為在活細(xì)胞線(xiàn)粒體中外源性的mtt能夠被細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原為一種紫藍(lán)色且難溶于水的結(jié)晶物甲瓚，甲瓚沉積在細(xì)胞胞質(zhì)中，但是死亡細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)此現(xiàn)象。當(dāng)甲瓚遇到二甲基亞砜(mdso)時(shí)，沉積在細(xì)胞中的甲瓚會(huì)被mdso溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm或570nm的波長(zhǎng)處

15、測(cè)定甲瓚光密度值(od值)，用來(lái)間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。形成mtt結(jié)晶物的量與活細(xì)胞的數(shù)量成正相關(guān)。 2.2.6 實(shí)驗(yàn)操作步驟 (1) 接種細(xì)胞：用 0.25%胰蛋白酶消化液消化貼壁的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含 10%新生小牛血清 rpmi-1640 培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞懸液內(nèi)細(xì)胞的濃度，使細(xì)胞懸液濃度為 3104個(gè)/ml，再將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞于 96 孔培養(yǎng)板中，一次接種 3 個(gè)培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板每孔加入上述細(xì)胞懸液 180l，每孔細(xì)胞 5200個(gè)。(2) 培養(yǎng)細(xì)胞：將接種好的培養(yǎng)板置入飽和濕度、37、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4h，待細(xì)胞貼壁后，用移液槍輕輕吸取培養(yǎng)板中的上清液、棄去。 (3)各組的藥物干預(yù)： 按照實(shí)驗(yàn)方案，各組藥物按方案濃度加入已接種 sw480 細(xì)胞的培養(yǎng)板中。于 37、5%co2、飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 (4)呈色：分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到研究方案確定的時(shí)間后，往 96 孔板每孔中加入 20l 5 mgl-1 mtt 溶液，繼續(xù)置于 37、5%